一种小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166及其编码基因和应用。一种小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码该小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋TaMAG1166的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166编码基因转入小麦中,可以提高小麦的赤霉病抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因,因此,该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性,可在作物育种中应用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白 TaMAG1166及其编码基因和应用。

背景技术

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)引起的一种世 界范围内的病害。该病害导致小麦产量大幅度降低并严重影响小麦的品质。虽然 可以通过生物防治和化学防治的方法来控制该病害，但利用生物技术来培育抗赤 霉病品种才是最经济有效的方法。

水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白(Hydroxycinnamoyl CoA  quinatetransferase,HQT)，能够控制主要酚类复合物如木质素及绿原酸等的 生物合成和流转(Hoffmann et al.(2003)。绿原酸是在植物苯丙烷类代谢过 程中，咖啡酸和奎尼酸脂化而产生的酚类化合物，其大量积聚能够提高酚化物的 水平，在植物中扮演抗氧化剂的角色。绿原酸对病原真菌，病毒都有毒性，可以 抑制多种病原菌的繁殖。木质素是苯丙氨酸衍生的芳香族亚基聚合体，木质素的 大量合成可以引起细胞木质化程度的提高，阻止大分子物质的入侵，因此，在植 物中，木质素的存在可以作为微生物侵袭的阻障，增强植物细胞壁抗真菌穿透的 能力。本发明的TaMAG1166蛋白是来源于小麦的水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白， 在本发明提出之前，关于水解羟基肉桂酰辅酶A酯类相关蛋白及其编码基因在小 麦抗赤霉病方面的应用目前尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦水解羟基肉桂酰 辅酶A酯类蛋白TaMAG1166。

本发明的另一目的是提供该小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白 TaMAG1166的编码基因。

本发明的又一目的是提供编码基因的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166，氨基酸序列如SEQ ID  NO:2所示。该蛋白包含443个氨基酸,等电点为6.51。

所述的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166编码基因。

所述的权利要求1所述的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166 编码基因,优选核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

含有小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166编码基因的重组表达 载体。

所述的重组表达载体,优选出发载体为任何一种可以引导外源基因在植物 中超量表达的载体。

所述的重组表达载体,进一步优选将所述的含小麦水解羟基肉桂酰辅酶A 酯类蛋白TaMAG1166编码基因插入PBI121表达载体XbaI酶切位点所得。

含有本发明所述基因的微生物细胞。

本发明所述的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166在品种改良 中的应用；优选所述的基因在提高小麦抗赤霉病中的应用。

本发明所述的重组表达载体在品种改良中的应用；优选在提高小麦抗赤霉 病中的应用。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提 供的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白基因TaMAG1166导入植物细胞,可获得 改变植物赤霉病抗性的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物或转 基因植物细胞进行筛选,可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因(如:潮霉 素、卡那霉素和庆大霉素)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在 转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长,有助于 快速和有效的获得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启 动子和外源基因之间加入报告基因(GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因)， 构建报告基因和外源基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察 报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内表达情况。为了转 基因植物释放的安全性，也可以构建载体时不携带任何筛选标记基因，而在苗期 进行PCR检测。含有本发明的TaMAG1166表达载体可通过使用基因枪法、农杆菌 介导法、花粉管通道,电击,显微注射,Ti质粒,Ri质粒或植物病毒等常规生物学 方法转化植物细胞或组织,并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的 植株材料既可以是双子叶植物,也可以是单子叶植物,如:水稻、棉花、小麦、大 豆、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。

有益效果：

本发明提供了一种新的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯类蛋白TaMAG1166及 其编码基因。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦水解羟基肉桂酰辅酶A酯 类蛋白TaMAG1166编码基因转入小麦中,可以提高小麦的赤霉病抗性。由于该基 因是粮食作物小麦本身存在的内源基因,因此,该基因的超量表达不会影响植物 的食品安全性,可在作物育种中应用。

附图说明

图1转基因小麦的PCR检测。

其中B、C为不同的转基因株系，扬麦158表示进行转基因实验时的受体材料，为 进行小麦遗传转化的常用基因型,阳性对照为携带有小麦水解羟基肉桂酰辅酶A 酯类蛋白TaMAG1166编码基因的表达载体。

图2转基因小麦的赤霉病抗性的离体叶片鉴定

其中A为转基因实验受体材料扬麦158的叶片，B为携带有小麦水解羟基肉桂酰辅 酶A酯类蛋白TaMAG1166基因植株的叶片。

具体实施方式

根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理 解,实施例所描述的仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详 细描述的本发明。

实施例1：TaMAG1166蛋白的获得。

在抗赤霉病材料望水白开花期，将赤霉菌孢子液用喷雾器喷洒到穗部，所 用孢子液为江苏省范围内强致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子 混合液，接种后立即将穗子套上塑料袋，保持湿度，以保证赤霉菌发病。在接种 后6小时、12小时和24小时后分别取麦穗，同时用水接种做为对照，取材后立 即用液氮冷冻。取700mg冻存的麦穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加 入5mL 10％三氯醋酸/丙酮振荡混匀、-20℃沉淀1小时；4℃15,000g离心15min， 沉淀重新悬浮于5mL冷丙酮中，-20℃放置2小时；4℃15,000g离心15min，沉 淀悬浮于80％的冷丙酮中，-20℃放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按 每mg干粉加入10μL裂解液(7M脲，2M硫脲，4％CHAPS，1％CA，0.3％蛋白酶 抑制剂，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4℃搅拌抽提15min后加入14mM 的DTT；4℃再搅拌20min，然后35,000g离心10min，上清即为蛋白抽提液。将 蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS-PAGE电泳。电泳缓冲液用 Tris-Glycine-SDS缓冲液，温度设为17℃；先用2.5W/胶预电泳30min后，再用 5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后，取下凝胶进行银染。分析 在侵染后各时间点的丰度与对照相比均超过4倍的蛋白点，取一个分子量为 40.27千道尔顿，等电点为6.51的蛋白点即为TaMAG1166蛋白。该序列编码447 个氨基酸，如SEQ ID NO:2所示.

实施例2：编码TaMAG1166蛋白的cDNA序列的获得。

用英俊公司的Trizol试剂盒提取抗病小麦种质望水白穗部的总RNA，采用 Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。以cDNA作为模板， P1-F：5'-GAGGAACTATGCTTCAACCCGC-3'(SEQIDNO.3)和P1-R:5'- TTCGCCCATCCAAAGTCTGG-3'(SEQ ID NO.4)为引物，进行PCR扩增，扩增体系为25 μL,包括5ng模板,P1引物各5pmol,dATP,dTTP,dCTP和dGTP各5nmol,37.3nmol  MgCl₂,0.5单位的DNA聚合酶,1x PCR缓冲液。扩增的程序是:94℃变性3分钟；30 个循环,94℃变性20秒,58℃退火30秒,72℃延伸1分钟；最后72℃延伸5分钟。通过 PCR扩增,获得了包含开放读码框的1341bp的核苷酸序列,将该核苷酸与T-载体 在16℃连接30min,连接体系为10μL，包括T-载体1μL，PCR产物4μL，连接酶1 μL，连接酶缓冲液1μL，ddH2O 3μL。连接产物通过42℃热击40秒，转化到大 肠杆菌细胞中，送至华大基因公司测序，所得序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例3：转TaMAG1166基因小麦的赤霉病抗性得到提高

以望水白开花期的穗部cDNA作为模板,利用引物P2进行PCR扩增,P2引物对 如下:P2-F：5'-AGTCTCTAGATTATTTGCCGACATGTCCTTGG-3'(SEQ ID NO.5)； P2-R:5'-ATATTCTAGACCCAAACATCAATCTCCTTCTCG-3'(SEQ ID NO.6)。将扩增得到 的PCR产物用限制性内切酶XbaI进行酶切后,与经过同样限制性内切酶进行酶切 的PBI121表达载体进行连接,获得由CaMV35S启动子启动的TaMAG1166超量表达 的质粒载体。构建好的载体通过热击法转化到DH5α大肠杆菌菌株中,通过含有 50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选,获得阳性克隆。参照1993年Weeks 发表在Plant Physiol第102期1077‐1084页上的文章中的材料与方法,以幼胚 短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体,采用基因枪法 将Ubiqutin启动子控制下的TaMAG1166基因导入小麦材料扬麦158中,将基因枪 转化后的愈伤放置于含有30mg/L G418的1/2MS培养基上进行筛选,剪取获得的 再生苗叶片,提取DNA进行PCR检测,获得TaMAG1166超量表达的转基因小麦(图 1)。鉴定T3代转基因小麦和非转基因小麦赤霉病抗性。结果表明，以未进行转 化的小麦材料扬麦158为对照,转基因植株赤霉病抗性得到提高(表1)。离体鉴 定：利用返青至拔节期的T3代转基因小麦叶片和非转基因叶片接种F. grminearum，接种方法和抗病能力评价方法参照(Chen et al.2009)。在接种点 接种6μl浓度为每毫升1×10⁶个赤霉菌分生孢子的菌液，所用的孢子液为F15， F609，F7136及F.grminearum tri5-GFP菌株的分生孢子混合物。接种5天后观 察赤霉菌菌丝的侵染情况。结果表明，转基因植株对赤霉菌的抗性增强，叶片上 赤霉菌菌丝生长变慢(图2)。

表1