日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法及用途

摘要

本发明公开了一种日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法及用途，包括重组表达质粒的构建与鉴定、设计引物，在引物两端加入限制性酶切位点及保护碱基、？pMD19-T-？SjP40为模板进行PCR构建pET-28a-SjP40？重组质粒、重组蛋白的表达及纯化等步骤。并提供了日本血吸虫P40蛋白在制备抑制LX-2细胞中αα-SMA以及I型胶原在蛋白水平的表达的制剂中的应用、在制备抑制由TGF-β1诱导的LX-2细胞的活化的制剂中的应用。本发明方法简便、易操作，并提供了日本血吸虫P40蛋白的新用途。

说明书

技术领域

本发明涉及一种日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法。

背景技术

现有技术中对日本血吸虫虫卵抗原SjP40的表达纯化方法相对复杂，而且日本血吸虫SjP40蛋白（中国大陆株P40蛋白）的用途没有得到有效开拓，是本领域长期以来一直研究的课题。

血吸虫病肝纤维化由血吸虫感染所引起，主要表现为以虫卵为中心的炎性肉芽肿形成以及肝纤维化。宿主肝脏中虫卵肉芽肿的形成以及肝纤维化的发生发展，最终将引起宿主出现门脉高压综合征，并发上消化道出血以及肝昏迷，最终导致宿主死亡。与其他诱因导致的肝纤维化一样，血吸虫病肝纤维化的关键环节为肝星状细胞的活化。活化的肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及I型胶原等表达上调，ECM降解受抑，从而逐渐形成肝纤维化。传统观念认为，血吸虫肝纤维化的发生和发展与血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）密切相关，在血吸虫病肝纤维化进程中，SEA能够通过各种途径参与肉芽肿的形成，促进肝纤维化的发生和发展。然而，近年来有研究表明曼氏血吸虫虫卵与肝星状细胞株共同培养时，虫卵能够抑制肝星状细胞中α-SMA以及Ⅰ型胶原等的表达。该实验室研究者进一步利用日本血吸虫虫卵与肝星状细胞株LX-2共培养，同样发现日本血吸虫虫卵可以抑制LX-2细胞中α-SMA以及Ⅰ型胶原等的表达。本实验室前期的研究中则发现，利用SEA刺激不同状态的活化的肝星状细胞（LX-2细胞株、TGF-β1活化的原代培养肝星状细胞、日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型分离培养的肝星状细胞），均能抑制α-SMA的表达，主要与TGF-β信号通路相关。然而，SEA作为一种混合蛋白，其组分蛋白尤其P40蛋白对肝星状细胞的作用如何，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、易操作的日本血吸虫SjP40蛋白 (中国大陆株P40蛋白) 的表达纯化方法。

本发明的目的还在于提供一种日本血吸虫SjP40蛋白的新用途。

本发明的技术解决方案是：

一种日本血吸虫SjP40蛋白的表达纯化方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）重组表达质粒的构建与鉴定

Trizol 提取日本血吸虫虫卵总RNA：采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, 以Oligo ( dT ) 18 为模板将mRNA 逆转录为cDNA ；根据 Genebank 数据库中日本血吸虫SjP40序列, 利用primer 5.0 软件设计SjP40 基因上游引物和下游引物, SjP40 上游引物：5’-GAAATTCGGTGTCGATAAAGC-3’；SjP40下游引物:5’- CACAAGTGAATATCATCATTACCAT-3’；以 cDNA为模板，PCR 扩增SjP40 基因；PCR 反应条件: ：94℃ 预变性3min；94℃ 变性30s，60℃ 退火30s，72℃ 延伸 2min，扩增 30个循环；72℃ 继续延伸10min；PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒纯化；将PCR产物连入pMD19-T载体，连接产物转化入感受态细菌E.coli. DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序，测序比对正确的质粒命名为pMD19-T- SjP40；

（2）设计引物，在引物两端加入限制性酶切位点及保护碱基，引入酶切位点以下划线表示；上游引物:5’- GGAATTCCATATGATGTCGGGTACACATCAAAACCATG-3’（NdeⅠ）;下游引物：5’-CCCAAGCTTTAATGAGCGATTTCGTGTTGCTTCA-3’(HindⅢ).以 pMD19-T- SjP40为模板进行PCR，PCR 反应条件: 94℃ 预变性3min；94℃ 变性20s，60 ℃ 退火30s，72℃ 延伸 1min，扩增 35个循环；72℃ 继续延伸5min；PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒纯化；胶回收产物与pET-28a（+）质粒分别用NdeⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切, 胶回收试剂盒纯化后, 用T4 DNA 连接酶连接, 构建pET-28a-SjP40 重组质粒。重组质粒经PCR 和双酶切验证后, 进行测序；

（3）重组蛋白的表达及纯化

将重组表达质粒转化至感受态菌E.coli.BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，37℃ 培养过夜；将菌液以1:100接种于含卡那霉素的液体LB培养基，37℃，200rpm培养至OD值为0.4~0.6时，分别取出1ml 未诱导的菌液作为对照，其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG) 诱导蛋白的表达，收集菌体，通过SDS-PAGE电泳分析，鉴定重组蛋白的表达；经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化，最终确定诱导表达条件为： 0.1mM的 IPTG，30℃诱导8h，大量诱导表达后，收集上清，经Ni-NTA柱纯化后，透析膜透析，最终使蛋白溶于PBS中，并进行去内毒素处理。一种日本血吸虫SjP40蛋白在制备抑制LX-2细胞中α-SMA以及I型胶原在蛋白水平的表达的制剂中的应用。

一种日本血吸虫蛋白SjP40在制备抑制由TGF-β1诱导的LX-2细胞的活化的制剂中的应用。

本发明方法简便、易操作，并提供了日本血吸虫SjP40蛋白的新用途。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是SjP40 PCR产物图（以虫卵cDNA为模板）。

图2是pET-28a-SjP40重组质粒鉴定示意图。

图3是rSjP40蛋白原核表达示意图。

图4是rSjP40原核表达蛋白鉴定（western blot）示意图。

图5是rSjP40原核表达蛋白对LX-2细胞活化的影响示意图。

图6是rSjP40原核表达蛋白对TGF-β1诱导的LX-2细胞活化的影响示意图。

图1中：M：DL2000 DNA marker  1：SjP40 PCR产物。

图2中：M1：λHind Ⅲ DNA ladder marker  1：pET-28a（+）质粒 2：pET-28a-SjP40重组质粒 3：pET-28a-SjP40重组质粒经Hind Ⅲ内切酶单酶切产物 4：pET-28a-SjP40重组质粒经NdeⅠ和HindⅢ 双酶切产物  5：菌液PCR产物  M2：DL2000 DNA marker。

图3中：M1：蛋白 marker   1： Ni-NTA柱结合上清后流出液2：漂洗液3-7：含50,100，250，500,750mM咪唑洗脱液洗脱后8：pET-28a-SjP40重组菌诱导表达超声裂解上清液 9：纯化后蛋白。

图4中：1 pET-28a（+）诱导后蛋白，2 pET-28a-SjP40重组载体诱导后蛋白。

图5中：1：阴性对照组（PBS）  2：SjP40 5μg /mL  3：10μg /mL 4：20μg /mL 。

图6中：1：control  2：sjP40  3：TGF-β1  4：TGF-β1+sjp40。

具体实施方式

（一）材料与方法

1.材料

日本血吸虫虫卵购自江苏省血吸虫病防治研究所，LX-2细胞株购自中南大学湘雅中心实验室细胞库。大肠杆菌( E.coli.) DH5α、BL21，原核表达载体pET-28a(+)质粒(Novagen公司产品) , 由本室保存；人重组TGF-β1购自sigma公司。

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆 转 录 试 剂 购 自 美 国Fermentas 公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成； SYBR Premix Ex TaqTM Kit购自日本Takara公司；鼠抗人α-SMA，I型胶原多克隆一抗购自美国Santa Cruz公司，抗GAPDH抗体购自杭州贤至公司，HRP-标记羊抗兔、羊抗鼠抗体购自美国Santa Cruz公司。胎牛血清购自Hyclone公司，胰酶、DMEM 粉( 含高糖) 购自美国 Gibco公司。

2.方法

2.1 重组表达质粒的构建与鉴定

T中国大陆株P40蛋白rizol 提取日本血吸虫虫卵总RNA。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, 以Oligo ( dT ) 18 为模板将mRNA 逆转录为cDNA 。根据 Genebank 数据库中日本血吸虫SjP40序列（序列号：FJ531701.1）, 利用primer 5.0 软件设计SjP40 基因上游引物和下游引物, SjP40 上游引物：5’-GAAATTCGGTGTCGATAAAGC-3’; SjP40下游引物:5’- CACAAGTGAATATCATCATTACCAT-3’.以 cDNA为模板, PCR 扩增SjP40 基因。PCR 反应条件: ：94℃ 预变性3min；94℃ 变性30s，60℃ 退火30s，7 2℃ 延伸 2min，扩增 30 个循环；72℃ 继续延伸10min。PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒纯化。将PCR产物连入pMD19-T载体，连接产物转化入感受态细菌E.coli. DH5α，挑取阳性克隆，提取质粒，送Invitrogen公司测序，测序比对正确的质粒命名为pMD19-T- SjP40。

设计引物，在引物两端加入限制性酶切位点及保护碱基，引入酶切位点以下划线表示。上游引物:5’- GGAATTCCATATGATGTCGGGTACACATCAAAACCATG-3’（NdeⅠ）;下游引物：5’-CCCAAGCTTTAATGAGCGATTTCGTGTTGCTTCA-3’(HindⅢ).以 pMD19-T- SjP40为模板进行PCR，PCR 反应条件: ：94℃ 预变性3min；94℃ 变性20s，60℃ 退火30s，72℃ 延伸 1min，扩增 35个循环；72℃ 继续延伸5min。PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒纯化。胶回收产物与pET-28a（+）质粒分别用NdeⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切, 胶回收试剂盒纯化后, 用T4 DNA 连接酶连接, 构建pET-28a-SjP40 重组质粒。重组质粒经PCR 和双酶切验证后, 送至上海生工生物工程有限公司测序。

2.2 重组蛋白的表达及纯化

将重组表达质粒转化至感受态菌E.coli.BL21(DE3)中，挑取阳性克隆，37℃ 培养过夜。将菌液以1:100接种于含卡那霉素的新鲜液体 LB 培养基，37℃，200rpm培养至OD值为0.4~0.6时，分别取出 1ml 未诱导的菌液作为对照，其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG) 诱导蛋白的表达，收集菌体，通过SDS-PAGE电泳分析，鉴定重组蛋白的表达。经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化，最终确定诱导表达条件为： 0.1mM的 IPTG，30℃诱导8h。大量诱导表达后，收集上清，经Ni-NTA柱纯化后，透析膜透析，最终使蛋白溶于PBS中，并进行去内毒素处理。

2.3 LX-2细胞培养及处理

LX-2细胞置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液，5%  CO₂ 、37℃  培养箱常规培养，待细胞生长至密度达80%时传代。

实验分组:（1）LX-2细胞以1X10⁵/ml 铺于六孔板中，培养24h后，加入PBS及不同浓度的SjP40蛋白（5，10，20μg/ml）处理48h，。收集细胞进行western blot 分析

（2）LX-2细胞以1 X 10⁵/ml 铺于六孔板中，培养24h后，分为四组，加入PBS，SjP40（20μg/ml），TGF-β1(10ng/ml)，SjP40（20μg/ml）+TGF-β1(10ng/ml)后继续培养48h，然后进行western blot 分析。

α-SMA2.4 western blot

收集细胞后，采用 RIPA 裂解液裂解细胞，测定蛋白浓度后，取等量蛋白进行SDS-PAGE 电泳，湿转法将蛋白转印至PVDF膜。随后，PVDF膜用含5%脱脂牛奶的 TBST 室温封闭 2 h，弃去封闭液，用 5% 脱脂奶粉稀释好的一抗4℃孵育过夜; TBS洗膜3次，每次 10min; 加入稀释好的二抗，室温孵育60min; TBST洗膜四次，每次 10min; 采用 ECL 化学发光试剂显色。以 GAPDH 作为内参。

三．结果

1. 重组表达质粒pET28a- SjP40的构建与鉴定

用 Trizol成功提取日本血吸虫虫卵中的总mRNA，逆转录成cDNA后作为模板进行PCR反应，成功扩增出约为1151 bp目的条带，经1%琼脂糖凝胶电泳分析与预期的片段长度一致（图 1）。连接入 pMD19-T载体后测序证实与 GenBank 中公布的序列一致（序列号：FJ531701.1）

以pMD-19T-SjP40为模板扩增出来的基因片段纯化后连接入pET-28a（+）载体中，构建成重组质粒 pET-28a-SjP40。该重组质粒用NdeⅠ和HindⅢ 双酶切鉴定，可以获得约为1070 bp的基因片段（图2）。鉴定正确的质粒，送测序，将测序正确的重组质粒命名为pET-28a-SjP40。

 2. 重组表达质粒SjP40-pET28a的表达与纯化

测序正确的重组表达质粒pET-28a-SjP40 转化 BL21 表达菌后经 IPTG诱导，表达出了 SjP40重组蛋白。最佳诱导条件确定为IPTG 浓度为 0.1 mM，30℃ 诱导表达 8h。经过超声离心收集菌体和上清，经SDS-PAGE电泳确定蛋白表达于上清中（图3）。大量诱导表达后通过Ni-NTA柱纯化获得SjP40重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析，可见一条清晰的相对分子质量约为40kDa的条带与预期的蛋白大小相符（图3）。经western blot 检测可以证实40kDa的条带为目的蛋白（图4）。

3. SjP40对人肝星状细胞LX-2的作用

实验分为阴性对照组（PBS）、SjP40 5μg /mL、10μg /mL、20μg /mL 组，处理细胞48小时后，western blot 分析表明与对照组相比，SjP40能够减少LX-2细胞中α-SMA以及I型胶原的表达，SjP40能够抑制LX-2细胞中α-SMA以及I型胶原在蛋白水平的表达，并且在剂量为20μg/ml时效果最明显（图5）。

4.SjP40能够抑制由TGF-β1诱导的LX-2细胞的活化

实验分为阴性对照组（PBS），SjP40（20μg/ml）组，TGF-β1(10ng/ml)组，SjP40+TGF-β1组，分别处理细胞48h，采用western blot检测分析，结果显示与对照组相比，SjP40能够使得细胞中αα-SMA和I型胶原蛋白表达水平下降，TGF-β1使其表达增加，但是SjP40与TGF-β1共同处理LX-2细胞，与TGF-β1单独刺激组相比，αα-SMA和I型胶原的表达减少（图6）。

图上四个组分别为control, sjP40, TGF-β1以及TGF-β1+sjp40。