一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针及其试剂盒。本方法利用数字PCR检测平台，在一个PCR扩增体系中加入试剂盒中核苷酸序列如SEQ ID No：1～7所示的引物和探针，并将BCR‑ABL1融合基因与自对照同时扩增，即以待检基因自身作为对照，显著减少多引物多扩增所带来的信号干扰，无需标准品即可实现转录本拷贝数检测，在检测灵敏度达到0.001％的同时，检测的精密度提高了3倍以上。

说明书

技术领域

本发明属于医学核酸检测技术领域，具体涉及一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

微小残留(Minimal Residual Disease，MRD)白血病是指白血病患者按目前的疗效标准经过治疗取得完全缓解(Complete Remission，CR)后体内残存微量白血病细胞的状态。随着医学水平的发展以及各种新药的出现，白血病的完全缓解率得到了很大改善，但仍有相当一部分病人在CR后出现复发，生存期缩短，最终导致死亡。其中最主要的原因是骨髓中MRD的持续存在。据研究表明，若MRD的数量在治疗后第12周还在10^-4以上时，急性白血病复发的可能性就非常大，就必须进行缓解后的巩固及强化治疗来降低临床复发风险及复发率。因此，MRD可作为预后评价的敏感指标，MRD如果小于10^-4，复发可能性小，大于10^-4则提示疾病复发可能性极大，且MRD值越小无复发生存期则越长。目前，临床判断白血病患者是否复发的主要指标可分为两类：一是临床症状，如患者年龄、性别、白细胞数、中枢神经系统白血病的发生、首次完全缓解所需时间，但是骨髓细胞形态学检查敏感度低，难以准确反映CR时患者体内残留的白血病细胞数；二是白血病细胞的生物学特性，如细胞的遗传学、免疫学等，这两类指标虽对预后复发判断有很大的帮助，但均属间接分析。MRD的诊断必须依赖敏感度更高、特异性更强的特殊检测手段。经典的MRD检测手段包括流式细胞术(FCM)、染色体核型分析、FISH检测和实时荧光定量PCR>

白血病与相关基因变异的关系，以其中常见的慢性粒细胞白血病(CML)检测为例，>95％CML 的病例皆因BCR-ABL基因产生融合后翻译出新的蛋白质而导致细胞的恶性转化，同时也因为BCR-ABL 基因水平检测简单准确、意义明确而被采用作为MRD的检测指标，此外该检测仅需进行血液检测，无需骨髓活检。国际临床试验结论以及CML治疗指南的制定也均来自于BCR-ABL IS数据，BCR-ABL融合基因检测对于前期CML疾病辅助诊断及后续靶向用药指导及残留病监测方面亦具有重要的临床意义。目前临床上检查BCR-ABL融合基因的金标准是荧光定量PCR技术，按照目前的实践指南，患者每三个月要进行一次检测，结果以％IS单位报告，但一是由于qPCR技术的定量检测依赖标准的参考物质；二是由于 qPCR技术的局限性导致检测灵敏度不够高，使RT-PCR在LoD和LoQ方面具有局限性，使其检测灵敏度一般为0.01％IS(MR4.0)，即在10000个正常细胞中可以检出1个白血病细胞，而MRD有效的监测和治疗检测灵敏度需要达到0.002％IS(MR4.7)以下。因此，RT-PCR所具备的0.01％IS(MR4.0)的检测灵敏度就会影响对CML患者临床治疗方案的制定，如果可以更早在正常细胞中检测出白血病细胞，即找到比 qPCR灵敏度更高的检测方法，即达到0.001％IS(MR5.0)甚至更低的MRD检测技术，那么就会更早发现白血病复发的状况，为患者更早提供治疗方案，大大延长患者的生存期，但是目前针对这种0.001％IS (MR5.0)以及更低检测灵敏度并且检测重复性好的MRD检测技术在国内还处于空白状态。

发明内容

本发明的目的在于克服现有RT-PCR，寻求设计一种微小残留病的检测试剂盒，建立一种新的超灵敏、检测重复性好的微小残留病检测试剂盒。本方法无需建立标准曲线以及内参即可实现靶基因结构变异丰度检测，在简单准确判定微残病的同时，还可以检测相关变异基因的拷贝数以及发生频率并且可以将检测灵敏度达到0.001％IS。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针，其核苷酸序列如SEQ IDNo：1～7所示。

其中：

(1)用于检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因的引物和探针为：由SEQ ID No：1所示的正向引物BCR-F1，由SEQ ID No：5所示的反向引物ABL1-R，由SEQ ID No：6所示的探针P2，其中 SEQ ID No：6所示的核苷酸序列的5'端有FAM标记，3'端有BHQ-MGB标记；

(2)用于检测BCR-ABL1(e1a2)融合基因的引物和探针为：由SEQ ID No：2所示的正向引物 BCR-F2，由SEQ ID No：5所示的反向引物ABL1-R，由SEQ ID No：6所示的探针P2，其中SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5'端有FAM标记，3'端有BHQ-MGB标记；

(3)用于检测BCR-ABL1(e19a2)融合基因的引物和探针为：由SEQ ID No：3所示的正向引物BCR-F3，由SEQ ID No：5所示的反向引物ABL1-R，由SEQ ID No：6所示的探针P2，其中SEQ ID No： 6所示的核苷酸序列的5'端有FAM标记，3'端有BHQ-MGB标记；

(4)用于检测ABL1自对照基因的引物和探针为：由SEQ ID No：4所示的正向引物ABL1-F，由SEQ ID No：5所示的反向引物ABL1-R，由SEQ ID No：7所示的探针P1，其中SEQ IDNo：7所示的核苷酸序列的5'端有HEX标记，3'端有BHQ-MGB标记；

一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针的试剂盒，包括核酸扩增试剂，所述的核酸扩增试剂包括：

(1)检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2)融合基因和BCR-ABL1 (e19a2)融合基因的数字PCR反应液，组份中的主要成份为正向引物BCR-F1、BCR-F2、BCR-F3、ABL1-F，反向引物ABL1-R，探针P1、P2以及ddH₂O。

(2)数字PCR预混液，组份中的主要成份为qScriptTMXLT One-Step RT-qPCRTough Mix，荧光素钠盐，以及ddH₂O。

其中，试剂盒的内参为自对照ABL1基因为：由SEQ ID No：4所示的正向引物ABL1-F，由SEQ ID No：5所示的反向引物ABL1-R，由SEQ ID No：7所示的探针P1，其中SEQ ID No：7所示的核苷酸序列的5'端有HEX标记，3'端有BHQ-MGB标记。

进一步优选的，试剂盒还包括质控品，所述质控品有阴性质控品和阳性质控品组成，所述的阴性质控品为ddH₂O，所述的阳性质控品为质粒DNA混合液。

进一步优选的，试剂盒中用于检测BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2) 融合基因和BCR-ABL1(e19a2)融合基因的数字PCR反应液中含有：10μmol/L的SEQID No：1～5各1μL； 10μmol/L的SEQ ID No：6～7各0.5μL。

进一步优选的，试剂盒的具体组成参见表1。

表1试剂盒的组成

进一步优选的，微小残留白血病阳性质控品中含有5种质粒的混合液，所述质粒DNA为： BCR-ABL1-e13a2质粒DNA、BCR-ABL1-e14a2质粒DNA、BCR-ABL1-e1a2质粒DNA、BCR-ABL1-e19a2 质粒DNA、ABL1自对照质粒DNA。

下面对本发明的内容做进一步的解释和说明：

本发明首先对试剂盒进行了原理正确性、可行性、准确度以及精确度的验证。通过验证确定了最优的PCR扩增体系，在简单和复杂样本中均可最大程度地对微小残留白血病地转录本进行检测。

本发明的试剂盒主要可以对慢髓白血病进行复发监测：大部分白血病患者按目前的疗效标准经过治疗可以缓解，但是仍有相当一部分病人由于MRD的存在，面临复发的危险最终导致死亡。目前，RT-PCR 的检测灵敏度为0.01％IS(MR4.0)，本发明试剂盒是比qPCR检测灵敏度更高的试剂盒，可以更早在正常细胞中检测出白血病细胞，即0.001％IS(MR5.0)MRD检测技术，会更早发现白血病复发的状况，为患者更早提供治疗方案，大大延长患者的生存期。

本发明的试剂盒中包括BCR-ABL1-e13a2、BCR-ABL1-e14a2、BCR-ABL1-e1a2、BCR-ABL1-e19a2、共4种阳性质粒的准确性质控品样本，其阳性符合率为100％。

本发明的试剂盒中还包括ABL1自对照质粒，无需建立标准曲线以及内参即可实现靶基因结构变异丰度检测，在简单准确判定微残病的同时，还可以检测相关变异基因的拷贝数以及发生频率。

具体的：本发明的试剂盒中：

1、检测BCR-ABL1-e13a2(P210)和BCR-ABL1-e14a2(P210)融合基因的引物和探针序列参见表2。

表2检测BCR-ABL1-e13a2(P210)和BCR-ABL1-e14a2(P210)融合基因的引物和探针序列

2、检测BCR-ABL1-e1a2(P190)融合基因的引物和探针序列参见表3。

表3检测BCR-ABL1-e1a2(P190)融合基因的引物和探针序列

3、检测BCR-ABL1-e19a2(P230)融合基因的引物和探针序列参见表4。

表4检测BCR-ABL1-e19a2(P230)融合基因的引物和探针序列

4、检测自对照ABL1的引物和探针序列参见表5。

表5检测自对照ABL1的引物和探针序列

本发明的试剂盒能从抗凝血液种提取的RNA转录cDNA中检测相关融合基因，最低检出量达到0.14拷贝/μL。

本发明的试剂盒对各精密度质控品在相应的反应液中重复做3次均能检出，且CV值均大大低于使用非自对照作为内参的试剂盒检测结果。

本发明的试剂盒中BCR-ABL1(e13a2或e14a2)融合基因和BCR-ABL1(e1a2)融合基因和 BCR-ABL1(e19a2)融合基因与ABL1自对照共用一条反向引物，本质上是一个使用双重探针对BCR-ABL1 融合基因进行检验的过程，因此大大提高了检测的特异性、精密度和准确度。本发明首先只需一条共用反向引物ABL1-R与BCR-ABL1融合基因的正向引物F1至F3组合就可以实现对多种BCR-ABL1融合基因和ABL1自对照基因同时扩增，并以ABL1自对照为参考进行数据分析，替代了现有技术中需要使用不同的引物对正常基因组进行另外扩增来作为参考，从而避免了多引物存在下的相互干扰或者由此引起的不可避免的非特异性扩增所导致的重复性差、背景信号强等问题；其检测过程简单方便、精密度、准确度和特异性高，得以保证检测结果的正确性，并可直接得到结构变异基因组拷贝数、正常基因组拷贝数以及基因组结构变异发生频率等结果。

附图说明

图1为本发明涉及的试剂盒的基本原理示意图。以ABL1基因的四种融合类型为例，当ABL1基因分别与BCR基因的某些外显子发生融合，则针对多种BCR-ABL1融合基因类型分别设计正向引物F1、 F2、F3，并共用反向引物ABL1-R进行扩增，并使用分子探针P2(如使用FAM蓝色信号标记)产生荧光信号；自对照ABL1基因使用正向引物ABL1-F、共用反向引物ABL1-R和分子探针P1(如使用HEX绿色荧光信号标记)产生荧光信号。

图2为本发明涉及的实施例1中使用本发明试剂盒对样本进行BCR-ABL1融合基因检测的荧光信号图(Blue+Green)。

图3为本发明涉及的实施例2中BCR-ABL1(e13a2-P210和e14a2-P210)梯度稀释后数字PCR 检测结果。图3A为检测NTC以及e13a2和e14a2的混合液分别为10％，1％，0.1％，0.032％，0.01％，0.0032％， 0.002％，0.001％八个梯度(FAM通道)；图3B为总ABL1表达量(HEX通道)；

图4为本发明涉及的实施例2中的检测结果与预期结果的相关性分析。

具体实施方式

为了便于更加清晰地解释本发明，下面将通过具体实施方式结合附图对本发明所述的技术方案进行更具体的全面描述。本发明可以应用于多种不同基因检测而不限于本文所描述的实施例，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件所述进行。

实施例1：

1、试剂盒的组成参见表6。

表6试剂盒的组成

其中，数字PCR反应液中含有：1μL 10μmol/L BCR-F1，1μL 10μmol/L BCR-F2，1μL10μmol/L BCR-F3，1μL 10μmol/L ABL1-F，1μL 10μmol/L ABL1-R，0.5μL 10μmol/L BCR-ABL1-P2，0.5μL 10μmol/L ABL1-P1；

数字PCR预混液中含有：2×qScript^TMXLT>

阳性质控品中含有表7中5种质粒混合液。

表7阳性质控品中的5种质粒混合液

质粒名称质粒浓度体积(μL)BCR-ABL1-e13a2-P210质粒DNA1ng/μL50BCR-ABL1-e14a2-P210质粒DNA1ng/μL50BCR-ABL1-e1a2-P190质粒DNA1ng/μL50BCR-ABL1-e19a2-P230质粒DNA1ng/μL50ABL1自对照质粒DNA1ng/μL50

2、使用方法：

2.1.仪器：适用于Naica^TM>

2.2.样本：

本发明的试剂盒适用于抗凝血液及抗凝骨髓样本。

样本保存：所取样本保存于适用于保存RNA的采血管中备用。

RNA提取要求：采用Biomiga Blood RNA miniprep kit(Cat#R6411)试剂盒提取样本中的mRNA, 具体的操作参见试剂盒产品说明书，提取后的RNA建议立即进行检测，否则于-80℃保存备用。

样本要求：样本所提取的RNA需经过使用内参的质量检测后方可使用。

2.3检验方法

2.3.1样本处理

采用Biomiga Blood RNA miniprep kit(Cat#R6411)试剂盒提取样本中的mRNA,具体的操作参见试剂盒产品说明书。

2.3.2样本浓度确定：将上述提取好RNA的样本，使用Qubit4.0进行浓度测定。

2.3.3扩增试剂准备：

从试剂盒中取出各种数字PCR反应液及数字PCR预混液，室温融化并振荡均匀后，短暂离心数秒，各数字PCR反应体系每个反应按照表8进行配制。

表8数字PCR反应体系

试剂组分加入体积(μL)qScript^TMXLT>12.5荧光素钠盐2.5数字PCR反应液7RNA模板(同时做阴性质控品和阳性质控品各1个)3总计25

2.3.4加样及扩增：

取出芯片，轻轻旋转白盖1/4圈并丢弃白盖，移取上述步骤(1)中的25μL反应液加入到芯片孔井中并盖上白色长盖。

将加入25μL数字PCR反应液的芯片放入Naica^TM>

表9、数字PCR反应程序

3、检测：

3.1信息采集：数字PCR扩增结束后，将芯片放置于Naica^TM>

3.2结果判定：

如图2中显示，使用Crystal Miner进行结果判定，通过检测FAM(Blue)和HEX(Green)的荧光信号得出样本中BCR-ABL1融合基因拷贝数、ABL1总拷贝数以及融合基因所占的比率。位于第I象限的FAM+HEX(Blue+Green)双荧光信号代表BCR-ABL1融合基因的荧光信号；位于第II象限的HEX(Green) 单荧光信号代表正常基因的荧光信号，即ABL1自对照基因的荧光信号值(Green单荧光信号值的总和) 减去BCR-ABL1融合基因的荧光信号值(Blue+Green双荧光信号值)；位于第III象限无任何荧光信号代表无扩增状态的荧光信号本底值；位于第IV象限的FAM(Blue)单荧光信号代表非特异性扩增或试剂污染所产生的荧光信号，在正常无非特异性扩增及无污染的情况下，该区域应该是没有荧光信号的。综上所述，我们可清晰直接地确定4种BCR-ABL1融合基因、正常基因的含量及4种BCR-ABL1融合基因所占的比例。

实施例2：

本发明所述试剂盒对BCR-ABL1融合基因检测的灵敏度分析

(1)以BCR-ABL1(e13a2，e14a2)融合基因为例，将含有BCR-ABL1融合基因的两种最初浓度约为100ng/μL的e13a2，e14a2两种质粒进行混合，将e13a2/e14a2混合质粒与含有ABL1的质粒分别按照10^-1～10^-10进行梯度稀释；

(2)将上述e13a2/e14a2与ABL1质粒进行混合，得到e13a2/e14a2占总ABL1比例分别为10％， 1％，0.1％，0.032％，0.01％，0.0032％，0.002％，0.001％的8种质粒混合液，并分别对应为国际统一名称 MR1，MR2，MR3，MR3.5，MR4，MR4.5，MR4.7，MR5(表10)。

表10BCR-ABL1融合基因质粒混合液种类及名称

e13a2/e14a2与总ABL1比例10％1％0.1％0.032％0.01％0.0032％0.002％0.001％名称MR1MR2MR3MR3.5MR4MR4.5MR4.7MR5

(3)将MR1，MR2，MR3，MR3.5，MR4，MR4.5，MR4.7，MR5采用实施例1中的试剂盒和检测方法进行数字PCR检测并根据检测结果(图3)计算融合基因的比率，统计预期值和实际测量值并进行相关性函数的计算(表11)。检测结果显示，检测比例的最低值为0.001％，即MR5，并且在0.001％至 10％检测范围内，决定系数R²为0.99(图4)。

表11MR1，MR2，MR3，MR3.5，MR4，MR4.5，MR4.7，MR5样本的数字PCR检测结果

为了进一步确定本试剂盒对低浓度融合基因检测的稳定性，再次选取接近检测最低限的MR4， MR4.7，MR5三个低浓度(分别是BCR-ABL1-e13a2/e14a2占到ABL1的比例为0.01％，0.002％，0.001％) 进行了三次重复检测并计算了变异系数(CV，Coefficient ofVariation)。检测结果表明，MR4的CV为11.59％， MR4.7的CV为13.15％，MR5的CV为3.53％(表12)。

表12BCR-ABL1融合基因的MR4，MR4.7，MR5三梯度检测结果汇总

实施例3：

取8个慢性髓系白血病样本，采用实施例1中的试剂盒和检测方法进行检测，检测结果如表13 所示；

表13 8个慢性髓系白血病样本采用实施例1中的试剂盒和检测方法的检测结果

本发明的检测结果与确诊结果一致。之后随机抽取上述8个慢性髓系白血病样本中的5个样本，并分别采用本试剂盒(表14)和非自对照方法试剂盒(表15)对BCR-ABL1融合基因进行三次重复检测。

表14 5个样本采用本试剂盒对BCR-ABL1融合基因进行三次重复检测结果

表15 5个样本采用非自对照方法试剂盒对BCR-ABL1融合基因进行三次重复检测结果

表14和表15的结果显示，在同样样本的重复性检测中，本申请所述的试剂盒(表14)对于 BCR-ABL1融合基因检测方法的重复性(CV值低)显著优于目前常用的试剂盒(表15)检测方法的重复性(CV值高)，说明本申请所述的试剂盒对BCR-ABL1基因融合检测方法的重复性好，并且精密度提高3 倍以上(平均CV值相比较)。

综上所述，本申请所述试剂盒对BCR-ABL1融合基因检测灵敏度达到0.001％的同时，检测的精密度提高了3倍以上。

序列表

<110> 艾普拜生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcattccg ctgaccatc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtctgagtga agccgctcg 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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