用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法

摘要

本发明涉及一种用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；步骤(2)：将水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；步骤(3)：将总环境DNA采用核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的16s rDNA序列作为通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；步骤(4)：将PCR产物进行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；步骤(5)：将带有DNA的凝胶进行切胶克隆测序后通过GENBANK进行blast比对，以确定DNA是否为鱼类序列；步骤(6)：确定DNA为鱼类序列后，采用二代测序技术对PCR产物的组成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA的鱼群的组成和鱼类的群落结构。采用该方法十分简便高效，具有实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生态学领域，特别涉及水体环境DNA的样品采集，DNA提取，引物扩 增以及条形码序列的物种鉴定方面，具体是指一种用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定 方法。

背景技术

国内目前用于鱼类群落和种群生态学研究的方法主要有捕捞法和声学探测法。捕捞法是 通过对水体中的鱼类进行捕捞，然后进行物种的鉴定、群落结构分析。该方法的实现主要是 通过各种捕捞工具和方法(如各种网具、钓具、电捕等)对于鱼类进行捕获而完成。该方法 存在以下几方面的问题：1、对捕捞强度要求高。需要通过大量的捕捞工作，人力、物力、成 本投入都较大。2、对于鱼类种群生物量较少且地形复杂的水体，各种捕捞方法对不同生态类 型的鱼类(表层鱼类、中下层鱼类、洞穴鱼类、底栖鱼类等)难以同时有效地进行捕获，准 确性难以保证。3、该方法需要捕获活体，上述捕捞方式难以保证被捕获鱼类的存活，对于鱼 类资源有一定的破坏。4、对于稀有物种、外来物种的监测调查由于其数量稀少，往往难以取 得良好的效果，调查结果更加容易产生偏差。

声学探测法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行了评估。研究通过回声成像， 并充分结合分层拖网的鱼类取样,进行积分分配,从而得到目标强度与鱼体长度的换算关系 式,最后估算水域鱼类资源量及分布,其结果相对捕捞法更为准确。然而该技术还是要建立在 捕捞的基础上，不仅存在上述的问题，该技术还受到水域理化指标和天气状况的限制，而且 对于大面积水域的调查仍有很大的局限性。同时，在物种鉴定方面，该方法也无法实现准确 有效的物种鉴定和群落结构的分析。

环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中(如空气、水、土壤等)的DNA， 包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。环境DNA技术就是直接从水、 土壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段，后通过DNA测序和qPCR等分子生物学检测技 术来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研究方法。环 境DNA的应用最早是从土壤、沉积物中直接提取出来DNA基因组，用来研究微生物多样性 以及物种鉴定，后来在生态学的研究中关于环境DNA的应用得到进一步的发展，逐渐从微 生物学拓展到了动植物学研究领域中。由于水环境的特殊性，加上水生动物在水中的流动性、 易躲藏、不易捕捞等特点，在大面积的水域中有关水生动物方面的调查研究往往费时费力不 易进行。但现在并没有一种系统的采用环境DNA技术来进行鱼类群落研究的方法。

所以一种能够高效、快捷、灵敏、准确的鉴定样品采集地点鱼类群落组成情况的方法是 十分具有实用性的。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种能够高效、快捷、灵敏、准 确的鉴定样品采集地点鱼类群落组成情况的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法， 其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；

步骤(2)：将所述的水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；

步骤(3)：将所述的总环境DNA采用核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的16s rDNA序列作为通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

步骤(4)：将所述的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；

步骤(5)：将所述的带有DNA的凝胶进行切胶克隆测序后通过GENBANK或BOLD进 行blast比对，以确定所述的DNA是否为鱼类序列；从而确定物种及其组成比例，统计物种 数、多样性指数、优势度指数、物种丰富度等，同时利用聚类分析、主成分分析、多维尺度 分析等对于群落结构的相似度和差异进行统计。

步骤(6)：确定所述的DNA为鱼类序列后，采用二代测序技术对所述的PCR产物的组 成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA的鱼群的组成和鱼类的群落结构。

较佳地，所述的步骤(1)的采集水样为从需要调查的样点区域采集柱状水层的水样后等 体积混合。

较佳地，所述的步骤(2)中的处理为对所述的水样采用3μm滤膜进行抽滤，抽滤后将 所述的滤膜放入无菌水中高速震荡10min，在5000转速下离心，收集沉淀后于-20℃保存。

较佳地，所述的步骤(2)中的处理为对所述的水样采用离心机在10000转速离心，去上 清液，加入10ml缓冲液，超速离心分离。

较佳地，所述的步骤(2)中的处理为使用3μm滤膜抽滤，并收集所述的滤膜。

较佳地，所述的步骤(2)中的提取为采用试剂盒提取所述的总环境DNA并溶于TE缓 冲液中于-20℃保存或采用酚氯方法提取所述的总环境DNA。采用的试剂盒为QIAGEN公司 生产的试剂盒QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)或者其他同类试剂盒 (如1.试剂盒DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)；2.试剂盒 PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit(MoBio,CA)等)

较佳地，所述的步骤(3)中PCR扩增的反应条件为：4℃预变性2min，94℃变性30s， 52℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；

PCR扩增的反应体系为每25ul体系中：2.5ul 10×PCR buffer，2.5mM浓度的dNTP2ul， 浓度为10uM的正反引物各1ul，5U/ul的Taq酶0.15ul，DNA模板10ng，采用灭菌水补足。

较佳地，所述的凝胶电泳为取所述的PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中，电压100V，电泳 45min，用溴化乙锭染色8min，最后在凝胶成像系统上拍照，并统计引物的扩增效果。

较佳地，所述的步骤(6)中采用罗氏454测序平台对PCR产物的组成情况进行大规模 分析。按照每个样品数据量在1万条序列以上的要求，每个反应可以将80个样品同时上机测 序，采用8个碱基的barcode组合，形成80个不同组合的barcode，连接于每个样品所使用的 引物16sF和16sR中，从而区别一个反应中的不同样品。

采用本发明的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，将环境DNA的技术原理应 用于调查研究，在获取水体中的环境DNA时，只需在目标水体一定范围内进行水样的采集， 与传统方法相比，不需要进行大量的捕捞作业，也不会伤害鱼类个体。这样既可以节省大量 的人力财力，也保护了鱼类的种群。在物种鉴定的时候，只需要用筛选好的特有引物进行扩 增，然后进行测序，测序结果再与GENBANK、BOLD中物种基因进行比对就可以来确定物 种的种类。相对于传统的方法，不需要进行大量物种的外表鉴定，省时省力且准确。在稀有 物种的鉴定中，由于不需要依赖捕获的个体来确定物种的存在情况，其灵敏性和准确性得到 很大的提高。该体系不会因为水生动物在水中的流动性、易躲藏、不易捕捞等问题的局限性 而出现调查研究的障碍，因此，环境DNA技术显示出了比较传统方法更为简单、快捷、灵 敏和低成本的优点。在鉴定用的基因序列和引物的筛选过程中，也通过大量鱼类通用的比较， 选择出了通用性和适用性良好、能够有效地达到鉴定目的的基因片段16s rDNA片段及其引物 16sF和16Sr。采用的二代测序技术，能够在一个PCR样品中获得1-2万条16s rDNA条带， 这样一个大规模的测序分析技术，效率远远要高于我们在常规捕捞方法时所获得的样品数(一 般的一条30m的刺网捕获的鱼数量大约在几十条左右)，有利于统计和增加研究的精确性， 同时降低了固定样品数下样品采集的成本。

附图说明

图1为本发明实施例的方法流程图。

图2为本发明实施例使用16s rDNA扩增鱼类样品的结果图。

图3为本发明实施例使用COI扩增鱼类样品的结果图。

图4为本发明实施例使用Cytb1扩增鱼类样品的结果图。

图5为本发明实施例使用Cytb4扩增鱼类样品的结果图。

图6为本发明实施例使用D-loop扩增鱼类样品的结果图。

图7为本发明使用5对引物(16s rDNA、COI、Cytb1、Cytb4、D-loop)分别扩增10个水环 境样品(Ⅰ Ⅹ)的结果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。

实施例1

最为理想的鱼类环境的通用引物的筛选：

选取鱼类线粒体的4个基因：16S rDNA(SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2)、COI(SEQ ID  NO:3；SEQ ID NO:4)、Cytb1(SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6)、Cytb4(SEQ ID NO:7；SEQ ID  NO:8)、D-Loop(SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10)的部分序列的5个通用引物，其如表1所 示，选择浙江杭州千岛湖的鱼类样品和环境水样作为比较验证实验的研究样品，比较引物对 于千岛湖48种主要鱼类物种的通用性，对48种鱼类进行扩增后，只有16s rDNA扩增效果最 佳，48条与全部扩增出明亮条带，其如图2～图6所示；对于千岛湖10个环境DNA样品进 行扩增时，也只有16s rDNA扩增效果最佳，都得到一条明亮条带，其可在图7所示。因此可 认为，16s rDNA条带是最为理想的鱼类环境DNA群落结构研究的通用引物。

表 1PCR所用的5对通用引物.

实施例2

实验流程如图1所示，同时在千岛湖上游库区随机选取2个点采集水样，每份样品1L，放 入带冰的保温箱中，24h内对水样进行抽滤处理，使用滤膜孔径为3μm，使用QIAGEN公司生 产的试剂盒QIAamp DNA Micro Kit提取滤膜中的环境DNA。提取好的DNA溶于TE缓冲液中， -20℃保存。

采用SEQ ID NO:1的16s rDNA序列作为通用引物进行扩增后对PCR产物进行凝胶电泳检 测，各取5ul的PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中，电压100V，电泳60min，用溴化乙锭染色8min， 最后在凝胶成像系统上拍照，并统计每对引物的扩增效果。

引物扩增的环境样品进行切胶克隆测序，然后通过GENBANK进行Blast比对，以确定环 境样品中扩增出来的产物是否为鱼类序列，以及鱼类序列的组成情况。对比结果显示(见表2) 引物16s的扩增产物克隆测序得到15个阳性序列，经比对检测出6条黄尾鲴(Xenocypris davidi) 序列、5条蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)序列以及细鳞鲴(Plagiognathops microlepis)、 蒙古鲌(Chanodichthys mongolicus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Hypophthalmichthys  nobilis)序列各1条，全部为千岛湖常见鱼类。

表2.使用引物16s扩增环境样品产物的比对结果

实施例3

选取千岛湖5个环境样品进行环境DNA提取和16s rDNA扩增后，在引物序列两端设计5个 barcode(见表3)，使用添加Barcode序列的引物16sF和16sR对环境样品进行扩增，使用罗氏454 二代测序仪对样品进行测序，得到的结果统计如表4：五个样品分别获得13875-28022个序列， 平均序列长度约为597.28bp-598.55bp。经比对全部为千岛湖鱼类16s rDNA序列。

表3 5个样品的Barcode设计表

Sample barcode A1 ACACGCTG A3 ACATGTCA A5 ACGAGTGC A7 ACGCGATA A9 ACTCGCAC

表4 测序结果统计表

Sample Sequences Bases(bp) AverageLength(bp) A1 28022 10887973 598.55 A3 27252 10554096 597.28 A5 13875 5390842 598.53 A7 19026 7384594 598.13 A9 18597 7215344 597.98

实施例4

3.1在千岛湖库区选取40个点采集水样，每个点5米水层采集一份水样，等体积混合，取 每份混合样品1L，放入带冰的保温箱中带回，24h内对水样进行抽滤处理，使用滤膜孔径为 3μm，使用QIAGEN公司生产的试剂盒QIAamp DNA Micro Kit提取滤膜中的环境DNA。提取 好的DNA溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。

3.2设计40个8碱基组合的barcode序列，加在引物5’端，用以在进行二代测序时区分不同 样品。

3.3使用添加barcode序列的引物16sF和16sR对环境DNA样品进行扩增，扩增的反应条件 为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。 反应体系为(25ul体系)：2.5ul 10×PCR buffer，2ul dNTP(2.5mM)，正反引物各1ul(10uM)， Taq酶0.15ul(5U/ul)，DNA模板10ng，灭菌水补足)。

3.4扩增后对PCR产物进行凝胶电泳检测，取5ul的PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中，电压 100V，电泳45min，用溴化乙锭染色8min，最后在凝胶成像系统上拍照，并统计引物的扩增 效果.

3.5利用罗氏454测序平台进行上机测序，测序得到的结果在BOLD和GENBANK数据库中 进行定种分析，获得千岛湖40个样点的鱼类群落结构组成的空间格局信息。

采用本发明的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，将环境DNA的技术原理应 用于调查研究，在获取水体中的环境DNA时，只需在目标水体一定范围内进行水样的采集， 与传统方法相比，不需要进行大量的捕捞作业，也不会伤害鱼类个体。这样既可以节省大量 的人力财力，也保护了鱼类的种群。在物种鉴定的时候，只需要用筛选好的特有引物进行扩 增，然后进行测序，测序结果再与GENBANK、BOLD中物种基因进行比对就可以来确定物 种的种类。相对于传统的方法，不需要进行大量物种的外表鉴定，省时省力且准确。在稀有 物种的鉴定中，由于不需要依赖捕获的个体来确定物种的存在情况，其灵敏性和准确性得到 很大的提高。该体系不会因为水生动物在水中的流动性、易躲藏、不易捕捞等问题的局限性 而出现调查研究的障碍，因此，环境DNA技术显示出了比较传统方法更为简单、快捷、灵 敏和低成本的优点。在鉴定用的基因序列和引物的筛选过程中，也通过大量鱼类通用的比较， 选择出了通用性和适用性良好、能够有效地达到鉴定目的的基因片段16s rDNA片段及其引物 16sF和16Sr。采用的二代测序技术，能够在一个PCR样品中获得1-2万条16s rDNA条带， 这样一个大规模的测序分析技术，效率远远要高于我们在常规捕捞方法时所获得的样品数(一 般的一条30m的刺网捕获的鱼数量大约在几十条左右)，有利于统计和增加研究的精确性， 同时降低了固定样品数下样品采集的成本。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种 修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。