基于JCV-病毒样颗粒的新型药物递送系统

摘要

本发明涉及装载药物(负荷物)的、衍化自人多瘤病毒的病毒样颗粒VLP，其作为药物递送系统用于转运所述药物到中枢神经系统，特别是活人的中枢神经系统。

说明书

技术领域

本发明涉及人多瘤病毒类病毒样颗粒(VLP)用作药物递送系统的用途。

技术背景

现代药物领域的一个巨大挑战是药物递送。将药物递送至所选的作用位点 (例如，所选器官、组织、细胞类型或细胞的微室，等)被称为药物靶向。即使 全身用药，通过药物靶向增加该特定位点的药物浓度也成为可能。另外，相对 于普通的全身用药，身体的其它部位并不或者仅较低程度地暴露于药物。这导 致不良副作用的风险降低和允许更高剂量的药物。进一步地，极毒性药物(例 如，用于癌症治疗的细胞毒素剂)可能第一次可用于人类，原因是它们的毒副 作用被药物递送系统最小化。在某些情况下，由于药物被递送方式所保护，药 物靶向另外的优点是防止药物过早失活(代谢)、不希望的吸收、排泄或不希望 的修饰。

由于活性成分首先必须通过血脑屏障，之后必须到达靶细胞，将药物递送 至中枢神经系统(CNS)，尤其是大脑，是一项巨大挑战。

血脑屏障由毛细血管的内皮形成。这些内皮细胞通过所谓“紧密连接”相 互紧紧连接在一起，从而防止特定分子量以上的物质进入中枢神经系统。血脑 屏障因此提供有效的保护屏障。血脑屏障一方面保证向中枢神经系统供给营养， 另一方面能够从中枢神经系统清除新陈代谢产物。

转运亲水物质通过血脑屏障是主要的关注点。接近95％的所有体外有效的 药物候选物不能以药理活性浓度通过血脑屏障。因此，为了在中枢神经系统内 达到药物的足够药理浓度，许多中枢神经系统疾病如脑肿瘤或中枢神经系统感 染的治疗，要求药物的高血浆浓度。这包括了不良副作用的风险。因此在药物 学研究中寻找提高转运药物(尤其是亲水物质)通过血脑屏障进入中枢神经系 统的方式。

一些方法使用亲脂颗粒，其允许受体介导转运通过血脑屏障。出于这样的 目的，例如，特别已经开发了纳米颗粒转运系统。纳米颗粒通常由聚合物组成， 大小为10-1000纳米。通常，它们是表面修饰的。

这些纳米颗粒经常面临这样的问题，它们被血脑屏障中表达的外排泵排出 中枢神经系统。并且，纳米颗粒被证明其影响血脑屏障的完整性(Rempe等， Biochem Bioph Res Comm 2011，406(1)：64-69)。于是，血脑屏障的防御功 能被置于危险中，包括不希望的物质体或感染性物质体进入中枢神经系统引起 副作用的危险。该显著的缺点对于纳米颗粒作为药物递送系统的临床应用是关 键的。

其它可能的药物传递系统在讨论中。例如，已知与编码β-半乳糖苷酶的 DNA相结合的、来自小鼠多瘤病毒VP1蛋白的假衣壳能够用于在静脉施用后递 送该DNA到大脑，导致在大脑内表达β-半乳糖苷酶(Krauzewicz等，Gene  Therapy 2000，7，1094-1102；也可以参见WO 98/48841 A1)。但是，这些发 现没有提供对病毒样颗粒的适合性的充分观察，尤其是对来自人多瘤病毒并装 载负荷物、作为药物递送系统用于中枢神经系统的病毒样颗粒。

因此，本发明的目的是提供允许药物转运至中枢神经系统细胞的药物递送 系统，即，通过血脑屏障的药物递送。

发明概述

发明人发现在基于原代猪内皮细胞的血脑屏障模型中，装载编码报告蛋白 的核酸的人JC病毒来源的病毒样颗粒能够通过血脑屏障，递送核酸到中枢神经 系统细胞，在此核酸被表达。该模型被认为代表体内生理完整的血脑屏障。因 此，证明了病毒样颗粒，而不仅仅是单独的活性物质，通过血脑屏障并进入中 枢神经系统。因此，来自人多瘤病毒并装载有负荷物的病毒样颗粒适于作为药 物递送系统进入中枢神经系统，特别是进入大脑。

发明人进一步发现载药的病毒样颗粒的通过不要求，也不会导致血脑屏障 完整性的丧失或增加的渗透性。因此，病毒样颗粒不实质影响血脑屏障的完整 性。因此病毒样颗粒能够用作进入中枢神经系统的药物递送系统，而不存在由 于不希望的物质体或感染性物质体进入中枢神经系统引起不良副作用的巨大危 险。

根据本发明，来自人多瘤病毒并装载负荷物的病毒样颗粒用于与负荷物一 起通过血脑屏障。重要地是，病毒样颗粒通过血脑屏障能够使病毒样颗粒展示 其靶向大脑中特定细胞群的功能，即，递送负荷物到靶细胞。在本发明的上下 文中，所述递送包括递送到靶细胞、递送到靶细胞内部，或递送进入靶细胞。 因此根据本发明，功能性病毒样颗粒与负荷物一起通过血脑屏障。

负荷物，优选活性物质，优选完全封装在病毒样颗粒的衣壳中。但这不排 除病毒样颗粒可额外与活性物质结合，例如，通过将活性物质结合于衣壳的外 部结构的方式。一些活性物质分子甚至可以不完全地封装在衣壳内。但是，至 少活性物质的一部分分子完全封装在衣壳内。

因此根据本发明，来自人多瘤病毒的病毒样颗粒和活性物质的组合物被提 供用作药物递送系统，其中活性物质(负荷物)总量的至少1％，至少2％，至 少3％，至少5％，至少7％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％， 至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，更优选至少70％，至少75％， 至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少 99％或100％被封装在病毒样颗粒的衣壳内。

在本发明最优选实施方式中，组合物的病毒样颗粒是非聚集的。非聚集意 味着当悬浮于水中时，病毒样颗粒能够形成分散的颗粒。

因此本发明的一个方面，提供了允许共转运病毒样颗粒和活性物质的用于 中枢神经系统的药物递送系统。转运可以是主动的或被动的。有趣的是，发明 人进一步发现病毒样颗粒不被或基本上不被血脑屏障的外排转运体清除出中枢 神经系统。

本发明的病毒样颗粒不需要表面处理或使用辅助剂，以有效通过血脑屏障 和进入中枢神经系统。因此，本发明的一个方面，药物递送系统具有微粒结构， 不需要任何进一步的表面处理或修饰，也不需要使用辅助剂。该药物系递送统 优选是无细胞的。

如上所述，根据本发明，病毒样颗粒用于进入中枢神经系统，特别是进入 大脑的药物递送。该进入大脑的递送使药物能够靶向特定细胞，例如，利用人 多瘤病毒(特别是JC病毒)的天然趋化性。

发明详述

衍化自人多瘤病毒，特别是JC病毒的病毒样颗粒(VLP)，根据本发明，用 于优选含有至少一种VP1的药物递送。VLP优选由装配成五聚体结构的VP1构 建的衣壳组成。优选地，VLP由几种VP1组成，特别是几种VP1五聚体，尤其 是72 VP1五聚体。但是，VLP可选地含有插入到衣壳的其它分子。装配成VLP 的结构分子既可以与天然多瘤病毒蛋白相同，也可以被修饰以优化VLP的特征。

进一步地，根据本发明的VLP还含有装载负荷物。在本发明特别优选的实 施方式中，负荷物总量的大部分完全封装在衣壳内。为了描述负荷物分子被VLP 完全封装，使用术语“装载”。因此，“装载VLP”指有完全封装负荷物的VLP。

所述装载负荷物可以是装在衣壳包围的空间内的任何分子或组合物。优选 的，装载负荷物是细胞毒素剂、可检测试剂如放射性核素、蛋白、肽或核酸， 尤其是选自编码所需蛋白的核酸如mRNA、cDNA、质粒或载体、抑制性核酸如 siRNA或miRNA，和具有催化活性的核酸如核酶组成的组。装载负荷物在下文中 有时称为“活性物质”、“药物物质”或“活性成分”，除非另有明确指出，这些 术语作为同义词使用。

通过提供在溶液中的希望的组分，尤其是VP1、任选的VP2、任选的VP3或 它们的组合和任选的装载负荷物并允许这些组分装配成VLP，来制备VLP。例如， 在没有或只有有限VLP装配发生的条件下混合这些组分，例如在低Ca²⁺浓度和/ 或还原条件下，加入所有需要的组分之后，条件转变为有助于VLP装配，例如 高Ca²⁺浓度和/或氧化条件。但是，VLP的产生也发生于体内。尤其是，VLP的 组分可以共表达于宿主细胞，且VLP装配发生于宿主细胞内或者在裂解或破坏 宿主细胞时。

术语“人多瘤病毒”指人多瘤病毒家族，包含JC病毒，BK和SV40。在特 别优选的实施方式中，人多瘤病毒是JC病毒。

根据本发明，“VP1”或“病毒蛋白1”指相同于或衍生自具有SEQ ID NO：1 所示氨基酸序列的JC病毒的天然VP1的蛋白。衍生自JC病毒的天然VP1的蛋 白，在至少100个连续氨基酸、优选至少150、至少200、至少250或至少300 个连续氨基酸的序列上，优选与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少60％、 更优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、 至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同源性或同一性。更优选的， 氨基酸同源性或同一性可以在天然JC病毒-VP1的全长上计算。术语“衍生自 JC病毒的天然VP1的VP1”和“衍生自JC病毒的VP1”，特别地，也包括与JC 病毒的天然VP1同一的VP1。

根据本发明，术语“VP1”也包含能装配成VLP的天然VP1的片段和衍生物。 优选的，所述VP1的片段和衍生物至少包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第 32到316位氨基酸，或其在至少100个连续氨基酸，优选至少150、至少200、 至少250或至少300个连续氨基酸的序列上，优选在全长序列上，与SEQ ID NO：1 的第32到316位氨基酸位点上的氨基酸序列具有至少60％、更优选至少70％、 至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少 98％、或至少99％的同源性或同一性的衍生物。

根据本发明，VP1也可以包括异源的核定位信号(NLS)。优选的，该NLS 被引入到NP1的N-末端的前面或者内部，特别是VP1最开始的30个、最开始 的25个、最开始的20个，最开始的15个或最开始的10个氨基酸的内部。例 如，WO2009/036933(例如第10页，第4到第13行和图4A)或Shishido-Hara 等(Shishido-Hara，Y.，Hara，Y.，Larson，T.，Yasui，K.，Nagashima，K.&Stoner， G.L.Analysis of Capsid Formation of Human Polyomavirus JC(Tokyo-1 Strain)by a Eukaryot ic Express ion System：Splicing of Late RNAs， Trans lat ion and Nuclear Transport of Major Caps id Protein VP1，and Caps id  Assembly.Journal of Virology 74，1840-1853(2000)中描述的NLS。

根据一个实施方式，SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列被引入到VP1的N-末 端部分内，特别是SEQ ID NO：1所示的第9个和第10个氨基酸之间。

根据本发明，“VP2”或“病毒蛋白2”指的是相同于或衍生自具有SEQ ID NO：3 所示氨基酸序列的JC病毒的天然VP2的蛋白。衍生自JC病毒的天然VP2的蛋 白，在至少100个连续氨基酸、优选至少150、至少200、至少250或至少300 个连续氨基酸的序列上，优选与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少60％、 更优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、 至少97％、至少98％、或至少99％的氨基酸序列同源性或同一性。更优选的， 氨基酸同源性或同一性在天然JC病毒-VP2的全长上计算。术语“衍生自JC病 毒的天然VP2的VP2”和“衍生自JC病毒的VP2”，特别地，也包括与JC病毒 的天然VP2同一的VP2。

根据本发明，术语“VP2”也包含能与VP1一起装配成VLP的天然VP2的片 段和衍生物。优选的，所述VP2的片段至少包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列 的第214到318位氨基酸，或其在至少100个连续氨基酸、优选至少150、至 少200、至少250或至少300个连续氨基酸的序列上，优选在全长序列上，与 SEQ ID NO：3的第214到318位氨基酸位点上的氨基酸序列具有至少60％、更 优选至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至 少97％、至少98％、或至少99％的同源性或同一性的衍生物。

根据本发明，“肽”可以由任何数量的任何种类的氨基酸组成，优选天然生 成的氨基酸，其优选通过肽键连接。尤其是，肽含有至少3个氨基酸，优选至 少5个，至少7个，至少9个，至少12个或至少15个氨基酸。进一步地，没 有关于肽长度的上限。但是，本发明的肽优选不超过500个、优选300、250、 200、150或120个氨基酸的长度。

此处使用的“包含”的表达方式，除了其文字含义，还包括，特别指“基 本组成”和“组成”的语义。因此，“包含”的表达方式既指特定包含列出成分 的主题不含有其它成分的实施方式，也指特定包含列出成分的主题可以和/或实 际含有其它成分的实施方式。同样地，“具有”的表达方式应被理解为“包含” 的语义，也包括，特别指“基本组成”和“组成”的语义。

施用方法

本发明的VLP可以通过各种途径施用。特别优选的是允许活性物质全身效 应的剂型。最优选的是口服或胃肠外施用，尤其是静脉施用的剂型。

制备方法

制备病毒样颗粒

另一方面，本发明提供了根据本发明制备病毒样颗粒的方法。该方法尤其 包含以下步骤：

(a)提供衍生自JC病毒的病毒蛋白VP1；

(b)可选地提供衍生自JC病毒的病毒蛋白VP2和/或VP3，优选VP2，并混 合VP1和VP2(和/或VP3)；

(c)允许VP1和任选的VP2(和/或VP3)装配成病毒样颗粒。

优选的，该方法还包含提供装载负荷物，以及将VP1和任选的VP2和/或 VP3与装载负荷物混合的步骤。优选的是VP1和VP2的混合。

VLP装配时，装载负荷物优选封装在VLP的内部。优选的，至少一个VLP 携带装载负荷物，更优选的，至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少 7％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、 至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少 97％、至少98％、或至少99％或100％的装配的VLP携带装载负荷物。

病毒样颗粒的装配优选发生于溶液中，更优选在水溶液中。允许VLP装配 优选包括调整溶液中的Ca²⁺离子浓度到VLP装配能够发生的水平。所述Ca²⁺离子 浓度尤其在0.1mM到5mM的范围内，优选从0.2mM到3mM，更优选从0.5mM到 2mM或0.8mM到1.2mM，最优选约1mM。进一步地，允许VLP装配发生于氧化条 件下，尤其是不存在明显浓度的还原剂如DTT、DTE或巯基乙醇的条件下。

提供病毒蛋白和允许VLP装配可以同时进行。尤其是，在VLP装配能够发 生的条件下供应病毒蛋白。在优选的实施方式中，提供病毒蛋白和VLP装配在 体内进行。尤其是，VLP在表达病毒蛋白的宿主细胞内部或裂解或破坏宿主细 胞时被装配。

例如，可以如EP 0 862 633描述的那样进行VLP的装配，EP 0 862 633 公开的内容以引用方式并入本文。

递送方法

本发明进一步提供了使用本发明的病毒样颗粒递送物质或组合物到中枢神 经系统内的靶细胞的方法。该方法优选包含以下步骤：

(a)提供本发明的病毒样颗粒，其包含物质或组合物作为装载负荷物；和

(b)将所述病毒样颗粒施用到活体内，优选到人体内。

所述靶细胞可以是JC病毒的天然靶细胞。

活性物质或组合物可以是任何种类或性质。在一个优选的实施方式中，活 性物质是核酸，尤其是编码蛋白或肽的核酸，或抑制性核酸如siRNA或miRNA。 在另外一个优选的实施方式中，活性物质是蛋白或肽。在本发明又另一个实施 方式中，活性物质是小分子，尤其是带负电荷的小分子。活性物质也可以是各 种活性物质的混合物。

活性物质优选是细胞毒素剂。

进一步地，本发明一般性涉及VLP，其能够用作药物递送系统，用于神经 性的、神经元的或神经退化性疾病例如特别是多发性硬化、帕金森病或阿尔茨 海默病的治疗和诊断。

在优选的实施方式中，VLP被转运到少突胶质细胞内部，或转运至或转运 进入少突胶质细胞。

实施例

1.体外血脑屏障(BBB)模型中的VP1-病毒样颗粒

该体外实验在与人类血脑屏障的组织和性质匹配的模型系统中证明了VLP 穿过血脑屏障的能力。在该模型系统中，使用能够在体外形成血脑屏障的猪原 代脑血管内皮细胞(PBCEC)(Angelow S，Zeni P和Galla HJ“Usefulness and  limitation of primary cultured porine horoid plexus epithel cells as an  in vitro model to study drug transport at the blood-CSF barrier”，Adv  Drug Del ivery 2004；56(12)：1859-73)。

按照Rempe等，BBRC，2011：Transport of Poly-(n-butylcyano-acrylate) nanoparticles across the blood-brain-barrier in vitro and their  influence on barrier integrity中的描述进行PBCEC的制备和培养。

借助于相对跨内皮电阻测量(TEER)研究含有负载物的VLP在Transwell 滤过系统上的效果(Rempe等，2011)。为建立递送的定量证据，我们使用质粒 DNA作为负载物。在任何环境和浓度下，VP1-病毒样颗粒不影响血脑屏障的完 整性。

为了确证负载物在体外转运通过血脑屏障，按照Goldmann等，1999 (Journal of Virology：Molecular cloning and express ion of major  structural protein VP1 of the human polyoma virus：formation of virus  like particles useful for immunological and therapeutic studies and  measured quant itat ively by specific qPCR)所述，将质粒DNA装载入VLP。 定量体外模型的血脑屏障中顶侧和基底侧的质粒DNA的拷贝数。所述顶侧是VLP 被加入的位置(体内血管腔内)，所述基底侧指大脑。基底层质粒DNA的定量证 据分别代表VLP介导通行的分子穿过大脑内皮细胞，和负载物递送通过血脑屏 障。

2.体内报告基因的递送和表达

设计报告基因递送实验来证明JC VP1病毒样颗粒在活的生物体内递送物质 进入细胞和组织的能力。在该实验中，报告基因表达是不仅证明递送，也证明 被递送物质的功能的最好方法之一(Hoffman，R.M.，2005：THE MULTIPLE USES  OF FLUORESCENT PROTEINS TO VISUALIZE CANCER IN VIVO.Nat.Rev.Cancer； 5(10)：796-806)。

材料

不同的VP1-VLP探针用于检测在体外装载和递送报告质粒进入Cos 7(绿猴 肾细胞)细胞的能力，原因是该细胞系已知能够被JCV VLP转导。有9个盐沉 淀的VP1-VLP探针和15个色谱法纯化的VP1-VLP探针。体外的转导实验重复5 次。在该实验中，检测递送用于体内实验的荧光素底物的最大发光信号的能力。

盐沉淀的VP1-VLP被沉淀过夜并针对Standard Buffer(150mM的NaCl， 10mM的Tris-HCl，pH7.5)渗析24小时。按照Goldmann等，1999，Journal of  Virology：Molecular cloning and expression of major structural protein  VP1 of the human polyoma virus：formation of virus like particles useful  for immunological and therapeutic studies中所述，通过化学分离和再组 合的方法完成报告基因质粒的装载。

实验设计

异氟醚麻醉下，尾静脉内实施静脉注射VLP给具有免疫能力的BALB/c小鼠。

动物被分组如下：

-5μg盐沉淀的VLP(4只动物)

-50μg盐沉淀的VLP(4只动物)

-5μg色谱法纯化的VLP(4只动物)

-DNA对照(仅报告基因质粒)(3只动物)

-VLP对照(仅VP1-VLP衣壳)(3只动物)

在第2天、4天、7天、14和22天，腹膜内注射荧光素底物12分钟后检 测生物发光。每组的结果合并计算平均值和标准差。以Holm-Sidak-Test作为 事后检定，通过Two-Way-ANOVA分析平均值。

结果显示在图3和图4中。

3.借助装载荧光素酶质粒的JC VP1-VLP，和与荧光素酶质粒混合的JC VP1-VLP，Cos7细胞(非洲绿猴肾细胞)的转导效率

1.转导前18小时，将Cos7细胞放进24孔板。

2.VP1-VLP与DTT和EGTA分离，与荧光素酶质粒混合，并于再结合缓 冲液中4℃渗析过夜。

3.第二天，装载后的VP1-VLP从渗析中取出。

4.根据Krauzewicz(Gene Therapy(2000)7，1094-1102)制备与荧光 素酶质粒混合的VP1-VLP。

a.VLP与荧光素酶质粒的混合比例为30∶1(w/w)。

b.室温孵育混合物15分钟，

c.用DMEM细胞培养基稀释混合物，移液到24孔板中的Cos7细胞。

5.将装载了荧光素酶质粒的VP1-VLP移液到Cos 7细胞。对于与荧光素 酶质粒混合的VP1-VLP执行同样操作。

6.72小时后，裂解细胞，借助Promega的Luciferase Assay，三个一 组检测荧光素酶活性。

独立转导实验的结果显示在图5。

4.静脉内施用装载荧光素酶质粒的VLP后，免疫组化检测小鼠大脑中的荧 光素酶和VP1蛋白

如上所述，通过质粒DNA(通过定量PCR)或荧光素酶活性的检测证明，JC  VP1-VLP能够在活的生物体内将物质递送入细胞和组织。脑内荧光素酶蛋白和 VP1蛋白的免疫组化检测进一步支持这些实验结果。

从静脉注射VLP的具有免疫能力的BALB/c小鼠(如上所述地处理)分离脑 组织，在PFA中固定并石蜡包埋，如J.Jankowski等，The Journal of  comparative Neurology 472：87-99，2004：“Engrailed-2 negat ively regulates  the onset if prenatal Purkinje Cell differentiation”中所述。制备7 到10微米的薄切片，并固定于Histobond plus载玻片上。切片再水化，灭活 内源过氧化物酶，使切片具有渗透性。封闭步骤在3％的牛血清白蛋白溶液中 进行。荧光素酶蛋白或VP1蛋白，分别用单克隆抗体检测。为增加信号强度， 使用TSA荧光增强系统(TSA^TM Plus Fluorescein System，Perkin Elmer)。

结果：如图6B的右图所示，使用抗-VP1抗体的免疫组化分析能够检测中 枢神经系统细胞内的VP1蛋白。脑切片显示不规则大小的散在斑点，其指示VP1 在脑实质内的细胞定位。使用抗-荧光素酶抗体，荧光素酶蛋白也能够在中枢神 经系统的细胞内被检测。根据VP1蛋白的结果，脑切片的荧光素酶来源的染色 也显示不规则大小的散在斑点，其指示荧光素酶在脑实质内的细胞定位。

讨论：荧光素酶和VP1蛋白在脑内细胞的呈现代表了对本发明基本概念的 进一步支持，因为其表明VLP，并不仅仅是单独的活性物质，通过了血脑屏障 并进入中枢神经系统。

5.共区域化分析显示了VP1蛋白在少突胶质细胞中的存在

基于上述VP1蛋白在中枢神经系统内的细胞检测，进行共区域化实验以识 别各靶细胞。为此目的，被检测的VP1蛋白与特异地定位于少突胶质细胞的标 志物Olig 2共定位(B.Menn等，“Origin of oligodentrocytes in the  subventricular zone of the adult brain”，The Journal of Neuroscience， 2006，26(30)：7907-7918)。

结果：如图8的左下图所示，通过使用Olig2标志物，几个不规则斑点能 够在脑切片中被检测到，其在每个实例中也能够被核染DAPI染色(图8的左上 图)，因此指示少突胶质细胞。如图8的右下图所示，每个所述少突胶质细胞也 是VP1蛋白阳性的。Olig2和VP1阳性的细胞使用白色箭头标记。因此，VP1蛋 白定位于中枢神经系统的少突胶质细胞，其指示这些细胞被静脉内施用的VLP 感染。

讨论：VP1蛋白在脑的少突胶质细胞内被检测到与JCV病毒的天然趋向性 是一致的。作为结果，本发明要求保护的VLP尤其适合治疗与少突胶质细胞相 关的疾病例如多发性硬化。

附图说明

图1：A，B-以每孔5*10⁸到2*10¹²个颗粒的浓度加入VP1-VLP之后，相对跨 内皮电阻的变化情况(A和B)(n＝3)。

图2：体外模型中，以使用特异性引物的定量PCR测量装载DNA的VP1-VLP 通过血脑屏障。加入的VLP-加入到血脑屏障模型的顶侧的VLP的数量，检测 到的VLP-在血脑屏障模型的顶侧和基底侧检测到的质粒数量(n＝3)。

图3：静脉施用后小鼠身体的生物发光信号：5μg盐沉淀的VLP；50μg盐 沉淀的VLP；5μg色谱法纯化的VLP；DNA对照(仅报告基因质粒)；VLP对照 (仅VP1-VLP衣壳)。例如，每组的1只小鼠的腹侧和背侧情况。

图4：静脉施用后小鼠头部的生物发光信号：5μg盐沉淀的VLP；50μg盐 沉淀的VLP；5μg色谱法纯化的VLP；DNA对照(仅报告基因质粒)。每组的平 均值减去VLP对照(作为背景信号)。

图5：A，B：使用负载了荧光素酶质粒DNA的VP1-VLP转导Cos7细胞。RLU —相对光单位；25μg装载的VLP-装载荧光素酶质粒的25μg的JC VP1-VLP； 50μg装载的VLP-装载荧光素酶质粒的50μg的JC VP1-VLP；50μg VLP混合 物-与荧光素酶质粒混合的50μg的JC VP1-VLP；DNA对照-荧光素酶质粒对 照。

图6：脑切片的免疫组化分析。左栏显示细胞核的DAPI染色，右栏荧光标 记蛋白：A-阴性对照；B—VP1蛋白的FITC荧光染色；C-荧光素酶蛋白的FITC 荧光染色。

图7：VP1蛋白与少突胶质细胞标志物Olig2的共定位的阴性对照。左上 图显示使用染料DAPI进行的细胞核染色。右上图显示不使用抗VP1抗体的荧光 检测后的信号。左下图显示不使用抗Olig2抗体的荧光检测后的信号。右下图 代表两个对照染色的融合图。

图8：VP1蛋白与少突胶质细胞标志物Olig2的共定位。左上图显示用染料 DAPI的细胞核染色。右上图显示VP1蛋白的定位(FITC-荧光)。左下图显示用 抗-Olig2抗体染色(TRITC-荧光)。右下图代表Olig2-标志物和VP1蛋白染色 的融合图。