制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法

摘要

本发明涉及由巨大戟二萜醇或巨大戟二萜醇衍生物制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法。

说明书

本发明提供了由巨大戟二萜醇制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法。

发明背景

巨大戟二萜醇-3-当归酸酯以前已经被描述为可用于治疗多种疾病，特 别是光化性角化病。该化合物可以从天然来源分离出，并且以相对小的量 存在于大戟属(Euphorbia)植物家族中。然而，相关化合物巨大戟二萜醇可 以以较大的量从天然来源中分离出。因此，本发明提供了由巨大戟二萜醇 开始制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法。

发明简述

本发明提供了其中以含有至少一个酶辅助步骤的方法由巨大戟二萜醇 合成巨大戟二萜醇-3-当归酸酯(本文还称为“PEP005”)的方法。

在一项实施方案中，本发明提供了制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方 法，该方法包括巨大戟二萜醇的酰化和任选地继之以二酰化巨大戟二萜醇 衍生物的脱酰化，其中至少一个步骤是通过酶催化的。

本发明提供了用于由巨大戟二萜醇制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的 一步、两步或三步反应，其包括至少一个酶催化反应。

本发明提供了制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法，该方法包括通过 酶催化进行的二酰化巨大戟二萜醇衍生物的脱酰化。

本发明提供了如上所述的方法，其中二酰化化合物是巨大戟二萜醇 -3，20-二当归酸酯。

本发明提供了如上所述的方法，其中二酰化化合物在20位含有不同于 当归酰基的酰基。

本发明提供了如上所述的方法，其中20位酰基是R-C＝O-，且R选自 取代或未取代的C₁-C₁₀-烷基且其中烷基可以是直链或支链的、取代或未取 代的C₂-C₁₀-链烯基或者取代或未取代的C₄-C₇-环烷基、取代或未取代的芳 基或取代或未取代的杂芳基。

本发明提供了化合物巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯和3-O-当归酰基 -20-O-乙酰基-巨大戟二萜醇，和在20位含有不同于当归酰基的酰基的巨 大戟二萜醇化合物，例如如上所述的那些。本发明提供了所述化合物及其 在如上所述的制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法中作为中间体的用途。

本发明提供了如上所述的方法，其中酶是来自皱落假丝酵母(Candida  rugosa)的脂酶A或脂酶B。

本发明提供了如上所述的方法，其中反应在庚烷或MTBE中进行。

本发明提供了如上所述的方法，其中溶剂是庚烷。

本发明提供了如上所述的方法，其中反应在亲核试剂的存在下进行。

本发明提供了如上所述的方法，其中亲核试剂是醇。

本发明提供了如上所述的方法，其中醇选自1-丁醇、1-戊醇、1-己醇 和1-辛醇。

本发明提供了如上文任一项所述的方法，其中亲核试剂以低于约 2.5％v/v的浓度存在。

本发明提供了如上所述的方法，其中亲核试剂以约1％v/v的浓度存在。

本发明提供了如上文任一项所述的方法，其中酶是来自皱落假丝酵母 的脂酶A，溶剂是庚烷，亲核试剂是约1％v/v浓度的1-丁醇、1-戊醇、1- 己醇或1-辛醇。

本发明提供了制备二酰化巨大戟二萜醇衍生物的方法，该方法包括在 酰基供体的存在下和任选在酶的存在下的巨大戟二萜醇的反应。

本发明提供了如上所述的方法，其中酰基供体是当归酸酐。

本发明提供了如上所述的方法，其中酰基供体以4当量加入。

本发明提供了如上所述的方法，其中酶选自来自产碱菌属(Alcaligenes  sp.)的脂酶A、B、C、D、E或F，来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) 的脂酶，来自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂酶，来自皱落假丝 酵母的脂酶A或B，来自番木瓜(Carica Papaya)的脂酶，来自沙门柏干酪 青霉(Penicillium camembertii)的脂酶，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的蛋白酶C，来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂酶，来自洋 葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的脂酶A和B，或无花果蛋白酶。

本发明提供了如上所述的方法，其中酶是来自产碱菌属的脂酶A、C 或E。

本发明提供了如上所述的方法，其中反应在有机溶剂中进行。

本发明提供了如上所述的方法，其中溶剂是庚烷或己烷。

本发明提供了如上文任一项所述的方法，其中反应在升高温度下进行。

本发明提供了如上所述的方法，其中温度为约50℃。

本发明提供了由巨大戟二萜醇制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法， 该方法采用酰基供体以酶催化的一步反应进行。

本发明提供了如上所述的方法，其中反应采用当归酸酐作为酰基供体。

本发明提供了如上所述的方法，其中酶是水解酶来自番木瓜的脂酶、 来自沙门柏干酪青霉的脂酶、来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶C、来自洋葱伯 克霍尔德菌的脂酶A和B、无花果蛋白酶或Lipobond洋葱假单胞菌 (Lipobond P.Cepacia)。

本发明提供了如上所述的方法，其中酶是Lipobond洋葱假单胞菌。

本发明提供了如上所述的方法，其中溶剂是乙腈。

本发明提供了如上所述的方法，其中反应混合物含有表面活性剂。

本发明提供了如上所述的方法，其中表面活性剂选自CTAC、TTAB、 CPC、BZT、BAC、DDAC、DDAB。

本发明提供了如上所述的方法，其中表面活性剂是CPC或BZT。

附图简述

图1：在庚烷中经由巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯初始合成的巨大戟 二萜醇-3-当归酸酯单罐合成的总反应时间对比于％转化的图。

发明详述

本发明在由巨大戟二萜醇制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法中采 用了酶。酶能够以特定方式催化化学反应。该特征在本发明中证明是有价 值的，因为不仅是巨大戟二萜醇、而且还有巨大戟二萜醇-3-当归酸酯具有 多个立体中心，但是巨大戟二萜醇自身也具有总共4个羟基。这些羟基中 有两个是仲醇，并且具有相当的反应活性。但是，在巨大戟二萜醇-3-当归 酸酯中，仅巨大戟二萜醇的3-位应当被当归酰基衍生化。另外，巨大戟二 萜醇还含有伯醇，其不应当与当归酰基部分反应，但是伯醇的反应活性经 常是非常活跃的。而且还存在叔醇，其不意欲被衍生化。虽然将一个羟基 而不是其它羟基特异性地衍生化在化学上是困难的，但是现在已经证明酶 能够以特定方式催化这类反应。

本发明提供了一步、两步或三步反应的巨大戟二萜醇向巨大戟二萜醇 -3-当归酸酯的水解酶催化选择性酰化。

本发明所追随的反应是巨大戟二萜醇的水解酶催化选择性酰化。水解 酶催化化学键的水解。它们可以按照它们所水解的化合物的类型进一步细 分。脂酶催化脂质中的酯键的水解，蛋白酶催化肽键等的水解。除了在水 性介质中的选择性水解外，水解酶可用于进行在非水介质中的选择性酰化。 酶可以分离自天然来源，它们可以被衍生化为具有适宜的特征。

优选地，酶对于巨大戟二萜醇靶标和所产生的终产物而言应当是特异 性的，以可接受的纯度和产率提供终产物。同样，酶在化学反应可接受的 条件下应当是功能性的。通常，这指有机溶剂和升高的温度。同样，对于 商业产物规模而言，酶应当优选以较大的量供应用于工业制药用途。

下文概括了本发明的方法：

由二酰化产物获得PEP005：

根据反应的特异性和所用的酶，在方法中将潜在地形成副产物。

在上述方法的一项实施方案中，3-和20-位用当归酰基衍生化(上文的 巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯)。在另一项实施方案中，20-位羟基用不同 于当归酰基的基团进行衍生化。

在一项实施方案中，如上所述的基团R-(C＝O)-O-包括取代或未取代的 C₁-C₁₀-烷基-羧酸酯基且其中烷基可以是直链或支链的、取代或未取代的 C₂-C₁₀-链烯基-羧酸酯基或者取代或未取代的C₄-C₇-环脂肪族羧酸酯基、取 代或未取代的芳族羧酸酯基或者取代或未取代的杂芳族羧酸酯基。在一项 实施方案中，R-(C＝O)-O选自甲酸酯基、乙酸酯基、丙酸酯基、丁酸酯基、 新戊酸酯基、巴豆酸酯基、当归酸酯基、4-戊烯酸酯基、氯乙酸酯基、二 氯乙酸酯基、三氟乙酸酯基、甲氧基乙酸酯基、苯氧基乙酸酯基 (penoxyacetate)、苯甲酸酯基、苯基乙酸酯基(penylacetate)、3-苯基丙酸酯 基、4-氧代戊酸酯基、4-甲氧基巴豆酸酯基或对苯基苯甲酸酯基。在一项 实施方案中，该基团选自乙酸酯基、丁酸酯基、新戊酸酯基或苯甲酸酯基、 4-氧代戊酸酯基。

在本发明的上下文中，C₁-C₁₀-烷基包括直链和支链烷基，例如甲基、 乙基、丙基、丁基、2-丁基、叔丁基、1-戊基、2-戊基、3-戊基等、己基、 庚基、辛基、壬基、十二烷基。在本发明的上下文中，C₂-C₁₀-链烯基例如 选自乙烯基、丙烯基、2-丁烯基、1-丁烯基、当归烯基(angelyl)、4-戊烯基。 在本发明的上下文中，芳基是苯基、苄基或萘基。在本发明的上下文中， 杂芳基是包括一个或多个杂原子的如上文定义的芳基。在本发明的上下文 中，取代的变体包括例如C₄-C₇-环烷基甲基、C₄-C₇-环烷基乙基或卤素取 代如氯甲基、氯乙基、二氯甲基、二氯乙基、氟甲基、氟乙基、二氟甲基、 二氟乙基、三氟甲基、三氟乙基或醚衍生物如甲氧基甲基、甲氧基乙基、 苯氧基甲基、苯氧基乙基、3-甲氧基丙烯基、苯基取代的衍生物如苄基、 苯基乙基、3-苯基丙基、p-联苯基、p-苯基-苄基或氧代基变体如3-氧代- 丁基。

如果3位和20位的两个基团是不同的，则可能需要另外的方法步骤。 衍生化可以在化学上或经酶催化进行。在任一方法后，本发明描述了20 位的特异性脱酰化以提供巨大戟二萜醇-3-当归酸酯。

在一项实施方案中，脱酰化由巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯进行。

能够从20位进行特异性脱酰化的酶是来自皱落假丝酵母的脂酶A或 脂酶B。

该反应在有机溶剂如乙腈、庚烷或MTBE中进行。在本发明的一项实 施方案中，溶剂是庚烷或MTBE。

在本发明的一项实施方案中，脱酰化反应含有亲核试剂如醇。在本发 明的上下文中，醇是低级醇，例如C_1-10-烷基-OH，包括所有的异构体。非 限制性的实例有甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1- 戊醇、2-戊醇、3-戊醇等。适宜的醇有丁醇、戊醇、己醇和辛醇。在本发 明的上下文中，丁醇指1-丁醇，己醇指1-己醇，辛醇指1-辛醇，另有说明 除外。在本发明的实施方案中，醇的混合物被加入到反应混合物中。在本 发明的实施方案中，醇以低于2.5％的浓度存在于反应混合物中。在本发明 的实施方案中，醇以低于1％的浓度存在于反应混合物中。

在本发明的一项实施方案中，反应是不含水的，以防止在水中3位酰 基可能迁移至5位或20位。

二酰化产物的形成：

根据二酰化产物的选择，即3和20位可以用相同或不同酰基衍生化， 可以以一步或两步反应由巨大戟二萜醇形成二酰化产物。

当由巨大戟二萜醇制备二酰化产物时，还可以形成单酰化产物。这些 可能具有本发明所不期望的取代模式。所获得的优势产物为：

可能的副产物还有巨大戟二萜醇-3，5-二当归酸酯和巨大戟二萜醇 -3，5，20-三当归酸酯。

本发明的目的是提供用于形成适于选择性脱酰化为巨大戟二萜醇-3- 当归酸酯的二酰化巨大戟二萜醇的选择性方法，该方法通过在最后一个步 骤中采用酶形式的生物催化。

用当归酰基供体进行衍生化的一步反应可以形成不同的产物：巨大戟 二萜醇3-当归酸酯、PEP025、PEP015和二酰化和三酰化衍生物。在这些 可能形成的产物中，期望获得单酰化产物巨大戟二萜醇-3-当归酸酯或二酰 化产物巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯。3-单酰化产物是本方法的预期产 物，而二酰化衍生物巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯可以如所述那样进行脱 酰化。其它副产物不是本方法所预期的，本发明公开了特异性地产生预期 产物的方法。副产物如PEP015或PEP025可以最终水解为巨大戟二萜醇， 巨大戟二萜醇是本方法的原料。如果进行该反应周期并且然后优化可回收 副产物、将它们水解和循环。但是，本发明描述了这样的方法，其相对于 副产物而言提供了可接受产率的预期产物。

采用如下所述的一个酰基供体进行了一步反应：

在一项实施方案中，酰基供体是当归酸酐或肟3。在本发明的一项实 施方案中，酰基供体是当归酸酐。通常，观察到酰基供体的过剩提供了增 加产率的二酰化产物。但是，必须评估中间体成本相对于产率的平衡。

在本发明的一项实施方案中，以不少于2当量加入当归酸酐。在一项 实施方案中，将2.5当量或更多的当归酸酐加入巨大戟二萜醇中。在一项 实施方案中，以4当量或更多将当归酸酐加入巨大戟二萜醇中。

当酶选自来自产碱菌属的脂酶A、B、C、D、E或F、来自施氏假单 胞菌的脂酶、来自洋葱假单胞菌的脂酶、来自皱落假丝酵母的脂酶A或B、 来自番木瓜的脂酶、来自沙门柏干酪青霉的脂酶、来自枯草芽孢杆菌的蛋 白酶C、来自荧光假单胞菌的脂酶、来自洋葱伯克霍尔德菌的脂酶A和B 或无花果蛋白酶时，反应进行至预期产物。

在一项实施方案中，酶选自来自产碱菌属的脂酶A、B、C和E、来自 洋葱假单胞菌的脂酶、来自皱落假丝酵母的脂酶B、来自沙门柏干酪青霉 的脂酶、来自洋葱伯克霍尔德菌的脂酶A和B。

在一项实施方案中，酶选自来自产碱菌属的脂酶A、C和E。

在一项实施方案中，溶剂是甲苯、己烷或庚烷。在一项实施方案中， 溶剂是己烷或庚烷。

反应温度的优化可以依赖于酶。但是，本发明中进行的实验指示，在 较高温度下二酰化产物的产率清楚地增加。在一项实施方案中，反应温度 为约50℃或更高。

在本发明的一项实施方案中，反应采用来自产碱菌属的脂酶A和4当 量当归酸酐于50℃在庚烷中进行。

在本发明的一项实施方案中，巨大戟二萜醇被衍生化为20-乙酰基-巨 大戟二萜醇。该反应在化学上或者通过使用酶进行。巨大戟二萜醇的20 位是伯醇，它是巨大戟二萜醇中反应活性最强的醇，因此在非常特异性的 反应中该产物可以以高产率获得。其次，该化合物在采用当归酰基供体化 合物和任选地使用酶作为催化剂的反应中被进一步衍生化。20-位的选择性 脱乙酰化将提供PEP005。

一个步骤由巨大戟二萜醇合成PEP005

在一项实施方案中，本发明的方法如下文所概括：

对反应条件进行选择以使不希望的副产物和二酰化产物的形成最少， 由此以一步法形成了巨大戟二萜醇-3-当归酸酯。

制备巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的方法可以采用各种不同的当归酰基 来源，例如下述那些：

在所选择的酰基供体中，化合物2和3适宜作为酰基供体。

能够催化巨大戟二萜醇的3位单酰化形成巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的 酶是以采用当归酸酐2作为酰基供体和采用水解酶来自番木瓜的脂酶、来 自沙门柏干酪青霉的脂酶、来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶C、来自洋葱伯克 霍尔德菌的脂酶A和B、无花果蛋白酶或Lipobond洋葱假单胞菌的反应 为特征的酶。在本发明的一项实施方案中，酶是Lipobond洋葱假单胞菌。

反应在作为溶剂的乙腈中进行。

表面活性剂是能够影响酶的微环境、由此增加其活性和选择性的化合 物。

所测试的表面活性剂有阴离子型表面活性剂磺基琥珀酸二辛酯钠 (AOT)、阳离子型表面活性剂CTAB和非离子型聚山梨酯表面活性剂吐温 -20。另外的表面活性剂有：十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、十四烷基三 甲基溴化铵(TTAB)、西吡氯铵(CPC)、苄索氯铵(BZT)、苯扎氯铵(BAC)、 二甲基二(十八烷基)氯化铵(DDAC)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB) 和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

在一项实施方案中，反应混合物含有表面活性剂。在一项实施方案中， 表面活性剂选自CTAC、TTAB、CPC、BZT、BAC、DDAC、DDAB。 在一项实施方案中，表面活性剂是CPC或BZT。

实施例

表1.

代码 酶类型 1 来自产碱菌属的脂酶A 02 来自产碱菌属的脂酶B 03 来自产碱菌属的脂酶C

04 来自施氏假单胞菌的脂酶 05 来自洋葱假单胞菌的脂酶 06 来自皱落假丝酵母的脂酶A 07 来自产碱菌属的脂酶D 08 来自产碱菌属的脂酶E 09 来自皱落假丝酵母的脂酶B 10 来自产碱菌属的脂酶F 17 来自番木瓜的脂酶 24 来自皱落假丝酵母的脂酶B 32 来自沙门柏干酪青霉的脂酶 33 来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶C 35 来自荧光假单胞菌的脂酶 36 来自洋葱伯克霍尔德菌的脂酶A 37 来自洋葱伯克霍尔德菌的脂酶B 39 来自南极假丝酵母(Candida Antarctica)的脂酶 40 来自嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)的脂酶 41 来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的蛋白酶A 44 来自芽孢杆菌属的蛋白酶B 48 无花果蛋白酶 49 Lipobond CALB 50 Adsorbed CALB 51 Lipo CALB 53 Antiplus CALB 54 Lipobond洋葱假单胞菌 55 Epobond CALB 57 Savinase CLEA 58 Esperase CLEA

表1：水解酶

HPLC方法：

表B：HPLC方法B的条件

相对响应因子(RRF)的计算

已知的是，相比于酰化化合物巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、PEP015、 PEP025和巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯而言，巨大戟二萜醇在235nm处 的吸收更弱。因此，为了获得更准确的转化百分比用于筛选反应，有必要 计算每个这些组分的相对响应因子(RRFs)。

为了达到此目的，由贮备液制备已知浓度的HPLC样品。将巨大戟二 萜醇-3-当归酸酯、PEP015、PEP025和巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在 DMSO中制备为10mM溶液-将50μL加入1.2mL25mM KH₂PO₄(pH 2.2)/乙腈的8∶2混合物中，得到0.4mM样品。将9.2mg溶于5mL乙腈中 制备巨大戟二萜醇的贮备液-取200μL加入1mL25mM KH₂PO₄(pH 2.2)/乙腈的8∶2混合物中，得到0.7123mM的样品浓度。通过HPLC分析 这些样品，在考虑样品浓度和化合物纯度的情况下将峰面积用于计算RRF (表2)。相对于巨大戟二萜醇-3-当归酸酯给出响应因子。

(注意：巨大戟二萜醇纯度通过定量¹H NMR计算为84.18％。巨大戟 二萜醇-3-当归酸酯、PEP015、PEP025和巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯 作为在DMSO中的溶液提供，纯度未计算，但是假定为100％)。

(峰面积，如果所有样品为1mM)

组分 纯度 样品浓度(mM) 峰面积 峰面积*100/浓度*纯度 RRF 巨大戟二萜醇 84.18 0.7123 927036 1546054.267 0.159473927 PEP005 100 0.4 3877886 9694715 1 PEP015 100 0.4 4432309 11080772.5 1.142970423 PEP025 100 0.4 3038236 7595590 0.783477389 化合物4 100 0.4 3070079 7675197.5 0.791688822

表2：巨大戟二萜醇、巨大戟二萜醇-3-当归酸酯、PEP015、PEP025和巨 大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的RRF的计算

然后将这些RRF用于根据所分析的筛选反应的峰面积计算％转化，如 表3所示。

反应组分 巨大戟二萜醇 PEP005 PEP015 PEP025 化合物4 相对响应因子 0.159473927 1 1.142970423 0.783477389 0.791688822 HPLC峰面积 246165 2134040 477677 789931 2743221 调整面积 1543606.566 2134040 417925.9503 1008237.137 3465024.291 实际％ 15.8811133 21.9556795 4.299754559 10.37306303 35.64926749

表3：根据筛选反应的HPLC分析的峰面积计算％转化的实例

由巨大戟二萜醇合成巨大戟二萜醇-3-当归酸酯

将巨大戟二萜醇针对60种水解酶在两种不同溶剂(MTBE和乙腈)中用 肟酯3作为酰基供体进行筛选。所有筛选反应在HPLC小瓶中进行。下文 概括了通用的筛选条件。每个筛选反应含有：

·2mg巨大戟二萜醇

·1.5当量当归酸酐

·1小勺酶(如果是固体)或2滴酶(如果是液体)(～10mg)

·2或3片分子筛

·0.5mL溶剂

首先将酶和分子筛加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇和肟酯3 在反应溶剂中的贮备液0.5mL。

将筛选反应物于室温振摇112小时，然后通过TLC进行分析(洗脱剂 为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染色和加热而显影)。通过HPLC(方法A) 分析呈现出酰化产物形成的任意反应物。

通过将100μL反应混合物加入含有脱脂棉栓的玻璃吸管中并用 ～1.2mL25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈的8∶2混合物充分洗涤，制得 HPLC样品。

用当归酸酐作为酰基供体进行筛选

所有筛选反应在HPLC小瓶中进行。下文概括了通用的筛选条件。每 个筛选反应含有：

2mg巨大戟二萜醇

1.5当量酰基供体

1小勺酶(如果是固体)或2滴酶(如果是液体)(～10mg)

2或3片分子筛

0.5mL溶剂

首先将酶和分子筛加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇和酰基供 体在反应溶剂中的贮备液0.5mL。

将筛选反应物于室温振摇不同时间，然后通过TLC进行分析(洗脱剂 为1∶1EtOAc/庚烷，通过硫酸高铈染色和加热而显影)。通过HPLC(方法 A)分析呈现出酰化产物形成的任意反应物。

通过将100μL反应混合物加入含有脱脂棉栓的玻璃吸管中并用～1mL 25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈的8∶2混合物充分洗涤，制得HPLC 样品。

由于重叠的当归酸酐峰，不能对PEP025形成水平进行准确的定量， 但是通过峰分裂通常可以获得近似水平。通过考虑巨大戟二萜醇和PEP025 的相对响应因子(RRF)(参见上文)计算出转化百分比。

表4显示了结果的概括。

表4：在乙腈中用当归酸酐进行的筛选反应的结果概述

在各种温度6℃(在冰箱中搅拌)、20℃(于室温振摇)、30℃(加热振摇 器)和40℃(在设置为40℃的烘箱中振摇)下重复反应。将反应物振摇/搅拌 40小时，然后通过HPLC进行分析。表5显示了结果的概括。

表5：用17、32、33、36、37、48和54进行温度实验的HPLC分析概述 表面活性剂筛选

表面活性剂是能够影响酶的微环境、由此增加其活性和选择性的化合 物(Zheng，L.等人，Biocatalysis&Biotransformation，2007年11-12月， 25(6)，430-433.)。

因此，研究了各种表面活性剂阴离子型表面活性剂磺基琥珀酸二辛酯 钠(AOT)、阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和非离子型 聚山梨酯表面活性剂吐温-20对水解酶17、32、33、36、37、48和54的作 用。

采用了标准筛选条件，用当归酸酐作为酰基供体、乙腈作为反应溶剂 并且采用2.5％或5％(w/v)表面活性剂。将反应物于室温振摇～40小时，然 后通过HPLC进行分析。表6概括了这些结果。

表6：用17、32、33、36、37、48和54进行的表面活性剂实验的HPLC 分析概述

CTAB对54活性的影响的进一步研究

进行了进一步实验以研究CTAB对54活性的影响。将反应物在不同 温度(20℃、30℃、40℃和50℃)下采用两种CTAB浓度(1％和2.5％(w/v)) 振摇或搅拌～40小时，然后通过HPLC进行分析。

表7概括了这些结果。

表7：在CTAB存在下用54进行的温度实验的HPLC分析概述

二酰化产物和巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的形成：

该反应在一系列其它溶剂中测试了7种酶，以观察它们是否呈现出预 期化合物巨大戟二萜醇-3-当归酸酯或次要靶标巨大戟二萜醇-3，20-二当归 酸酯(化合物4)的选择性形成。这些溶剂有：

己烷

庚烷

丙酮

甲苯

二氯甲烷

DMF

THF

二异丙基醚

正丁醇

每个筛选反应含有：

2mg巨大戟二萜醇

1.5当量当归酸酐2(1.57mg)

1小勺酶(～10mg)

2或3片分子筛

0.5mL溶剂

由于巨大戟二萜醇不溶于己烷、庚烷和甲苯，所以必须将底物测量入 各个单独反应小瓶中，而对于所有其它溶剂作为贮备液加入。

将反应物于28℃振摇88小时(对于溶剂1-4)或69小时(对于溶剂5-9)， 然后通过TLC进行分析(洗脱剂为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染色和加 热而显影)。对于在己烷、庚烷、甲苯、二氯甲烷和二异丙醚中的反应，观 察到酰化产物斑点。

通过HPLC对己烷、庚烷、甲苯、二氯甲烷和二异丙醚中的反应进行 分析。

通过下述方法制备HPLC样品：

将反应小瓶敞口放置在空气流通的通风橱中过夜，或者用直接氮气流 吹，以使得反应溶剂蒸发。然后将DMSO(150μL)加入残余物中以溶解酰 化产物和任意残留的原料。然后加入25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈 的1∶1混合物(～1mL)进行稀释，将其混合，然后经含有脱脂棉栓的吸管过 滤入HPLC小瓶中供分析。这是为了确保HPLC记录将准确地显示不同反 应组分的水平，因为反应混合物的异质性使得不能准确取样。

这些结果概括在表8中。

表8：用巨大戟二萜醇和当归酸酐2(1.5当量)进行的溶剂筛选反应的概括 酰基供体当量的研究

在如上文给出相同的条件下、但是在2.5当量酰基供体的存在下、在 己烷和庚烷中用上文所列的6种酶进行以下测试反应。将结果与用1.5当 量酰基供体获得的结果进行比较。

以如上文所述相同的方式制备HPLC样品。

表9：在己烷和庚烷中用1.5和2.5当量当归酸酐2进行的巨大戟二萜醇筛 选反应的概述

扩展溶剂(extended solvent)筛选

用酶17、32、33、36、37、48和54进行扩展溶剂筛选反应的初始设 定。

条件与上文的反应(2.5当量酰基供体)相同。研究了三种反应溶剂—— 己烷、庚烷和甲苯。

以如上文所述相同的方式制备HPLC样品。

己烷中的筛选反应

将反应物于30℃振摇89小时，然后通过HPLC进行分析。结果概括 在表10中。

表10：在己烷中用2.5当量当归酸酐2进行的巨大戟二萜醇筛选反应的概 述

庚烷中的筛选反应

将反应物于30℃振摇93小时，然后通过HPLC进行分析。结果概括 在表11中。

表11：在庚烷中用2.5当量当归酸酐2进行的巨大戟二萜醇筛选反应的概 述

甲苯中的筛选反应

将反应物于30℃振摇70小时，然后通过HPLC进行分析。结果概括 在表12中。

表12：在甲苯中用2.5当量当归酸酐2进行的巨大戟二萜醇筛选反应的概 述

在庚烷中的进一步酰化筛选

同时研究了多个参数——较高温度的影响(在30℃和50℃运行反应)、 较高当量的酰基供体2的影响(在2.5或4当量运行反应)和三乙胺的存在的 影响。用水解酶01、03和08进行了实验。

进行了两个实验设置——在30℃的设置1和在50℃的设置2。反应含 有如下物质：

2mg巨大戟二萜醇

2.5当量(2.62mg)或4当量(4.18mg)当归酸酐2

1小勺酶

2或3片分子筛

0.5mL庚烷

每个反应一式两份进行——一份在三乙胺(2.5或4当量，取决于当归 酸酐2的当量)存在下，一份在没有三乙胺的存在下。

由于巨大戟二萜醇不溶于庚烷，所以将底物测量入各个单独反应小瓶 中。然后加入酶和分子筛，然后加入当归酸酐2在庚烷中的溶液(酌情含有 三乙胺)。将反应物于30℃或50℃振摇64小时，然后通过HPLC进行分 析(HPLC样品的制备方法在第9.1节给出)。

结果概括在表13中。

表13：改变温度、酰基供体当量和三乙胺的存在的在庚烷中巨大戟二萜醇 筛选反应概述

表面活性剂对酶活性的影响的研究

测试了表面活性剂在庚烷中对8种酶——01、02、03、05、08、24、 32和37——的影响。选择了三种表面活性剂——阴离子型表面活性剂磺基 琥珀酸二辛酯钠(AOT)、阳离子型表面活性剂CTAB和非离子型聚山梨酯 表面活性剂吐温-20。

将酶用表面活性剂溶液进行预处理，冷冻干燥。

如下制备冷冻干燥的表面活性剂包涂的水解酶：

AOT&CTAB

将1.8g表面活性剂加入72mL蒸馏水(2.5％w/v)中。将其搅拌和超声 以溶解。由于这些化合物在水中的溶解性差，所以未发生完全溶解。从未 溶解的表面活性剂中分离出溶液，通过加入3mL至50mg各水解酶中将酶 进行处理。然后将其冷冻干燥过夜。

吐温-20：

将1.8g表面活性剂溶于18mL H₂O(10％w/v)中，将1.5mL该溶液加 入100mg各水解酶中。然后将其冷冻干燥过夜。

水解酶24、32和37与吐温-20未适当地冷冻干燥(可能是因为该表面 活性剂的粘性高)。因此，向含有这些酶的反应物中简单地加入1滴吐温-20。

每个反应含有下述物质：

2mg巨大戟二萜醇

2.5当量当归酸酐2(2.62mg)

1-3勺酶(取决于所处理的酶的“蓬松性”)

2或3片分子筛

0.5mL庚烷

对于每种酶，还采用未经处理的酶进行另外的反应用于比较。将反应 物于30℃振摇65小时，然后通过HPLC进行分析(制备HPLC样品的方 法在第9.1节给出)。

结果概括在表14中。

表14：在庚烷中用经表面活性剂处理的水解酶进行的巨大戟二萜醇筛选反 应概述

研究了上述反应的进一步优化：

采用8种以前鉴定的先导酶进行实验初步设置，以将选择减小至两种 酶用于进一步研究。在显著高于以前所研究的底物浓度的底物浓度下进行 反应(20mg/反应代替2mg/反应)，酶装载准确测定为10mg(50％w/w，就底 物装载而言)。

在HPLC小瓶中进行了反应，其含有下述物质：

·20mg巨大戟二萜醇

·2.5当量当归酸酐2(26.2mg)

·10mg酶(50％w/w，就底物而言)

·2或3片分子筛

·0.5mL庚烷

首先将酶、巨大戟二萜醇和分子筛加入反应小瓶中，然后加入当归酸 酐2在庚烷中的溶液0.5mL。将反应物于50℃振摇70小时，然后通过TLC 分析化合物4形成的证据。对于所有8种酶清楚地看到这种情况。

通过用直接氮气流蒸发庚烷溶剂对反应物进行后处理。然后将残余物 溶于二氯甲烷中以确保所有反应组分处于溶液中。各取20μL样品加入 HPLC小瓶中，在此将溶液用直接氮气流蒸发，将残余物再溶于25mM KH₂PO₄(pH2.2)/乙腈的1∶1混合物中，通过HPLC进行分析(表14)。除巨 大戟二萜醇、PEP025和化合物4外，观察到呈现出巨大戟二萜醇的特征 性UV吸收的多个小峰。这些副产物在所有8个反应中是相对恒定的，因 此为了便利当计算向PEP025和化合物4的转化时不考虑在内。这些反应 单纯地是为了鉴别两种最有前景的先导酶用于进一步研究。

在8种酶中，有3种(AH-03、AH-05和AH-08)呈现出巨大戟二萜醇 原料的总消耗以及最高的化合物4形成百分比。选择用于进一步研究的两 种先导酶是AH-03和AH-08。

*针对在235nm的UV响应因子差异进行校正

表14：实验ALM2213209结果概述(突出显示的反应没有巨大戟二萜醇剩 余)。

1.1实验ALM2213213-于60℃的底物装载

采用两种鉴定的先导酶(AH-03和AH-08)以不同的底物装载进行进一 步研究。还检查了1.5当量三乙胺碱的存在的作用，因为认为‘清理’所形成 的当归酸可导致较高的反应速率。在60℃进行反应以评价该较高温度是否 可增加反应速率而不导致酶失活和/或过量副产物形成。

所有反应在含有2.5当量当归酸酐2、50％w/w酶和2-3片分子筛 的0.5mL庚烷中进行。对于每种酶研究了四种不同的反应条件：

反应A：20mg巨大戟二萜醇、26.1mg当归酸酐2、10mg酶+1.5当量Et₃N (12μL)。

反应B：20mg巨大戟二萜醇、26.1mg当归酸酐2、10mg酶。

反应C：40mg巨大戟二萜醇、52.3mg当归酸酐2、20mg酶。

反应D：60mg巨大戟二萜醇、78.5mg当归酸酐2、30mg酶。

空白：60mg巨大戟二萜醇、78.5mg当归酸酐2(没有酶)。

将反应物于60℃振摇，以每日间隔取样用于HPLC分析。这用于指示 PEP025/化合物4形成的比例而不是转化的精确评价，因为巨大戟二萜醇 在庚烷中的溶解度低(两种酰化产物均呈现较高的在庚烷中的溶解度)。观 察到所有反应都发生了预期的二酰化。有趣的是，在三乙胺碱存在下进行 的两个反应显示进行地最快，虽然这伴随着较高水平的非预期副产物形成。 采用水解酶AH-08观察到相同结果。

在第3天，观察到对于所有反应而言产物形成速率显著减慢，它们无 一显示出PEP025完全消失。认为可能的是，高温(60℃)可以导致酶活性逐 渐丧失。因此，向各反应(A-D)加入另外的50％w/w酶，继续振摇另外3 天(过周末)。此后，将反应物进行后处理(如第10.1节所述)，得到所有反应 组分的代表性样品用于HPLC分析。这些结果概括在表15中。

*针对在235nm的UV响应因子差异进行校正

表15：实验ALM2213213最终分析结果的概述

观察到形成具有巨大戟二萜醇的特征性UV吸收的多个副产物。它们 各自被指定了估计响应因子为1以有助于计算校正％面积。如表15所示， 所有反应呈现出联合的副产物＞20％(对于在三乙胺存在下的反应而言为 ＞35％)。已知用于这些反应的巨大戟二萜醇不具有高纯度(¹H NMR分析给 出纯度为81.4％)，因此可能的是，这些副产物中的一些可以归因于当归酸 酐与结构相关杂质的反应。

还观察到，所有的含酶反应在6天后呈现出当归酸酐2被完全消耗(尽 管过量存在)，由此阻止PEP025完全转化为化合物4。通过比较，不含酶 的空白反应仍然含有未反应的酸酐。这意味着，酸酐还与酶自身(可能酰化 蛋白质结构上的各种氨基酸残基)反应或与酶配制中存在的赋形剂反应。

有趣的是，在所研究的底物浓度和温度，在没有酶的存在下(空白反应) 观察到巨大戟二萜醇基本完全消耗，并伴随着PEP025和化合物4的形成。 在以前的筛选实验中未观察到这种非酶促酰化，以前的筛选实验在显著较 低的底物浓度(2mg/反应)和温度(30℃)下进行。这种非酶促反应保持了预期 的酰化选择性，因此需要进一步研究，因为可能根本不需要酶。

还值得指出的是，即使反应D和空白反应均具有相同的底物浓度 (60mg/反应)，空白反应也产生了较高比例的化合物4。这可能是由于在含 酶反应中当归酸酐2的上述消耗，其阻止了发生进一步酰化。

当归酸酯基向惕各酸酯基(tiglate)的异构化的检查

在某些条件下，当归酸酯基可异构化为惕各酸酯基(下图)。这种异构 化不是期望的，因此在酰化/脱酰化反应中检查惕各酸酯基的存在是重要 的。

当归酸酯基(Z-异构体)和惕各酸酯基(E-异构体)的结构

决定对AH-03和AH-08的反应D以及对不含酶的空白反应进行快速 纯化，以分离一些所合成的化合物4用于¹H NMR分析(因为粗NMR谱是 非常散乱的)。在所有三种情况中，化合物4通过硅胶色谱法进行分离(洗 脱剂梯度为100％己烷至85∶15己烷/EtOAc)。

图1显示了由AH-03的反应D分离的化合物4的¹H NMR谱。没有 观察到不期望的惕各酸酯基形成(对此将观察到特征信号～6.9ppm)。这对 于所有三个反应都是相同的。

实验ALM2232019-于30℃&50℃的底物装载

重复实验ALM2213213的条件，但是温度为30℃和50℃。这是为了 确定较高温度对于反应令人满意地进行是否是必要的，并且还为了观察在 较高温度下是否观察到较高比例的不期望的副产物。

对反应物以每日间隔取样以检测反应进程。6天后，将反应进行后处 理以获得均匀样品，通过HPLC进行分析。结果显示在表15A(对于30℃ 的反应)和表16(对于50℃的反应)中。

*针对在235nm的UV响应因子差异进行校正

表15A：实验ALM2232019最终分析结果概述(30℃)

*针对在235nm的UV响应因子差异进行校正

表16：实验ALM2232019最终分析结果概述(50℃)

再次，观察到所有在三乙胺存在下的反应进行地最快，但是具有不可 接受的高比例的不期望的副产物形成。

不出人意料的是，观察到30℃的反应进行地比50℃或60℃的反应慢 得多。在6天后没有反应达到完全。但是，所有含酶反应进行地比空白反 应更进一步，空白反应仍然含有～24％未反应的巨大戟二萜醇。这意味着， 非酶促酰化在较高温度进行地更好。确实，在一定温度后，酶的存在可能 简单地是不必要的。

50℃的反应给出了与60℃的反应非常类似的结果。再次，尽管具有相 同的底物浓度(60mg/反应)，空白反应给出了比反应D高的化合物4比例。 这可能是由于在含酶反应中当归酸酐2的上述消耗，其阻止了发生进一步 酰化。

实验ALM2232023-非酶促酰化的研究

上文所述的结果揭示，巨大戟二萜醇酰化形成化合物4(经由PEP025) 可以在没有酶的存在下在升高温度下发生。这需要进一步研究，因为有可 能研发出令人满意的用于合成化合物4的非酶促条件，由此降低了所需的 材料成本。

为了进一步研究该非酶促酰化，在较高温度(70℃和80℃)下进行了多 项实验。还研究了三乙胺的存在的影响(因为以前仅仅对于含酶反应进行过 检查)。

所有反应在含有2.5当量当归酸酐2和2-3片分子筛的0.5mL庚烷 中进行。研究了4种不同的反应条件：

反应A：60mg巨大戟二萜醇，70℃。

反应B：60mg巨大戟二萜醇+2当量Et₃N(48μL)，70℃。

反应C：60mg巨大戟二萜醇，80℃。

反应D：60mg巨大戟二萜醇+2当量Et₃N(48μL)，80℃。

将反应物磁力搅拌～65小时，然后观察到反应B&D显示为深棕色， 而反应A&C为浅黄色。初始TLC分析揭示反应B&D没有PEP025剩 余，这意味着已经完全酰化为化合物4(而对于反应A&C观察到PEP025)。 加入二氯甲烷(0.7mL)使反应物匀化，然后取样用于HPLC分析(表17)。 这揭示，反应B&D确实没有PEP025剩余，虽然形成了非常大比例的不 期望的和未鉴别的副产物(HPLC测定为～70％面积)。这明确地证明，三乙 胺的存在对于反应是有害的。

表17：实验ALM2232023最终分析结果概述

将反应A&C的PEP025与化合物4的比例与在大约相同时间长度 (～64-72小时)后的30℃、50℃和60℃的等同反应所观察到的比例进行比较 (表18)。这清楚地显示，非酶促二酰化的程度随着温度的增加而增加。

经过另外的反应时间，有可能获得PEP025至化合物4的完全转化。

温度(℃) PEP025与化合物4的比例 30 1∶1.33 50 1∶2.54 60 1∶3.18 70 1∶4.17 80 1∶4.46

表18：～64-72小时后在30℃、50℃、60℃和70℃的巨大戟二萜醇非酶促 酰化的PEP025与化合物4的比例的比较

1.2.实验ALM2232027-非亲核碱的影响

决定通过评价各种非亲核碱的存在的影响来进一步研究巨大戟二萜醇 的非酶促酰化。希望一种或多种这些碱将能够使得化合物4形成的水平最 大化，并且不导致不期望的当归酸酯基向惕各酸酯基的异构化。进行了5 种反应：

A)Cs₂CO₃

B)K₂CO₃

C)NaHCO₃

D)K₃PO₄

E)没有碱(用于比较)

反应在HPLC小瓶中进行，其含有下述物质：

·20mg巨大戟二萜醇

·2.5当量当归酸酐2(26.2mg)

·2当量碱

·2或3片分子筛

·0.5mL庚烷

将反应物于50℃振摇，～18小时后取样用于HPLC分析以检查反应进 程。对于所有反应观察到预期的二酰化。化合物4水平对于反应B和D是 最高的。反应A也显示出高水平的化合物4，但是伴随有较高百分比的不 期望的副产物。反应C显著慢于反应A、B和D。反应A-D均比不合碱的 反应E进行地更进一步。

使反应物于50℃振摇另外3晚，然后加入二氯甲烷(0.7mL)进行匀化。 各自取样(～30μL)，用直接氮气流蒸发，将残余物溶于25mM KH₂PO₄(pH 2.2)/乙腈的1∶1混合物中用于HPLC分析。结果显示在表19中。

表19：实验ALM2232027结果概述

清楚的是，碱的存在改善了转化为化合物4的水平，特别是K₂CO₃和K₃PO₄。各粗反应物的¹H NMR分析显示没有发生可检测到的当归酸酯 基向惕各酸酯基的异构化。

为了观察是否能够促使反应完全(即所有PEP025中间体转化为化合物 4)，重复了用K₂CO₃和K₃PO₄进行的反应，但是采用较大量的碱和酸酐(分 别2.4和3当量)。仅1晚后，两个反应均几乎完全。2晚后，将两个反应 进行后处理，通过HPLC进行分析(表20)。

表20：用较大量当归酸酐和K₂CO₃或K₃PO₄进行的实验ALM2232027结 果概述

反应F显示首先观察到PEP025中间体完全转化为化合物4。这伴随 有估计26.76％的未鉴定的副产物(其被指定为估计响应因子为1以有助于 计算)。

可以认定通过有机合成制备巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的多种不 同方式。以巨大戟二萜醇为原料，可以使用不同物质来引入当归酸酯基。 例如，活化的当归酸衍生物如当归酰氯。通过与当归酰氯反应进行的酯化 可以在没有激活剂的情况下进行，或者其可以在碱如吡啶或三乙胺、 LiHMDS或DMAP的存在下、在适宜溶剂如吡啶或THF中进行。另一种 激活的当归酸衍生物是当归酸酐。通过与当归酸酐反应进行的酯化可以在 没有催化剂的情况下进行，或者在酸性催化剂的存在下采用酸如高氯酸或 Lewis酸如三氟甲磺酸钪(III)或三氟甲磺酸铋(III)进行，或者在碱如碳酸氢 钠或三乙胺、LiHMDS、KHMDS、吡啶、碳酸铯或DMAP的存在下、在 适宜溶剂如THF、MeCN、吡啶或MTBE中进行。也可以使用混合酸酐， 例如当归酰基三氯苯甲酰基酸酐，例如2，4，6-三氯苯甲酰酸酐。可以在与上 文相同的条件下进行酯化反应。

在偶联试剂存在下的当归酸也可以是有用的。可以使用有或无催化剂 的碳二亚胺形式的偶联试剂如二环己基碳二亚胺、EDCI(N-(3-二甲基氨基 丙基)-N，-乙基碳二亚胺盐酸盐)。适宜的催化剂例如有1-羟基苯并三唑。其 它用于酯化的偶联试剂可以例如是2-卤代-1-烷基吡啶鎓盐如1-甲基-2-氯- 吡啶鎓碘化物或羟基苯并三唑衍生物如HBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’， N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐或HATU(N，N，N’，N’-四甲基.O.(7-氮杂苯并三唑 -1-基)脲鎓六氟磷酸盐或三嗪衍生物如DMTMM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三 嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物。适宜的溶剂可以是亚甲基氯、甲苯、DMF 或THF。

由巨大戟二萜醇化学合成巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的解释性实 例有：

将巨大戟二萜醇(348mg，1mmol)、当归酸酐(364mg，2mmol)和碳酸铯 (1.0g，3.1mmol)在乙腈(5mL)的混合物于室温搅拌1小时。将混合物用Et₂O 稀释，将所得混合物用H₂O洗涤。将水相用Et₂O萃取。将合并的有机相 经无水硫酸钠干燥，真空浓缩。将残余物经色谱法纯化(石油醚/乙酸乙酯 5∶1)，得到标题化合物(245mg，48％产率)，为泡沫。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ6.30-5.93(m，4H)，5.57(s，1H)，4.86(d，J＝ 12.6Hz，1H)，4.57(d，J＝12.6Hz，1H)，4.13(dd，J＝11.7，4.6Hz，1H)，3.90 (d，J＝6.6Hz，1H)，3.72(d，J＝6.7Hz，1H)，3.49(s，1H)，2.60-2.45(m，1H)， 2.27(ddd，J＝15.7，9.1，3.1Hz，1H)，2.01(dd，J＝7.3，2.0Hz，3H)，1.98-1.90 (m，6H)，1.90-1.85(m，3H)，1.79(d，J＝1.8Hz，3H)，1.77-1.70(m，1H)，1.08 (s，3H)，1.06(s，3H)，0.98(d，J＝7.2Hz，3H)，0.94-0.83(m，1H)，0.70(td，J ＝8.7，6.2Hz，1H)。

作为供选的实施方案，研究了如下反应途径：

在以化合物6为原料的以下实验中，研究了得到化合物7的水解酶反 应和得到最终产物的脱乙酰化反应。

将化合物6针对30种水解酶在四种不同溶剂(MTBE、庚烷、甲苯和 乙腈)中用当归酸酐2作为酰基供体进行筛选。所有筛选反应在HPLC小 瓶中进行。下文概括了通用的筛选条件。每个筛选反应含有：

·2mg化合物6

·1.5当量当归酸酐2(1.4mg)

·1小勺酶(如果是固体)或2滴酶(如果是液体)(估计～10-20mg)

·2或3片分子筛

·0.5mL溶剂

首先将酶和分子筛加入反应小瓶中。对于在MTBE、甲苯和乙腈(在其 中化合物6完全溶解)中的反应，然后加入化合物6和当归酸酐2在反应溶 剂中的溶液0.5mL。对于在庚烷(在其中化合物6不是完全溶解)中的反应， 将化合物6测量入各单独小瓶中，然后加入当归酸酐2在庚烷中的溶液 0.5mL。

将筛选反应物于30℃振摇66小时，然后通过TLC进行分析(洗脱剂 为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染色和加热而显影)，然后进行HPLC分 析(条件在第4节给出)。

对于在MTBE、庚烷和甲苯中的筛选反应，通过将反应小瓶在空气流 通的通风橱中敞口放置以使得反应溶剂蒸发，然后加入1.2mL25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈的1∶1混合物。充分混合后，将样品离心(于 13,200rpm达5分钟)以除去任意碎片，然后取上清液，通过HPLC进行 分析。该方法确保了HPLC记录准确显示不同反应组分的水平和避免了可 能产生于反应取样、特别是在其中一些组分的异质性将成为问题的溶剂中 的不准确性。对于在乙腈中的筛选反应，没有必要蒸发溶剂，因此加入 700μL25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈的1∶1混合物以稀释反应混合 物，然后离心，将上清液用于HPLC分析。

○筛选结果

·在MTBE中的筛选反应

在TLC分析后，立即清楚的是，没有发生任何显著程度的向化合物7 的预期转化。对反应取样，通过LC-MS进行分析，揭示副产物的量为430， 其相应于PEP005、PEP015或PEP025的量。进行加标研究后，该产物确 认为PEP025。

该产物的存在证明，化合物6上的伯乙酸酯基被酶促水解形成巨大戟 二萜醇，后者然后与当归酸酐2进行酰化形成PEP025。The spots of lowest  visible on the TLC位置上可见的最低R_F斑点通过TLC和HPLC分析被证 明是巨大戟二萜醇。流程5概括了这种不预期的反应序列。

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在用化合物6和当归酸酐2进行的水解酶筛选反应中发生的不期望的反应 序列

这表明，溶剂中水的水平足够高以允许发生酶促脱乙酰化，甚至在分子筛的存在下亦如此。应当注意，酶仅需要存在1当量的水以如此工作。 惯例上，乙酸酯基是容易通过酶促引入的保护基，但是相反地，它也可以 容易地除去。因此，考虑了用较大的酰基保护基(例如丁酸酯基)代替乙酸 酯基可阻止发生这种不期望的脱酰化(参见第7、8&9节)。

HPLC结果概括在表20中。省略了未给出转化的反应。

对于多数反应，观察到低水平的未鉴定的巨大戟二萜醇相关产物，其 保留时间为～4.90分钟。其被指定了估计相对响应因子为1以有助于计算转 化百分比。

表20：在MTBE中以当归酸酐2作为酰基供体用化合物6进行的筛选反 应概述

·在庚烷中的筛选反应

由于在庚烷中的异质性，对筛选反应取样用于TLC分析不能认为是各 种反应组分水平的可靠指示。将反应物通过HPLC进行分析，结果概括在 表21中。省略了未给出转化的反应。

多数反应显示存在低水平的两种未鉴定的巨大戟二萜醇相关产物，其 保留时间分别为～4.45和～4.90分钟。这些被指定了估计相对响应因子为1 以有助于计算转化百分比。

对于在MTBE中的筛选反应，由这些结果清楚的是，对于多数在庚烷 中的反应而言发生了不期望的化合物6酶促脱乙酰化形成巨大戟二萜醇。 在大多数情况中，然后发生不同程度的巨大戟二萜醇随后被当归酸酐2酰 化，形成多种不同产物(主要是PEP025)。

用AH-17、AH-32、AH-33和AH-37进行的反应显示，化合物6转化 为化合物7并且没有任何明显的同时脱乙酰化为巨大戟二萜醇。但是，转 化水平是低的(～4-7％)。

表21：在庚烷中以当归酸酐2作为酰基供体用化合物6进行的筛选反应的 概述

在甲苯中的筛选反应

HPLC结果概括在表22中。省略了未给出转化的反应。

再次，清楚的是，对于多数反应，发生了不期望的化合物6酶促脱乙 酰化，并且发生了不同程度的随后被当归酸酐2酰化，主要是形成PEP025。

但是，用AH-17、AH-24、AH-32、AH-33和AH-48进行的反应显示 出化合物6选择性酰化为化合物7并且转化为～14-22％的证据，没有同时 脱乙酰化为巨大戟二萜醇的任何证据(虽然所有5个反应也显示存在保留时 间为～4.90分钟的未知副产物)。这些是迄今为止对于该途径的最鼓舞人的 结果。令人感兴趣的是，这些酶各自以前已经显示出在乙腈中使巨大戟二 萜醇选择性酰化为PEP005的能力，虽然是以非常低的水平(＜5％转化)。

表22：在甲苯中以当归酸酐2作为酰基供体用化合物6进行的筛选反应的 概述(最有前景的结果突出显示)

1.2.1.在乙腈中的筛选反应

HPLC结果概括在表23中。省略了未给出转化的反应。没有反应显示 出显著程度的化合物7形成。

表23：在乙腈中以当归酸酐2作为酰基供体用化合物6进行的筛选反应的 概述

1.3.在甲苯中的筛选反应的进一步研究

用化合物6进行的最具有前景的筛选反应是用水解酶AH-17、AH-24、 AH-32、AH-33和AH-48在甲苯中进行。这些反应显示出化合物6选择性 酰化为化合物7并且转化为～14-22％的证据，没有同时脱乙酰化为巨大戟 二萜醇的任何证据(虽然所有5个反应也显示存在保留时间为～4.90分钟的 未知副产物)。因此，进行了一些进一步的研究。

1.3.1.温度试验

决定用水解酶AH-17、AH-24、AH-32、AH-33和AH-48在甲苯中于 30℃、40℃和50℃进行反应以观察是否可以进一步推动向化合物7转化的 水平。

反应条件与第6.1节中所述相同(除了反应温度不同)。将反应物振摇 90小时，然后通过TLC进行分析(洗脱剂为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸 染色和加热而显影)。仅观察到淡的化合物7斑点。通过用直接氮气流快速 蒸发甲苯、然后将残余物溶于25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈的1∶1 混合物中，将反应物制备用于HPLC分析。将该溶液离心(5分钟，13,200rpm) 以除去任何碎片，然后分析上清液。

结果概括在表24中。

令人惊讶的是，对于所有反应，发现向化合物7的转化为＜1％。这与 以前在初始筛选反应中所观察到的转化(14-20％)是非常不同的。两组实验 之间的唯一差别(除了温度改变)是初始筛选在空气流通的通风橱中于室温 缓慢蒸发2天，然后用于制备HPLC样品，而温度实验是用直接氮气流快 速蒸发。据信，随着初始筛选中甲苯水平缓慢降低，浓度增加至反应更快 进行的点，甚至在没有搅拌或升高温度下亦如此。该假设得到了筛选反应 的初始TLC分析的支持，其中化合物7的斑点比转化一直到20％所预期 的斑点淡。这提示当进行初始TLC分析时转化低得多。

因此，决定在较高浓度下进行一些实验以对其进行研究(参见第6.3.2 和6.3.3节)。

表24：采用水解酶AH-17、AH-24、AH-32、AH-33和AH-48在甲苯中用 化合物6进行的温度实验概述

1.3.2.高浓度实验-设置1

在温度实验后，决定采用这5种酶以高得多的化合物6浓度(初始筛选 反应的浓度的10倍，即20mg/反应)进行反应。酶装载(50％w/w，就而言化 合物6)也成比例地比初始筛选反应低得多，因为非常高的酶装载对于较大 规模合成将不是优选的。

所有反应在HPLC小瓶中进行。条件如下文所概括。各筛选反应含有：

·20mg化合物6

·1.2当量当归酸酐2(11.2mg)

·10mg酶(精确称量)(50％w/w)

·2或3片分子筛

·0.5mL甲苯

首先将酶、化合物6和分子筛加入反应小瓶中，然后加入当归酸酐2 在甲苯中的溶液0.5mL。将反应物于30℃振摇过夜(18小时)，然后取30μL 样品。将该样品通过直接氮气流蒸发，然后重新溶于25mM KH₂PO₄(pH 2.2)/乙腈的1∶1混合物中，离心(5分钟，13,200rpm)以除去碎片，用于HPLC 分析。令人失望的是，所有反应的转化为＜1％。因此，决定增加温度至50℃ 并允许反应继续，周期性地取30μL样品用于HPLC分析。结果概括在表 25中。

可以看到，化合物7的水平在温度增加至50℃后随时间推移而稳定增 加，虽然反应速率是慢的(最快的用AH-33进行的反应在19天后达到～42％ 转化)(图8)。另外，观察到处于～4.90分钟的未鉴定的巨大戟二萜醇相关副 产物随时间推移而显著增加，在19天后达到高至～20-31％。

表25：采用水解酶AH-17、AH-24、AH-32、AH-33和AH-48(50％w/w) 在甲苯中用化合物6进行的高浓度实验概述

1.3.3.高浓度实验-设置2

在设置1的结果后，以相同的高浓度的化合物6(20mg/反应)、但是以 较大的酶装载(40mg/反应，即200％w/w，就化合物6而言)进行进一步实 验。对于水解酶介导的反应而言在如此高的酶装载下进行是不通常的，并 且酶的成本贡献可以是相对低的。

将反应物于50℃振摇，周期性地取30μL样品用于HPLC分析。结果 概括在表26中。

表26：采用水解酶AH-17、AH-24、AH-32、AH-33和AH-48(200％w/w) 在甲苯中用化合物6进行的高浓度实验概述

再次，观察到化合物7形成水平随时间推移而稳定增加。虽然反应速 率显著快于用50％(w/w)酶装载进行的相应反应，但是转化在11天后仍然 是令人不满意的(图9)。再次，观察到处于～4.90分钟的未鉴定的巨大戟二 萜醇相关副产物的水平随时间推移而显著增加，用AH-48在11天后达到 高至～25％。

化合物6的筛选反应揭示：在很多情况中，伯乙酸酯基被酶促水解形 成巨大戟二萜醇，后者然后与当归酸酐2进行酰化，主要形成PEP025。 该反应序列使得伯乙酸酯基作为保护基是无效的。

惯例上，乙酸酯基是容易通过酶促引入的保护基，但是相反地，它也 可以容易地除去。考虑了不同的可能性：用较大的酰基保护基替换该乙酸 酯基将阻止该不期望的脱酰化发生。因此，决定进行化合物8和10和12 的筛选反应，其中20位伯羟基分别被丁酸酯、新戊酸酯或苯甲酸酯所保护。

化合物8的合成

将巨大戟二萜醇(300mg，0.861mmol)和一大刮铲分子筛一起加入 50mL falcon试管中，然后加入水解酶AH-04(1g)和丁酸乙烯酯(1.97g， 17.22mmol，20当量)在MTBE(25mL)中的溶液。将试管密封，于30℃振 摇66小时，然后进行TLC分析(洗脱剂为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染 色和加热而显影。

这显示，反应已经基本进行完全(对于剩余原料仅有非常淡的斑点)。 然后将反应混合物过滤以除去酶和吸收在硅胶(～1g)上，然后经硅胶色谱法 纯化(洗脱剂梯度由100％己烷至7∶3己烷/EtOAc)，得到化合物8(329mg， 0.786mmol，91％产率)，为浅黄色胶状物。

化合物10的合成

将巨大戟二萜醇(300mg，0.861mmol)和一大刮铲分子筛一起加入 50mL falcon试管中，然后加入水解酶AH-04(1g)和新戊酸乙烯酯(2.21g， 17.22mmol，20当量)在MTBE(25mL)中的溶液。将试管密封，于37℃振 摇17小时，然后进行TLC分析(洗脱剂为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染 色和加热而显影)。

这显示，反应已经基本进行完全(对于剩余原料仅有非常淡的斑点)。 然后将反应混合物过滤以除去酶和吸收在硅胶(～1.5g)上，然后经硅胶色谱 法纯化(洗脱剂梯度由100％己烷至7∶3己烷/EtOAc)，得到化合物10 (271mg，0.627mmol，73％产率)，为浅黄色胶状物。

通过如下操作制备化合物12。

将巨大戟二萜醇(260mg，0.746mmol)和一大刮铲分子筛一起加入 50mL falcon试管中，然后加入水解酶AH-04(1g)和苯甲酸乙烯酯(2.21g， 14.92mmol，20当量)在MTBE(25mL)中的溶液。将瓶密封，于37℃振摇 16小时，然后进行TLC分析(洗脱剂为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染色 和加热而显影)。这显示，反应已经基本进行完全(对于剩余原料仅有非常 淡的斑点)。然后将反应混合物过滤以除去酶和吸收在硅胶(～1.5g)上，然后 经硅胶色谱法纯化(洗脱剂梯度由100％己烷至1∶1己烷/EtOAc)，得到化合 物12(301mg，0.665mmol，89％产率)，为浅黄色胶状物。

筛选条件

在两种不同溶剂(MTBE和甲苯)中用当归酸酐2作为酰基供体针对30 种水解酶筛选了化合物8、10和12。所有筛选反应在HPLC小瓶中进行。 下文概括了通用的筛选条件。各筛选反应含有：

·2mg化合物8

·1.5当量当归酸酐2(1.31mg)

·1小勺酶(如果是固体)或2滴酶(如果是液体)(估计～10-20mg)

·2或3片分子筛

·0.5mL溶剂

首先将酶和分子筛加入反应小瓶中，然后加入化合物8和当归酸酐2 在反应溶剂中的溶液0.5mL。

将筛选反应物根据原料于约30-40℃振摇64-138小时，然后通过TLC 进行分析(洗脱剂为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染色和加热而显影)。

筛选结果

在MTBE中的筛选反应

立即清楚的是：向预期化合物的预期转化未以任何可辨别的水平发生。 清楚的是，很多酶已经使得伯保护基(在此情况中，丁酸酯基)酶促水解形 成巨大戟二萜醇，后者然后与当归酸酐2酰化形成PEP025。TLC中可以 清楚地看到巨大戟二萜醇和PEP025的斑点。这证明，用丁酸酯基代替伯 乙酸酯基就水解稳定性而言未赋予可辨别的优点。

在甲苯中的筛选反应

如在MTBE中的筛选反应那样，清楚的是，很多酶已经使得20-酰基 保护基酶促水解形成巨大戟二萜醇，后者然后与当归酸酐2酰化形成 PEP025。可辨别出一些可能相应于预期产物的足够高的R_F的非常淡的斑 点，虽然其水平被认为是非常不显著的。

由巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯脱酰化

在含有20％H₂O的有机溶剂中进行的脱酰化筛选

在含有20％H₂O(作为25mM KH₂PO₄缓冲液，pH5)的有机溶剂(乙腈 或MTBE)中用30种不同的水解酶进行了初始的脱酰化筛选反应。各筛选 反应含有如下物质：

2mg巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯

1小勺酶(如果是固体)或2滴酶(如果是液体)

0.4mL有机溶剂

0.1mL KH₂PO₄缓冲液(25mM，pH5)

首先将酶加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在 有机溶剂中的贮备液0.4mL，然后加入0.1mL25mM KH₂PO₄缓冲液(pH 5)。

将筛选反应物于28-30℃振摇3-4天，然后通过TLC进行分析(洗脱剂 为1∶1EtOAc/庚烷，通过磷钼酸染色和加热而显影)。

在含20％H₂O的乙腈中的脱酰化筛选反应

将反应物于28℃振摇17小时，然后通过TLC进行分析。未观察到脱 酰化产物的斑点，因此继续振摇另外77小时，通过TLC再次分析反应物。

总共3个反应(06、09&24)显示出现相应于巨大戟二萜醇-3-当归酸酯 的R_F的淡斑点。HPLC分析显示确实如此，虽然转化水平非常低。在所有 3个反应中观察到另一种巨大戟二萜醇相关副产物(在～291nm显示出特征 性UV吸收)。据信这符合在巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯下的TLC斑点 (尤其是对于用03和04进行的反应而言是可见的)。对反应物进行HPLC 分析证实确实如此。

以前在阳离子型表面活性剂CTAB的存在下用当归酸酐和水解酶54 进行的巨大戟二萜醇酰化反应中观察到该化合物，其暂时被鉴定为二酰化 化合物5。其被指定了估计相对响应因子为1以有助于计算转化百分比。

化合物5的存在将意味着在这些条件下发生了酰基迁移。

表27显示了采用方法B结果用于筛选反应的HPLC概述。

表27：在含有20％H₂O的乙腈中的巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的脱酰 化筛选反应的结果概述

在含20％H₂O的MTBE中的脱酰化筛选反应

将反应物于30℃振摇94小时，然后通过TLC进行分析。

表28：在含有20％H₂O的MTBE中进行的巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸 酯的脱酰化筛选反应的结果概述

在含有5％亲核试剂的MTBE中进行的脱酰化筛选

采用这三种酶在含有5％(v/v)亲核试剂用于脱酰化的MTBE中进行了 一系列进一步的筛选反应。所研究的三种亲核试剂是水(用于通过水解来脱 酰化)、乙醇和丁醇(用于通过酯交换来脱酰化)。使用了较大的酶装载(以前 量的3倍)。

各筛选反应含有如下物质：

2mg巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯

3小勺酶

475μL MTBE

25μL KH₂PO₄缓冲液(25mM，pH5)，EtOH或BuOH

首先将酶加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在 MTBE中的贮备液475μL，然后加入25μL亲核试剂。将反应物于30℃振 摇40小时，然后取100μL反应混合物用于HPLC分析。使反应继续另外 77小时，然后再次通过HPLC进行分析。

通过使溶剂在空气流通的通风橱中蒸发或者吹氮气流、然后将残余物 溶于100μL DMSO中和用～1mL的25mM KH₂PO₄缓冲液(pH2.2)/乙腈 (1∶1)稀释来制备HPLC样品。将其充分混合，然后经由含有脱脂棉栓的玻 璃吸管过滤入HPLC小瓶中。

结果概括显示在表29中。

表29：在含有5％H₂O、EtOH或BuOH作为亲核试剂的MTBE中用06、 AH09&24进行的巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的脱酰化筛选反应的结 果概述

用丁醇作为亲核试剂在不同溶剂中进行的脱酰化筛选

各反应含有：

1mg巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯

1小勺06

487.5μL溶剂+12.5μL丁醇(2.5％v/v)

或475μL溶剂+25μL丁醇(5％v/v)

或450μL溶剂+50μL丁醇(10％v/v)

研究了6种溶剂：

MTBE

甲基-THF

乙酸乙酯

乙腈

庚烷

甲苯

(巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在所有6种溶剂中是可溶的)。

首先将酶加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在 溶剂中的贮备液450μL，然后加入丁醇(12.5μL、25μL或50μL)。按需要 将反应物用溶剂补足至500μL总体积。将反应物于30℃振摇总共160小时 (7天)，在40小时和112小时后取100μL样品用于HPLC分析，然后进 行最终分析。

结果概述显示在表30中。

采用上述那些平行地进行了这些反应。

表30：在含有丁醇作为亲核试剂的各种溶剂中用06进行的巨大戟二萜醇 -3，20-二当归酸酯的脱酰化筛选反应的结果概述

在含有各种醇作为亲核试剂的MTBE中的脱酰化筛选

采用较长链的醇作为亲核试剂用于脱酰化在MTBE中用06进行了如 下实验。醇的量也是变化的。

各反应含有：

1mg巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯

1小勺06

487.5μL MTBE+12.5μL醇(2.5％v/v)

或475μL MTBE+25μL醇(5％v/v)

或450μL MTBE+50μL醇(10％v/v)

研究了3种醇作为亲核试剂用于脱酰化：

1-戊醇

1-己醇

1-辛醇

首先将酶加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在 MTBE中的贮备液450μL，然后加入适当的醇(12.5μL，25μL或50μL)。按 需要将反应物用MTBE补足至500μL总体积。将反应物于30℃振摇总共 160小时(7天)，在40小时和112小时后取100μL样品用于HPLC分析， 然后进行最终分析。

结果概述显示在表31中。还加入了在丁醇存在下的反应的结果(来自 第11.3节)用于直接比较。

采用第11.3节所述的那些平行地进行了这些反应。

表31：在含有丁醇、戊醇、己醇或辛醇作为亲核试剂的MTBE中于30℃ 用06进行的巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的脱酰化筛选反应的结果概述 在含有各种醇作为亲核试剂的庚烷中的脱酰化筛选

用1％和2.5％(v/v)醇进行如下反应。

各反应含有：

1mg巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯

1小勺06

495μL MTBE+5μL醇(1％v/v)

或487.5μL MTBE+12.5μL醇(2.5％v/v)

研究了4种醇作为亲核试剂用于脱酰化：

1-丁醇

1-戊醇

1-己醇

1-辛醇

首先将酶加入反应小瓶中，然后加入巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯在 庚烷中的贮备液，然后加入适当的醇(12.5μL或5μL)。将反应物于50℃振 摇总共136小时(6天)，在64小时后取150μL样品用于HPLC分析，然后 进行最终分析。

结果概述显示在表32中。

表32：在含有丁醇、戊醇、己醇或辛醇作为亲核试剂的庚烷中于50℃用 06进行的巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯的脱酰化筛选反应的结果概述

经由巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯单罐合成巨大戟二萜醇-3-当归酸酯的 研究

反应含有如下物质：

8mg巨大戟二萜醇

2.5当量当归酸酐2(0.48mg)

5小勺54

8片分子筛

50mg CTAB(2.5％w/v)

2mL庚烷

将反应物于50℃振摇70小时，然后取200μL样品用于HPLC分析。 (注释：对于该实验，固体表面活性剂被简单地加入反应混合物中，如同以 前用54进行的表面活性剂实验那样(参见第8节)。酶未通过用表面活性剂 溶液冷冻干燥进行预配制)

结果概括在表33中。

表33：在含有2.5％(w/v)阳离子型表面活性剂的庚烷中用水解酶54进行 的巨大戟二萜醇反应的概述

将剩余的反应混合物通过含有脱脂棉栓的玻璃吸管过滤以除去水解酶 54。然后将水解酶06和辛醇(20μL，1％v/v)一起加入滤液中，将其于50℃ 振摇以将巨大戟二萜醇-3，20-二当归酸酯脱酰化为巨大戟二萜醇-3-当归酸 酯。在21小时和44小时(分别为91小时和114小时总反应时间)后取样用 于HPLC分析。将数据绘图并显示在图1中。

在非常稀释的条件(1mg底物/反应)下以高的酶装载(1小勺-不是精确 测量的)进行这些以前的筛选实验。发现1小勺AH-06是～20mg，因此酶装 载就底物而言为～2000％w/w。清楚的是，这对于PEP005的放大规模合成 而言是不可接受的高酶装载。因此，有必要建立可以在较高底物浓度下用 较低酶装载完成预期脱酰化的条件。

用于LEO的立即目标是为了测定能够证明可以达到化合物4向 PEP005的完全转化和能够以良好产率分离PEP005的精确实验条件。在此 阶段，没有要求最优化条件。这可以在以后的阶段完成。

1.4.实验ALM2232031-用AH-06进行的初始10mg反应

以10mg规模(是筛选浓度的10倍)和用50％或100％w/w酶装载(显著 低于筛选反应)进行了6个实验的初始设置。

在HPLC小瓶中进行反应，其含有如下物质：

·10mg化合物4

·水解酶AH-06(50％或100％w/w)

·辛醇(1％，2％或5％v/v)

·庚烷(0.5mL)

修改如下：

A)5mg AH-06(50％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

B)5mg AH-06(50％w/w)+10μL辛醇(2％v/v)

C)5mg AH-06(50％w/w)+25μL辛醇(5％v/v)

D)10mg AH-06(100％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

E)10mg AH-06(100％w/w)+10μL辛醇(2％v/v)

F)10mg AH-06(100％w/w)+25μL辛醇(5％v/v)

将反应物于50℃振摇，间隔取样用于HPLC分析(表34)。

所有反应呈现出非常低的转化为PEP005。7天后，最高转化仅为 ～3.2％。清楚的是，50％和100％w/w酶AH-06装载是太低了。

表34：实验ALM2232031结果概述

1.5.实验ALM2232035-用AH-06进行的2mg反应

以2mg规模用不同的水解酶AH-06装载进行了多个脱酰化反应。另 外，重复进行了以前给出最佳的转化为PEP005的速率的初始筛选反应以 确认重现性。所有反应在含有5μL辛醇(1％v/v)的0.5mL庚烷中进行。

反应条件如下：

G)初始筛选反应的重复：1mg化合物4+1小勺AH-06(～20mg)。

H)2mg化合物4+4mg AH-06(200％w/w)。

J)2mg化合物4+10mg AH-06(500％w/w)。

K)2mg化合物4+20mg AH-06(1000％w/w)。

L)2mg化合物4+30mg AH-06(1500％w/w)。

将反应物于50℃振摇，间隔取样用于HPLC分析(表35)。不幸的是， 反应K的内容物从反应容器中泄漏，所以未获得结果用于1000％w/w。

表35：实验ALM2232035结果概述

10天后，反应G和L均达到＞98％转化为PEP005。但是，反应H (200％w/w酶)和J(500％w/w酶)分别仅达到～5％和～27％转化。

1.6.实验ALM2232039-用AH-06进行的5mg&10mg反应

在实验ALM2232035(参见第11.2节)后，以较高底物浓度(5mg或 10mg/反应)用500％或1500％水解酶AH-06装载(以直接与实验J和L的 结果进行比较)进行反应。所有反应在0.5mL庚烷中进行。

反应条件如下：

M)5mg化合物4+25mg AH-06(500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

N)10mg化合物4+50mg AH-06(500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

P)5mg化合物4+75mg AH-06(1500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

R)10mg化合物4+150mg AH-06(1500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

进行另外两个反应以评价改变％辛醇是否对反应速率具有显著影响。 这些反应直接与反应M比较。

S)5mg化合物4+25mg AH-06(500％w/w)+2.5μL辛醇(0.5％v/v)

T)5mg化合物4+25mg AH-06(500％w/w)+12.5μL辛醇(2.5％v/v)

将反应物于50℃振摇，间隔取样用于HPLC分析(表36)。

反应M、N、S和T均以非常相似的速率进行，7天后达到～40-45％转 化。如预期那样，反应P和R(1500％w/w酶装载)是显著较快的，5天后 均达到＞95％转化。反应R(10mg底物)显示以比反应P(5mg底物)快的速 率进行，它们均比反应L(2mg底物)快。这表明较高底物浓度是优选的。

通过比较反应M、S和T，没有显示在辛醇浓度(％v/v)和反应速率之 间有显著相关性。

表36：实验ALM2232039结果的概述

1.7.实验ALM2232043-用AH-09&AH-24进行的另外反应

初始筛选工作鉴定了三种水解酶，它们显示出将化合物4选择性脱酰 化形成预期产物PEP005的证据。它们是AH-06、AH-09和AH-24(这三 者均衍生自皱落假丝酵母)。在工作前期(项目0741A0020B)，AH-06被选 择用于进一步研究，因为当采用5％(v/v)丁醇作为酯交换亲核试剂时观察 到高转化。稍后发现，对于反应而言，1％(v/v)辛醇是较好的亲核试剂。

由于用AH-09和AH-24进行的有限的在先研究，决定用这些酶、用 5mg化合物4在0.5mL庚烷中、在1％(v/v)丁醇、己醇或辛醇的存在下进 行一些另外的实验。进行了6个实验：

U)25mg AH-09(500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

V)25mg AH-24(500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

W)25mg AH-09(500％w/w)+5μL丁醇(1％v/v)

X)25mg AH-24(500％w/w)+5μL丁醇(1％v/v)

Y)25mg AH-09(500％w/w)+5μL己醇(1％v/v)

Z)25mg AH-24(500％w/w)+5μL己醇(1％v/v)

将反应物于50℃振摇，间隔取样用于HPLC分析(表37)。

表37：实验ALM2232043结果概述

反应U、W和Y均显示转化为PEP005，证明水解酶AH-09能够接受 辛醇、己醇和丁醇作为酯交换亲核试剂。当采用AH-06时，发现辛醇是最 佳的亲核试剂(反应U)，6天后达到～92％转化。用AH-06(500％w/w装载) 进行的等同反应在6天后仅达到35-40％转化。确实，为了采用AH-06在 相同时间达到＞90％转化，需要高得多的1500％(w/w)的装载。

因此，清楚的是：对于化合物4的选择性脱酰化而言，AH-09是更有 效的酶，给出了显著高于等同装载的AH-06的反应速率。

反应V、X和Z显示，AH-24不接受辛醇或己醇作为酯交换亲核试剂 用于反应，但是确实接受丁醇。然而，反应速率显著低于用AH-09和辛醇 获得的反应速率。

1.8.实验ALM2232047-用AH-09进行的进一步反应

实验ALM2232043(反应U)显示：对于化合物4的脱酰化而言，水解 酶AH-09是比AH-06更有效的酶。因此，进行了大量后续实验以进行进 一步研究。反应AA和AB与反应U相同，但是采用不同量的辛醇(分别为 0.5％和2.5％v/v)。反应AC的底物浓度是反应U的两倍。所有反应在0.5mL 庚烷中进行。

AA)5mg化合物4+25mg AH-09(500％w/w)+2.5μL辛醇(0.5％v/v)

AB)5mg化合物4+25mg AH-09(500％w/w)+12.5μL辛醇(2.5％v/v)

AC)10mg化合物4+50mg AH-09(500％w/w)+5μL辛醇(1％v/v)

将反应物于50℃振摇，间隔取样用于HPLC分析(表38)。

表38：实验ALM2232047结果概述

所有三个实验进行地非常好，66小时后达到～95％转化为PEP005。这 比以前观察的任何反应都快。各反应之间的速率差异是较小的，虽然反应 AC(其底物浓度翻倍(10mg/反应))达到了最佳的速率。这意味着较高的底 物浓度对于反应速率是有利的。

反应AA和AB意欲直接与反应U(实验ALM2232043)相当，但是均 显示出显著较快的反应速率。不认为这归因于辛醇装载的差异，而是反应 U采用了水解酶AH-09的较老样品进行。

决定改变反应AC的条件用于＞100mg的放大规模试验。

1.9.实验ALM2232051-PEP005的放大规模反应&分离

进行123.9mg规模的化合物4酶促脱酰化，随后分离PEP005。反应 条件由用于反应AC(实验ALM2232047)的那些修改。

将化合物4(123.9mg，0.242mmol)和水解酶AH-09(620mg，500％w/w) 测量入8mL玻璃小瓶中。加入庚烷(5mL)，然后加入1-辛醇(50μL，1％v/v)。 将小瓶密封，于50℃在轨道温育器中于190rpm振摇。每日取样(20μL)进 行HPLC分析以监测反应进程。71小时后，反应已经达到97％转化。进 行硅胶色谱法(洗脱剂梯度由100％己烷至3∶2己烷/EtOAc)，得到清澈的玻 璃状固体，将其在真空中静置过夜以除去溶剂痕迹。刮下后，得到PEP005， 为白色固体(95mg，0.221mmol，91％产率-ALM2232051-1)。

进行该物质的最终HPLC分析并与空白样品比较(均在相同批次的1∶1 25mM KH₂PO₄(pH2.2)/乙腈中制得)。将在空白记录中未出现的所有峰整 合，得到最终PEP005面积百分比为96.97％。

ALM2232051-1的¹H NMR分析显示和预期一样。重要的是，在酶促 反应条件下没有发生不期望的当归酸酯基向惕各酸酯基的异构化。