中华猕猴桃根皮提取物用于制备抗植物病毒剂的应用

摘要

本发明公开了中华猕猴桃根皮提取物用于制备抗植物病毒剂的应用，取中华猕猴桃根皮，晾干后粉碎，经一定的加工过程，制备成猕猴桃根皮抗病毒可溶性液剂、水剂及微乳剂，可用于烟草、辣椒、番茄、西葫芦、马铃薯等作物上防治烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus,CMV)及马铃薯病毒病(Potato Virus X，PVX；Potato Virus Y，PVY)等多种植物病毒病；本发明的抗植物病毒剂不仅抗病毒效果好，而且对环境、人、畜、害虫天敌及其它有益生物安全。该抗植物病毒剂制备工艺简单，成本低廉，适宜推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物及其应用领域，具体涉及中华猕猴桃根皮提取物用于 抗植物病毒的应用。

背景技术

植物病毒是一种由核酸和蛋白质组成的具有侵染活性的细胞内寄生 病原物，据国际病毒分类委员会(ICTV)的第八次报告，目前全世界发 现的植物病毒种类达1122个。植物病毒所引起的植物病害素有“植物癌 症”之称，其对农作物的危害程度仅次于真菌病原物，几乎每种农作物都 受到2～3种病毒的危害。全世界每年由植物病毒造成的损失约4百亿美元， 仅烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)造成的危害就超过1亿美 元。

由于植物病毒具有严格的寄生性，其寄生在植物细胞甚至是细胞核内 进行核酸(RNA或DNA)的复制和蛋白质外壳的合成，组成新的病毒粒 子。这就决定了植物病毒病的防治难度大，一般药剂没有效果。20世纪 初Allard报道商陆汁液中存在TMV的抑制物质，之后防治植物病毒的重 点逐渐转向植物天然提取物方向。特别是从上世纪90年代以来，人们陆 续从天然产物找到了许多抗植物病毒的抑制物质，为开发高效、专一、安 全的植物病毒天然抑制剂提供了基础。

中华猕猴桃Actinidia chinensis Planch.为猕猴桃科猕猴桃属植物，其 根又称藤梨根，是中国特有种，主要分布在中国的陕西、江西、湖南、湖 北、福建、浙江、河南、安徽等省。中华猕猴桃全株均可药用，中医认为 其根和根皮性寒、味苦涩，具有活血消肿、祛风利湿、清热利尿、散热止 血的功效，可用于治疗肝炎、风湿性关节炎、痢疾、丝虫病、胃癌、乳腺 癌等病症。近代药理学研究发现中华猕猴桃根具有清除活性氧自由基、抗 病毒、保肝、抑制肿瘤细胞生长、提高免疫力等功能。

现已报道的中华猕猴桃根化学成分主要是黄酮、三萜、甾体、蒽醌、 酚酸、糖类和其他多种类型的化合物，其中以三萜类成分为主。已发现的 活性化合物的药理活性主要表现在医药活性方面，如抗肿瘤、增强机体免 疫功能、保护肝脏、抗氧化、清除自由基、抗轮状病毒的功效。到目前为 止，关于中华猕猴桃根皮提取物及其代谢产物对农业生产上病、虫、草害 的作用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于以中华猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)的根皮 提取物为原料，研究出抗植物病毒效果高、无公害、价格低廉的植物源抗 植物病毒剂。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

中华猕猴桃根皮提取物用于制备抗植物病毒剂的应用。

具体的，所述的中华猕猴桃根皮提取物为将中华猕猴桃根皮粉碎物进 行醇提后得到的物质。

更具体的，所述的中华猕猴桃根皮粉碎物的粒径为1～5mm，醇提使 用的溶剂为乙醇，醇提温度为50～70℃。

还有，醇提使用的溶剂为质量分数95％乙醇，醇提时间为18～20小 时。

同时，所述的植物病毒包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒及马铃薯病 毒。

一种抗植物病毒剂，该抗植物病毒剂的剂型为微乳剂，所述的微乳剂 由以下原料按重量百分比配制：

中华猕猴桃根皮提取物：15％～30％，有机溶剂：0～55％，表面活性 剂：5％～20％，防冻剂：5％～10％，余量为水，原料的重量百分比之和为 100％。

或者，该抗植物病毒剂的剂型为可溶性液剂，所述的可溶性液剂由以 下原料按重量百分比配制：

中华猕猴桃根皮提取物15％～30％，有机溶剂：0％～55％，表面活性 剂：5％～30％，余量为乙醇，原料的重量百分比之和为100％。

或者，该抗植物病毒剂的剂型为水剂，所述的水剂由以下原料按重量 百分比配制：

中华猕猴桃根皮提取物：10％～20％，有机溶剂：0％～40％，表面活性 剂：5％～30％，防冻剂：5％～10％，余量为水，原料的重量百分比之和为 100％。

本发明所制成的猕猴桃根皮抗植物病毒剂具有以下优点：

(1)本发明通过对不同品种的猕猴桃提取物进行研究发现中华猕猴 桃的根皮提取物对植物病毒的防效显著，明显优于其他品种猕猴桃提取物 对植物病毒的防效；

(2)另外，发明人还对中华猕猴桃植株的不同部位的提取物进行了 抗植物病毒活性的研究，发现只有中华猕猴桃的根皮部位的提取物对植物 病毒的防效显著，其他部位甚至不具有抗植物病毒活性；

(3)本发明的中华猕猴桃提取物的抗植物病毒活性广谱，可用于烟 草、辣椒、番茄、西葫芦、马铃薯等作物上防治烟草花叶病毒病(Tobacco  mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus,CMV) 及马铃薯病毒病(Potato Virus X，PVX；Potato Virus Y，PVY)等多 种植物病毒病。

具体实施方式

本发明的植物源抗植物病毒剂，以多年生中华猕猴桃根皮提取物为活 性物质，加入一定比例助剂进行剂型加工，可以制得环保型制剂微乳剂、 水剂或可溶性液剂，本发明所述的中华猕猴桃根皮提取物为醇提后的物 质，可选的醇提溶剂为乙醇，对该植物提取物抗病毒的效果无不良影响。

本发明所述的植物病毒包括：烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic  virus,TMV)、黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus,CMV)及马铃薯 病毒病(Potato Virus X，PVX；Potato Virus Y，PVY)。

本发明所述的中华猕猴桃根皮提取物的提取方法包括：

A.将中华猕猴桃根皮用植物组织粉碎机粉碎至1～5mm的粗粉碎物；

B.将步骤A所得的粗粉碎物用95％乙醇浸提，提取温度为50～70℃， 提取时间为18～20小时，浸提物经真空浓缩至相当于1kg干粉/kg浓缩 液。

本发明所述的有机溶剂为乙酸乙酯、环己酮、油酸甲酯、乙醇、甲醇、 丙酮和二甲基甲酰胺中的一种或两种以上的混合物；

所述的乳化剂为烷基苯磺酸盐类、烷基酚聚氧乙烯醚类、多苯乙烯苯 酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚聚氧丙烯醚 类及其类似物质、斯潘系列、吐温和农用阴离子-磷酸酯中的一种或两种 以上的混合物；

所述的表面活性剂为烷基苯磺酸盐类、烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基 酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚聚氧丙烯醚类及其类似物质、蓖麻 油与环氧乙烷的加成物和芳烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物中的一种或两 种以上的混合物；

所述的防冻剂为乙二醇或丙三醇。

为了明确中华猕猴桃根皮抗病毒活性的特殊性及进一步探索其活性 的有效部位，发明人预先作了几下三方面的工作。

一、中华猕猴桃根皮同属其他植物抗病毒活性的差异：

发明人比较了中华猕猴桃和与其亲缘关系较近的其他几种猕猴桃属 植物的根皮提取物的抗病毒活性，结果显示，中华猕猴桃根皮提取物的抗 病毒活性显著优于其他品种。结果见表1。

表1几种猕猴桃根皮提取物对TMV体外钝化作用

注：1、供试药剂均为20％根皮提取物微乳剂；

2、表中数据为3次重复之平均值；“防效”栏中，同数列标后不同字母是指在α＝0.05水 平上呈显著差异。

二、中华猕猴桃抗病毒活性部位的确定：

发明人测定了中华猕猴桃不同部位提取物对TMV的体外钝化活性， 结果表明，不同部位提取物的抗病毒活性差异很大，在相同浓度下，根皮 提取物有显著的活性，根、茎、叶均不显示活性，而全株显示一定的活性， 可能也是由于根皮中抗病毒活性的作用(表2)。据此，发明人推测，中 华猕猴桃中抗病毒活性集中在根皮部位，因此，本发明确定中华猕猴桃根 皮提取物为抗病毒活性的主要原料。

表2中华猕猴桃不同部位提取物对TMV体外钝化作用

注：1、“-”表示未显示钝化活性。

2、表中数据为3次重复之平均值；“防效”栏中，同数列标后不同字母是指在α＝0.05水 平上呈显著差异。

三、中华猕猴桃根皮提取物抗病毒活性的广谱性：

发明人测定了中华猕猴桃根皮提取物对几种常见植物病毒病的体外 钝化活性，结果表明，其对TMV、CMV、PVX和PVY均表现出一定的 活性，这说明，中华猕猴桃根皮中含有广谱性的抗植物病毒活性成分。

表3中华猕猴桃根皮提取物对几种植物病毒病的体外钝化作用

注：表中数据为3次重复之平均值；“防效”栏中，同数列标后不同字母是指在α＝0.05水平 上呈显著差异，以下同。

在以上试验的基础上，为了进一步开发中华猕猴桃根皮提取物的抗病 毒活性制剂，将其分别制成微乳剂、可溶性液剂和水剂。经发明人的试验 证明，20％猕猴桃根皮微乳剂、20％猕猴桃根皮可溶性液剂和10％猕猴桃 根皮水剂对烟草花叶病毒(TMV)具有良好的防治效果，其中以20％猕 猴桃根皮微乳剂的防治效果最优。为了更好的理解发明的实质，下面用实 施例来详细说明发明的技术内容，但发明并不局限于这些实施例。

四、具体制剂制备实例：

实施例1：20％猕猴桃根皮微乳剂的配制

称取猕猴桃根皮浓缩物20kg，溶解于30kg乙酸乙酯中，再加入15kg 十二烷基苯磺酸钙，5kg苯乙烯酸聚氧乙烯醚，5kg乙二醇，在高速搅拌 下混和，加热至40℃左右；高速搅拌下滴加去离子水25kg，控制水的滴 加速度，使温度保持在40℃左右；水滴加完毕，升温至50℃，搅拌1小 时，制得20％猕猴桃根皮微乳剂100kg。制剂的稳定性、外观等符合商 品制剂的要求。

实施例2：20％猕猴桃根皮可溶性液剂的配制

称取猕猴桃根皮浓缩物20kg，溶解于30kg乙酸乙酯中，再加入5kg 烷基酚聚氧乙烯醚，1kg烷基多糖苷A，乙醇补齐至100kg，混合均匀后， 以搅拌速度800～1000转/分钟搅拌10～30分钟，即可制得猕猴桃根皮可 溶性液剂100kg。制剂的稳定性、外观等符合商品制剂的要求。

实施例3：10％猕猴桃根皮水剂的配制

称取猕猴桃根皮浓缩物10kg，溶解于30kg乙酸乙酯中，再加入5kg 烷基酚聚氧乙烯醚，1kg烷基多糖苷A，5kg乙二醇，水补齐至100kg， 混合均匀后，以搅拌速度800～1000转/分钟搅拌10～30分钟，即可制得 猕猴桃根皮可溶性液剂100kg。制剂的稳定性、外观等符合商品制剂的要 求。

五、3种猕猴桃根皮抗病毒剂对TMV的室内生物测定：

(1)对TMV体外钝化效果

采用半叶枯斑法测定，选取生长旺盛、长势一致的5～6叶期心叶烟 (Nicotiana glutinosa)为枯斑寄主。以叶脉为界，左半叶接种药液与病毒 等体积混合液，右半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液作对照，病毒接种 浓度为10μg/mL，钝化时间为5min，接种后立即用清水冲洗接种叶片表 面。每处理接种4片叶子，试验重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制 率。

抑制率(％)＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100

测定结果见表4。

表4 3种猕猴桃根皮抗病毒剂对TMV体外钝化作用

(2)对TMV初侵染的抑制效果

采用半叶枯斑法，选取长势一致、健康的5～6叶期心叶烟为枯斑寄 主，在涂抹药液6h、12h、24h后接种病毒，空白对照为清水处理，每个 处理接种4片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。结果见 表5。

表5 3种猕猴桃根皮抗病毒剂对TMV初侵染的抑制效果

(3)对TMV增殖的抑制效果

采用半叶枯斑法，选取长势一致、健康的5～6叶期心叶烟为枯斑寄 主，在接种病毒6h、12h、24h后涂抹药液，空白对照为清水处理，每个 处理接种4片叶子，重复3次，3d后统计枯斑数，计算抑制率。结果见 表6。

表6 3种猕猴桃根皮抗病毒剂对TMV增殖的抑制效果

由表4、5、6可知，3种猕猴桃根皮抗病毒剂对TMV的钝化，初侵 染、增殖抑制效果良好，其中，20％猕猴桃根皮微乳剂的作用优于其它两 种剂型，明显高于对照药剂吗啉胍.乙铜。

(4)对TMV的盆栽试验

1)对普通烟的保护作用

选择5-6叶期，长势一致、健壮的普通烟(Nicotiana tabacum)供试。 试验设预防组(施药3次后接种TMV)和对照组(只接种不施药)2组。 用3种猕猴桃根皮抗病毒剂200倍液喷雾，对照药剂吗啉胍.乙铜500倍 液喷雾处理普通烟，每5d施药一次，共施药三次。最后一次施药24h后 接种TMV，接种浓度为1：20(W/V)。接种后14d、21d检查发病情况， 统计病情指数及防治效果。每处理60株烟苗，试验重复3次。计算防效。

发病率＝(各处理发病株数/处理总株数)×100％

病情指数＝∑(病级数×病株数)/(最高病级×各处理总株数)×100

病情指数增长率＝(喷药后病指—喷药前病指)/喷药前病指×100％

防治效果＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100％

保护作用测定结果如表7所示。

表7 3种猕猴桃根皮抗病毒剂对普通烟的保护作用测定结果

2)对普通烟的治疗作用

选择5-6叶期，长势一致、健壮的普通烟(Nicotiana tabacum)供试。 试验设治疗组(接种TMV后施药3次)和对照组(只接种不施药)2组。 接种毒源TMV，接种浓度为1：20(W/V)，接种后每5d施药一次，共施 药三次。药剂为3种猕猴桃根皮抗病毒剂200倍液喷雾，对照药剂吗啉胍. 乙铜500倍液喷雾。分别于最后一次施药的14d、21d时检查发病情况， 统计病情指数及防治效果。每处理60株烟苗，试验重复3次。计算防效。 治疗作用测定结果如表8所示。

表8 3种猕猴桃根皮抗病毒剂对普通烟的治疗作用测定结果

盆栽试验结果表明(表4、表5)，3种猕猴桃根皮抗病毒剂对烟草 花叶病毒病表现出良好的预防和治疗效果，其保护和治疗效果均优于对照 药剂，其中，20％猕猴桃根皮微乳剂保护作用相对防效高于对照药剂25％ 左右。

六、3种猕猴桃根皮抗病毒剂对TMV的田间小区药效试验：

小区试验为随机排列，重复3次，小区面积视实际情况而定，但是 面积不能小于30㎡，试验地选择要求肥力均匀、作物种植和管理水平一 致，病情发生及危害程度比较均匀；各处理间及试验区周围要设保护行。 用3种猕猴桃根皮抗病毒剂100、200、400倍液进行叶面常量喷雾，以 20％的吗啉胍.乙铜可湿性粉剂500倍液为对照药剂进行叶面常量喷雾，并 设清水对照；所有供试药剂必须进行二次稀释。自发病初期开始喷药，后 每隔7d喷1次，共3次。第一次喷药前及最后一次喷药后的10d调查发 病率和统计病情指数，计算防效，结果见表9.

表9 3种猕猴桃根皮抗病毒剂防治烟草病毒病田间小区药效试验

从上表可知，3种猕猴桃根皮抗病毒剂对烟草花叶病毒具有良好的 防治效果，在稀释100、200、400倍的情况下明显优于药剂对照病毒A， 防效差异显著，且20％猕猴桃根皮微乳剂的平均防效优于20％猕猴桃根 皮可溶性液剂和10％猕猴桃根皮水剂的平均防效，可见将猕猴桃根皮提 取物制备成微乳剂更加有利于对植物病毒的防治。