以计算方式优化的H5N1和H1N1流感病毒的广泛反应性抗原

摘要

本文描述了优化H5N1和H1N1流感HA多肽的产生，所述多肽用于印发针对流感病毒分离株的广泛反应性免疫应答。所述优化的HA多肽通过一系列HA蛋白对比进行，并随后给予H5N1和H1N1流感分离株产生共有序列。本文提供了优化H5N1和H1N1流感HA多肽，及包括所述HA多肽的组合物、融合蛋白及VLP。本文还提供了密码子优化的编码所述HA多肽的核酸。本公开物还提供了在受试者体内引起针对流感病毒的免疫应答的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年3月30日提交的美国临时申请No.61/617815的优先权，所述临时申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开内容涉及可引起针对H5N1和H1N1流感病毒的广泛反应性免疫应答的优化的流感血凝素蛋白及其作为疫苗的用途。

背景技术

流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族的成员。有三个亚型的流感病毒，命名为A型流感、B型流感和C型流感。所述流感病毒粒体含有分段的负义(negative sense)RNA基因组，所述基因组编码以下蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(M1)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、M1和M2蛋白为膜相关蛋白，而NP、PB1、PB2、PA和NS2为核衣壳相关蛋白。M1蛋白是流感颗粒中最丰富的蛋白质。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，负责病毒吸附和病毒颗粒侵入细胞，并且是用于病毒中和及保护性免疫的主要免疫显性表位的来源。HA和NA蛋白都被认为是预防性流感疫苗的最重要组分。

每年，季节性流感仅在美国就导致超过300,000例入院和36,000例死亡(Simonsen et al.,Lancet Infect Dis 7:658-66,2007)。2009年新型H1N1流感病毒的出现证明了新的流感大流行可如何快速地横扫全球。

目前在美国有两种获得批准的流感疫苗方法——灭活的裂解疫苗和减毒活病毒疫苗。灭活疫苗可有效地诱导体液免疫应答，但通常只有弱的细胞免疫应答。活病毒疫苗不能给予免疫妥协的或怀孕的患者，因为这些患者具有增加的感染风险。因此，存在对广泛保护性的流感病毒疫苗的需求。

发明内容

本文公开了用于引起针对流感病毒的广泛反应性免疫应答的以计算方式优化的H5N1和H1N1流感HA多肽的产生。基于所选的H5N1和H1N1流感病毒分离株，通过一系列的HA蛋白比对和随后的共有序列产生，开发了所述优化的HA多肽。

本文提供了用于引起针对H5N1或H1N1流感的广泛反应性免疫应答的具有优化的氨基酸序列的重组流感HA多肽，其中所述HA多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由其构成。在一些实施方案中，所述流感HA多肽缺少N-末端的甲硫氨酸残基。

本公开内容还提供了编码所述重组HA多肽的分离的核酸分子和载体。还提供了包含所述载体的分离的细胞。

还提供了包含本文公开的优化的HA多肽的流感病毒样颗粒(VLP)和融合蛋白。

还提供了包括在可药用载体中的本文公开的优化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP的组合物。本公开内容还提供了通过给予所公开的组合物、融合蛋白或VLP在受试者中引起针对流感病毒的免疫应答的方法。

还提供了通过给予受试者包含含有优化的HA多肽的VLP的组合物而使所述受试者对流感病毒免疫的方法。

根据以下参照附图进行的详细描述，本发明的上述和其他目的、特征和优点会变得更加清楚。

附图说明

图1的示意图概述了使用来自进化枝0、1、2.1、2.2、2.3和7的426个人H5N1分离株来产生COBRA HA序列的方法，在本文中称为“PATH H5N1 COBRA”HA。

图2的示意图概述了使用205个人和猪H1N1流感病毒分离株来产生COBRA HA序列的方法，在本文中称为“PATH H1N1COBRA”HA。

图3的图示出了用含有PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有人进化枝2流感病毒COBRA HA序列(人COBRA-2)的VLP或含有大天鹅(A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005)流感病毒HA的VLP进行疫苗接种后，针对进化枝1和进化枝2攻击毒株的HAI滴度。在第0周时和第3周时在使用佐剂(Imject^TM)的情况下进行疫苗接种(3μg)。

图4的图示出了用含有PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有人COBRA-2 HA序列的VLP或大天鹅VLP进行疫苗接种及随后用5000PFU印度尼西亚进化枝2.1病毒(A/Indonesia/5/2005)攻击的动物的体重。在第0周时和第3周时在使用佐剂(Imject^TM)的情况下进行疫苗接种(3μg)；在第5周期间进行病毒攻击。

图5的图示出了用含有PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP进行疫苗接种及随后用5000PFU越南进化枝1病毒(A/Vietnam/1203/2004)攻击的动物的体重。在第0周时和第3周时在使用佐剂(Imject^TM)的情况下进行疫苗接种(3μg)；在第5周期间进行病毒攻击。

图6的图示出了用含有PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有人COBRA-2 HA序列的VLP或大天鹅VLP进行疫苗接种及并随后用越南进化枝1病毒攻击的动物的体重。在第0周时在使用佐剂(Imject^TM)的情况下进行单次疫苗接种(3μg)，随后在第4周期间进行病毒攻击。

图7的图示出了用含有PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有人COBRA-2 HA序列的VLP或大天鹅VLP进行疫苗接种及随后用越南进化枝1病毒攻击的动物的存活百分比。在第0周时在不使用佐剂的情况下进行单次疫苗接种(3μg)，随后在第4周期间进行病毒攻击。

图8的图示出了用含有PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有人COBRA-2 HA序列的VLP或大天鹅VLP进行疫苗接种及随后用越南进化枝1病毒攻击的动物的体重。在第0周时在使用佐剂(Imject^TM)的情况下进行剂量为0.6μg的单次疫苗接种，随后在第4周期间进行病毒攻击。

序列表

列于所附序列表中的氨基酸序列是使用在37C.F.R.1.822中定义的氨基酸的三字母编码显示。所述序列表以创建于2013年2月7日的10.0KB的ASCII文本文件提交，并以引用的方式纳入本文。在所附序列表中：

SEQ ID NO:1是H5N1流感HA的COBRA氨基酸序列(“PATHH5N1 COBRA”)。

SEQ ID NO:2是H1N1流感HA的COBRA氨基酸序列(“PATHH1N1 COBRA”)。

具体实施方式

I.缩写

COBRA：以计算方式优化的广泛反应性抗原

HA：血凝素

HAI：血凝抑制

HRP：辣根过氧化物酶

M1：基质蛋白1

NA：神经氨酸酶

PFU：空斑形成单位

VLP：病毒样颗粒

II.术语和方法

除非另有说明，技术术语以常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,genesV,published by OxfordUniversity Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),TheEncyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了便于阅读本公开内容的各个实施方案，提供了以下对具体术语的解释：

佐剂：非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬液；或其中抗原溶液乳化在矿物油中的油包水乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包括灭活的分枝杆菌(mycobacteria)(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41 BBL。

给药：如本文使用的，给予受试者组合物是指给予、施用所述组合物或使其与所述受试者接触。给药可通过许多途径中的任一种来完成，例如，局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内和真皮内给药。

抗体：由B淋巴细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗体在人或其他动物中由特定抗原(免疫原)诱发。抗体是通过以某些可证明的方式与抗原进行特异性反应来表征，抗体和抗原各自以对方来定义。“引起抗体应答”是指抗原或其他分子诱导抗体产生的能力。

抗原：可在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源性免疫原诱导的那些)反应。在所公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述抗原为流感HA蛋白。

密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已经被改变使得密码子最适于在具体系统(例如具体物种或物种群)中表达的核酸序列。例如，核酸序列可被优化用于在哺乳动物细胞中表达。密码子优化不改变所编码的蛋白质的氨基酸序列。

融合蛋白：通过表达从编码两种不同(异源)蛋白质的至少一部分的核酸序列改造的核酸序列而产生的蛋白质。为了产生融合蛋白，所述核酸序列必须在相同的读码框内并且不包含内部的终止密码子。例如，融合蛋白可包括融合至异源蛋白的流感HA。

血凝素(HA)：流感病毒表面糖蛋白。HA介导病毒颗粒结合到宿主细胞和随后的病毒进入所述宿主细胞。本领域已知并可公开获得许多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列，例如通过NCBI流感病毒资源数据库(Bao et al.,J Virol 82:596-601,2008)。HA(和NA一起)是两个主要的流感病毒抗原决定簇之一。

免疫应答：免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(例如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可包括参与宿主防卫反应的机体的任何细胞，包括例如，分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。如本文所使用的，保护性免疫应答是指保护受试者免受感染(预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法在本领域中已知，包括例如测量淋巴细胞(例如B细胞或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等等。

免疫原：在合适的条件下能够刺激产生免疫应答(例如在动物中产生抗体或T细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。本文所使用的“免疫原性组合物”是包含免疫原(例如HA多肽)的组合物。

免疫：使受试者受到保护免患传染性疾病，例如通过疫苗接种。

流感病毒：属于正粘病毒科家族的分段的负链RNA病毒。有A、B和C三种类型的流感病毒。A型流感病毒感染多种鸟和哺乳动物，包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。在动物中，大多数A型流感病毒引起温和的呼吸道和肠道的局部感染。然而，高致病性A型流感毒株(例如H5N1)引起家禽的全身感染，其中死亡率可达到100％。2009年，H1N1流感是人流感的最常见病因。2009年出现的起源于猪的H1N1的新毒株，并被世界卫生组织宣布为大范围流行的。该毒株被称为“猪流感”。H1N1A型流感病毒还是1918年的西班牙流感大流行、1976年的迪克斯堡(Fort Dix)大爆发和1977-1978年的俄罗斯流感大流行的病因。

分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质或病毒)已经基本上从其他生物组分(例如细胞碎片，或其他蛋白质或核酸)中分离或纯化。已经被“分离的”生物组分包括那些通过常规纯化方法纯化的组分。该术语还包括重组核酸、蛋白质或病毒(或VLP)，以及化学方法合成的核酸或肽。

接头：在融合蛋白的两个多肽之间充当间隔物的一个或多个氨基酸。

基质(M1)蛋白：存在于病毒包膜中的流感病毒结构蛋白。M1被认为在装配和出芽中起作用。

神经氨酸酶(NA)：一种流感病毒膜糖蛋白。NA是通过在被感染细胞表面上的碳水化合物部分切割末端的唾液酸残基，参与破坏病毒HA的细胞受体。NA还从病毒蛋白上切割唾液酸残基，防止病毒聚集。NA(和HA一起)为两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以有功能的关系放置时，所述第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接于所述编码序列。可操作地连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区域时则位于相同的读码框中。

优化的流感HA蛋白：如本文所使用的，“优化的流感HA蛋白”是指通过对H5N1和H1N1流感病毒分离株进行序列比对而产生的HA蛋白共有序列(如下文实施例1和2所描述)。通过密码子优化和RNA优化(例如以增加RNA稳定性)将编码优化的HA蛋白的核苷酸序列进一步优化以用于在哺乳动物细胞中表达。本文公开(并且如本文本文SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)的优化的流感HA蛋白也称作“COBRA”(以计算方式优化的广泛反应性抗原)序列。设计优化的HA多肽以用于在受试者中引起广泛反应性免疫应答。在本公开内容的上下文中，“广泛反应性”意指所述蛋白序列在受试者中引起足以抑制、中和或预防众多流感病毒(例如特定亚型中的大多数或全部流感病毒)的感染的免疫应答。在一些实例中，所述优化的流感HA蛋白能够引起针对大多数或全部H5N1流感病毒分离株或者大多数或全部H1N1流感病毒分离株的免疫应答，例如保护性免疫应答。

爆发：如本文所使用的，流感病毒“爆发”是指在给定年份中来自单个国家的病毒分离株的集合。

可药用载体：可在本公开内容中使用的可药用载体(carrier或vehicle)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版,(1975)，记载了适于一种或多种治疗组合物(例如一种或多种流感疫苗)以及其他的药剂的药物递送的组合物和制剂。

通常，所述载体的性质会取决于采用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂常常包含可注射流体作为载体，所述可注射流体包括可药用和生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性的载体之外，待给予的药物组合物可含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

多肽：其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当所述氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意图包括任何氨基酸序列和包括修饰的序列例如糖蛋白。术语“多肽”特别意欲覆盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成方法产生的那些。术语“残基”或“氨基酸残基”包括提及整合入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。

预防、治疗或减轻疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指当疾病已经开始发生后减轻疾病或病理病症的征象或症状的治疗干预。“减轻”是指减少疾病征象或症状的数量或严重程度。

启动子：启动子是指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件。“组成型启动子”是连续地有活性且不受外部信号或分子调节的启动子。相反，“诱导型启动子”的活性受外部信号或分子(例如转录因子)调节。在本文的一些实施方案中，所述启动子为CMV启动子。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对的纯净；而是意欲作为相对的概念。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒、VLP或其他活性化合物是全部或部分从天然相关的蛋白质和其他污染物中分离的。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其他粗制品中分离且经过分级分离以去除最初制品的各种组分(例如蛋白质、细胞碎片和其他组分)的肽、蛋白质、病毒、VLP或其他活性化合物。

重组体：重组体核酸、蛋白质、病毒或VLP是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个原本独立的序列片段而产生的序列。该人工组合常常是通过化学合成，或通过人工操纵分离的核酸片段(例如通过基因工程技术)完成。

受试者：活的多细胞脊椎生物——包括人和非人哺乳动物(例如非人灵长类)的种类。

治疗有效量：足以在用该试剂治疗的受试者中达到所需效果的那种试剂的量。例如，这可以是用于在受试者中引起免疫应答和/或用于预防由流感病毒引起的感染或疾病的流感病毒疫苗的量。理想地，在本公开内容的上下文中，流感疫苗的治疗有效量是足以在受试者中增加对流感病毒引起的感染的抵抗力、预防、减轻和/或治疗所述感染，而不会在所述受试者中产生明显的细胞毒性效应的量。用于在受试者中增加对感染的抵抗力、预防、减轻和/或治疗感染的流感疫苗的有效量会取决于，例如，被治疗的受试者、治疗组合物的给药方式及其他因素。

转化的：转化的细胞是已经通过分子生物学技术将核酸分子导入其中的细胞。如本文所使用的，术语转化包括可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂转染和基因枪加速导入裸露的DNA。

疫苗：能够刺激免疫应答的免疫原性材料制品，其被给予用于预防、减轻或治疗疾病，例如传染性疾病。所述免疫原性材料可包括，例如，弱化或灭活的微生物(例如弱化的病毒)，或来自它们的抗原性蛋白质(包括VLP)、肽或DNA。疫苗可引起预防性的(prophylactic或preventative)和治疗性的应答。给药方法根据所述疫苗有所不同，但可包括接种、食入、吸入或其他给药形式。接种可通过许多途径(包括非肠胃外途径)中的任一种递送，例如静脉、皮下或肌内。疫苗可与佐剂一起给药以加强免疫应答。

载体：载体是允许插入外源核酸而不会破坏所述载体在宿主细胞内的复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包含这样的核酸序列，即所述核酸序列使其能够在宿主细胞内复制，例如复制起点。插入型载体能够将自身插入宿主核酸中。载体还可包括一种或多种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是含有必需调控序列以允许转录和翻译插入的一个或多个基因的载体。在本公开内容的一些实施方案中，所述载体编码流感HA、NA或M1蛋白。在一些实施方案中，所述载体是pTR600表达载体(美国专利申请公开No.2002/0106798；Ross et al.,Nat Immunol.1(2):102-103,2000；Green et al.，Vaccine20:242-248,2001)。

病毒样颗粒(VLP)：由一个或多个病毒结构蛋白组成，但没有病毒基因组的病毒颗粒。由于VLP没有病毒基因组，他们是非传染性的。此外，VLP经常可通过异源表达产生且可容易地被纯化。大多数VLP至少包括驱动颗粒从宿主细胞出芽和释放的病毒核心蛋白。这类核心蛋白的一个实例是流感M1。在本文的一些实施方案中，流感VLP包含HA、NA和/或M1蛋白。流感VLP可通过使用编码HA和NA蛋白和任选的M1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生。将所述转染的细胞孵育适当的一段时间以使得蛋白表达(例如约72小时)后，可从细胞培养物上清液中分离VLP。实施例4提供了从细胞上清液中纯化流感VLP的示例性方案。在这个实施例中，通过低速离心(以去除细胞碎片)、真空过滤以及通过20％甘油的超速离心来分离VLP。其他产生流感VLP的方法在本领域中已知(见，例如，美国专利申请公开号2006/0263804；2008/0031895；2010/0166769；和2010/0239610)。

除非另有说明，本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。除非上下文中另有明确说明，单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象。“包含A或B”意指包括A，或B，或者A和B。还应该理解，对于核酸或多肽给出的全部碱基大小或氨基酸大小以及全部分子量或分子质量值是近似值，并且用于表述目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实施或测试，但适合的方法和材料在下文描述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。如果出现冲突，以本说明书(包括对术语的解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的，不意欲进行限制。

III.若干实施方案的概述

本文公开了用于引起针对流感病毒的广泛反应性免疫应答的以计算方式优化的H5N1和H1N1流感HA多肽的产生。基于所选择的H5N1和H1N1流感病毒分离株，通过一系列的HA蛋白比对和随后的共有序列产生，开发了所述优化的HA多肽。用于产生所述优化的HA共有序列的方法记载于实施例1和2中并示出于如图1和2中。两个具体HA多肽的氨基酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:1(H5N1)和SEQ ID NO:2(H1N1)。使用来自进化枝0、1、2.1、2.2、2.3和7的426个人H5N1分离株来产生所述H5N1序列，并在本文中将其称为“PATH H5N1 COBRA”HA。使用205个人和猪H1N1流感病毒分离株来产生所述H1N1序列，并在本文中将其称为“PATH H1N1 COBRA”HA。

本文提供了用于引起针对H5N1或H1N1流感的广泛反应性免疫应答的具有优化的氨基酸序列的重组流感HA多肽。在一些实施方案中，所述HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。

在其他实施方案中，所述HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的第2-568位残基或SEQ ID NO:2的第2-566位残基的氨基酸序列或由其组成。

还提供了编码本文公开的重组流感HA多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，对所述核酸分子进行密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。还任选地将所述核酸分子进一步优化以用于RNA稳定性。

本公开内容还提供了包含编码重组HA多肽的核酸分子的载体。所述载体可以是任何适用于表达所述HA多肽的载体，例如哺乳动物表达载体。在具体实例中，所述载体为pTR600表达载体(美国专利申请公开No.2002/0106798，以引用的方式纳入本文；Ross et al.,NatImmunol.1(2):102-103,2000；Green et al.,Vaccine 20:242-248,2001)。

在一些实例中，所述载体包括可操作地连接至编码所述HA多肽的核酸序列的启动子。在具体实例中，所述启动子为CMV启动子。

还提供了包含所公开的载体的分离的细胞。在某些情况下，所述细胞为任何适用于产生和表达VLP的细胞类型，例如哺乳动物细胞。

还提供了包含本文公开的优化的HA多肽的流感VLP。所述流感VLP还可包括形成所述病毒颗粒所必需的任何其他流感蛋白。在一些实施方案中，所述流感VLP还包括流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(M1)蛋白或其两者。

还提供了包含本文公开的流感HA多肽的流感VLP，所述流感VLP是通过在足以允许所述HA、M1和NA蛋白表达的条件下用编码所述HA多肽的载体、编码流感NA蛋白的载体和编码流感M1蛋白的载体转染宿主细胞而产生。

本公开内容还提供了包含优化的流感HA多肽的融合蛋白。

本文还提供了这样的组合物，即其包含本文公开的优化的流感HA蛋白、或包含所述优化的流感HA蛋白的融合蛋白或VLP。在一些实施方案中，所述组合物还包含可药用载体和/或佐剂。例如，所述佐剂可为明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。

还提供了一种通过给予如本文所公开的优化的流感HA蛋白、含有优化的流感HA的融合蛋白、含有优化的流感HA的VLP、或其组合物，在受体中引起针对流感病毒的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述流感病毒为H5N1或H1N1流感病毒。在一些实施方案中，可使用任何适合的给药途径(例如，肌内、鼻内或口服)给予所述HA蛋白、HA融合蛋白或VLP。在一些实施方案中，所述HA蛋白、融合蛋白或VLP作为还包含可药用载体和/或佐剂的组合物被给予。例如，所述佐剂可为明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。

还提供了通过给予受试者含有本文公开的优化的流感HA蛋白的VLP或给予其组合物，而使所述受试者对流感病毒免疫的方法。在所述方法的一些实施方案中，所述组合物还包含可药用载体和/或佐剂。例如，所述佐剂可为明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。在一些实施方案中，所述VLP(或其组合物)通过肌内给予。

在引起免疫应答或免疫受试者的方法的一些实施方案中，给予所述受试者约1-约25μg的含有优化的HA蛋白的VLP。在具体实例中，给予所述受试者约5-约20μg的所述VLP，或约10-约15μg的所述VLP。在一个具体的非限制性的实例中，给予所述受试者约15μg的所述VLP。然而，本领域技术人员能够确定待给予受试者的VLP的治疗有效量(例如提供针对H5N1或H1N1流感病毒感染的保护作用的量)。

IV.流感

流感病毒是属于正粘病毒科家族的分段的负链RNA病毒。有A、B和C三种类型的流感病毒。A型流感病毒感染多种鸟类和哺乳动物，包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。在动物中，大多数A型流感病毒引起温和的呼吸道和肠道的局部感染。然而，高致病性A型流感毒株(例如H5N1)引起家禽的全身感染，其中死亡率可达到100％。感染A型流感的动物常充当流感病毒的库(reservoir)，并且某些亚型已经被证明可跨越物种屏障而感染人。

基于编码表面糖蛋白(即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其是病毒吸附和细胞释放所必需的)的两个基因的抗原性区域中的等位基因变异，可将A型流感病毒分为多个亚型。目前，已知A型流感病毒的16个HA亚型(H1-H16)和9个NA(N1-N9)抗原性变体。以前，已知只有3个亚型在人中传播(H1N1、H1N2和H3N2)。然而，近些年，如在1997年和2003年香港所记录的，已经报道A型禽流感的致病性H5N1亚型跨越物种屏障并感染人，导致一些患者的死亡。

2009年，H1N1流感是人流感的最普遍病因。猪来源的H1N1的新毒株在2009年出现，并被世界卫生组织宣布为大范围流行。该毒株称作“猪流感”。H1N1A型流感病毒也是1918年的西班牙流感大流行、1976年的迪克斯堡爆发和1977-1978年的俄罗斯流感大流行的病因。

所述流感病毒分段基因组含有8个负义RNA(nsRNA)基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)，所述8个负义RNA基因片段编码至少10个多肽，包括RNA指导的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA1和HA2亚基)、基质蛋白(M1和M2)和非结构蛋白(NS1和NS2)(Krug et al.,In“The Influenza Viruses,”R.M.Krug,ed.,Plenum Press,N.Y.,1989,pp.89152)。

流感病毒引起广泛传播的疾病的能力是由于其通过产生抗原改变而逃避免疫系统的能力，该过程被认为发生在宿主同时感染动物流感病毒和人流感病毒时。在宿主中的突变和重排过程中，所述病毒可将来源于另一病毒的HA和/或NA表面蛋白基因整合到其基因组中，从而产生新的流感亚型并逃避免疫系统。

HA是病毒表面糖蛋白，一般包括约560个氨基酸并占总病毒蛋白的25％。它负责在感染早期病毒颗粒吸附及侵入宿主细胞。病毒HA0前体切割为HA1和HA2亚片段是所述病毒感染细胞的必需步骤。因此，需要切割以将宿主细胞内的新病毒颗粒转化成能够感染新细胞的病毒粒子。已知切割发生在完整的HA0膜蛋白从受感染细胞的内质网转运至质膜的过程中。在转运过程中，血凝素经历一系列的共翻译和翻译后修饰，包括前体HA被蛋白水解切割为氨基末端片段HA1和羧基末端HA2。在原代组织培养物或已建立的细胞系中培养流感病毒株的主要困难之一，源于需要在所述宿主细胞对流感血凝素内进行蛋白水解切割活化。

虽然已知未切割的HA可介导病毒吸附于细胞表面上其含有神经氨酸的受体，但其不能够进行感染周期的下一个步骤，即融合。已经报道，需要通过切割暴露HA2的疏水氨基末端，以使其可被插入至靶细胞，从而形成病毒和靶细胞膜之间的桥接。这个过程之后，所述两种膜的融合以及病毒进入靶细胞中。

HA的蛋白水解活化包括由胰蛋白酶样内切蛋白酶在精氨酸残基处进行切割，所述胰蛋白酶样内切蛋白酶常为钙依赖的且具有中性pH最适条件的细胞内酶。由于所述活化的蛋白酶为细胞酶，被感染细胞的类型决定HA是否被切割。哺乳动物流感病毒和非致病性禽流感病毒的HA仅在有限数量的细胞类型中对蛋白水解性切割敏感。另一方面，在H5和H7亚型中的致病性禽病毒的HA被存在于很多不同宿主细胞中的蛋白酶切割。因此，由于与病毒的致病性质相关的血凝素切割能力不同，导致了宿主范围的不同。

神经氨酸酶(NA)是流感病毒的第二膜糖蛋白。已经证明，病毒NA的存在对于产生针对传染性病毒的多面性的保护性免疫应答是重要的。对于大多数A型流感病毒，NA的长度为413个氨基酸，且由具有1413个核苷酸的基因编码。在流感病毒中已经鉴定了9个不同的NA亚型(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，所有这些NA亚型已经在野生鸟类中发现。NA通过从受感染细胞表面的碳水化合物部分切割末端神经氨酸(也称唾液酸)残基，参与破坏病毒HA的细胞受体。NA还从病毒蛋白上切割唾液酸残基，防止病毒的聚集。利用这种机制，假定NA通过如下方式促进病毒子代的释放：阻止新形成的病毒颗粒沿着细胞膜聚积，以及通过促进所述病毒通过存在于粘膜表面上的粘液的转运。NA是发生抗原变异的重要抗原决定簇。

除了所述表面蛋白HA和NA之外，流感病毒包括6种其他的内部基因，其产生8种不同蛋白质，包括聚合酶基因PB1、PB2和PA，基质蛋白M1和M2，核蛋白(NP)及非结构蛋白NS1和NS2(Horimotoet al.,Clin Microbiol Rev.14(1):129-149,2001)。

为了组装成子代病毒颗粒，病毒RNA作为由三种流感病毒聚合酶蛋白、核蛋白(NP)和病毒RNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体，与流感病毒基质1(M1)蛋白和核输出蛋白相结合，被从核中转运(Marsh et al.,J Virol,82:2295-2304,2008)。位于包膜内的M1蛋白被认为在装配和出芽方面发挥作用。有限数量的M2蛋白被整合入病毒粒子中(Zebedee,J.Virol.62:2762-2772,1988)。它们形成具有H+离子通道活性的四聚体，且当被核内体中的低pH激活时，它们将酸化病毒粒子的内部，促进其脱壳(Pinto et al.,Cell 69:517-528,1992)。金刚烷胺是一种抗流感药，其通过干扰M2离子通道活性从而抑制病毒脱壳，来预防病毒感染。

NS1--一种非结构蛋白--具有多重功能，包括调控细胞mRNA的剪接和出核转运以及刺激翻译。NS1的主要功能似乎是抵消宿主的干扰素活性，因为在干扰素无缺陷的细胞中，NS1敲除的病毒虽然有活力，但其生长效率比亲本病毒低(Garcia-Sastre,Virology 252:324-330,1998)。

已经在病毒颗粒中检测到NS2(Richardson et al.,Arch.Virol.116:69-80,1991；Yasuda et al.,Virology 196:249-255,1993)。估计病毒颗粒中的NS2蛋白的平均数量为130-200个分子。体外结合测定法证明在M1和NS2之间有直接的蛋白-蛋白接触。还已经通过在病毒感染的细胞的溶胞产物中的免疫沉淀检测到NS2-M1复合体。NS2蛋白被认为通过与M1蛋白的相互作用，在RNP从核的输出中起作用(Wardet al.,Arch.Virol.140:2067-2073,1995)。

V.流感VLP及其给药

本文提供了包含优化的HA(例如具有如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的HA)的流感VLP。所述流感VLP一般由HA、NA和M1蛋白组成。流感VLP的产生已经在本领域中描述，且在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以通过使用编码所述HA、NA和M1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生流感VLP。将所述转染的细胞孵育适当的时间(例如约72小时)以使蛋白表达后，可从细胞培养物上清液中分离VLP。下文的实施例4提供了从细胞上清液中纯化流感VLP的示例性方案。在该实施例中，通过低速离心(以去除细胞碎片)、真空过滤和通过20％甘油的超速离心，来分离VLP。

本文公开的流感VLP可用作流感疫苗，以引起针对H5N1和H1N1流感病毒的保护性免疫应答。

可通过通常用于将重组病毒导入受试者中的任何途径，将流感VLP或其组合物给予受试者。给药方法包括，但不限于，真皮内、肌内、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、阴道、直肠、鼻内、吸入或口服。肠胃外给药(例如皮下、静脉内或肌内给药)一般通过注射完成。注射剂(injectable)可以以常规的形式制备，为液体溶液或悬液、适合用于注射前液体中的溶液或悬液的固体形式，或为乳剂形式。可由之前所描述的那些种类的无菌粉剂、粒剂和片剂来制备注射溶液和悬液。给药可以是全身的或局部的。

以任何合适的方式(例如与可药用载体一起)给予流感VLP或其组合物。可药用载体部分地由被给予的具体组合物，以及用以给予所述组合物的具体方法来确定。因此，有多种本公开内容的药物组合物的合适制剂。

用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳剂。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外的载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一些组合物可潜在地作为可药用的酸加成盐或碱加成盐被给予，所述酸加成盐是通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，以及有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸和延胡索酸反应而形成，所述碱加成盐是通过与无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，以及有机碱例如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳香基胺及取代的乙醇胺反应来形成。

可通过单剂量或多剂量来完成给药。在本公开内容的上下文中给予受试者的剂量应足以随着时间的推移在受试者中诱导有益的治疗反应，或足以抑制或预防H5N1或H1N1流感病毒感染。所需剂量根据受试者的物种、年龄、重量和综合状况、所治疗的感染的严重性、所使用的具体组合物及其给药方式而在各个受试者之间不同。本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定适当的剂量。

本文提供了包括治疗有效量的单独的或与可药用载体组合的流感VLP的药物组合物。可药用载体包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇，及其组合。所述载体和组合物可为无菌的，且所述制剂适合所述给药方式。所述组合物还可含有较少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述组合物可为液体溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂。所述组合物可与惯常的粘合剂和载体(例如甘油三酯)制成栓剂。口服制剂可包括标准载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。可使用任何常见的药物载体，例如无菌盐溶液或芝麻油。所述介质还可含有常规的药物辅助物质例如，用于调整渗透压力的可药用盐、缓冲液、防腐剂等。可与本文提供的组合物和方法共同使用的其他介质为生理盐水和芝麻油。

本文描述的流感VLP可单独给予或与其他治疗剂组合给予以增强抗原性。例如，所述流感VLP可与佐剂(例如弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂)一起给予。

任选地，一种或多种细胞因子，例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ，一种或多种生长因子，例如GM-CSF或G-CSF；一种或多种分子例如OX-40L或41BBL，或这些分子的组合，可用作生物佐剂(参见，例如，Salgaller et al.,1998,J.Surg.Oncol.68(2):122-38；Lotze et al.,2000,Cancer J.Sci.Am.6(Suppl1):S61-6；Cao et al.,1998,Stem Cells 16(Suppl 1):251-60；Kuiper etal.,2000,Adv.Exp.Med.Biol.465:381-90)。可将这些分子全身性(或局部性)给予宿主。

已知很多在体外和体内诱导细胞应答的方式。脂质已经被鉴定为能够协助引发针对多种抗原的体内CTL的试剂。例如，如美国专利No.5,662,907所描述，棕榈酸残基可结合到赖氨酸残基的α和ε氨基上，然后连接(例如，通过一个或多个连接残基，例如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)到免疫原性肽上。然后可将所述脂质化的肽以微团形式直接注射、整合到脂质体或乳化于佐剂中。在另一实例中，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白(例如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)，当其共价结合到适当的肽上时，可用于引发肿瘤特异性的CTL(参见，Deres et al.,Nature342:561,1989)。此外，因为中和抗体的诱导还可使用缀合至展示出适当表位的肽上的相同分子来引发，所以当认为需要时可以组合两种组合物，以引起体液和细胞介导的应答。

虽然本文举例说明了给予含有优化的HA蛋白的VLP，但是本领域技术人员应理解，还可以给予所述优化的流感HA蛋白本身(无病毒颗粒的情况下)或作为融合蛋白给予，以在受试者中引起免疫应答。

提供了以下实施例以举例说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开内容限制在所描述的具体特征或实施方案中。

实施例

实施例1：H5N1流感COBRA序列的产生

本实施例描述了使用来自进化枝0、1、2.1、2.2、2.3和7的426个人H5N1流感HA序列来产生H5N1流感HA COBRA共有序列。所得的COBRA序列被称为“PATH H5N1 COBRA”。

为产生最终的H5N1流感HA COBRA序列，产生了三个层级的共有序列(图1)。在第一层级中，使用(1)5个进化枝0的分离株；(2)86个进化枝1的分离株；(3)106个进化枝2.1的分离株；(4)97个进化枝2.2的分离株；(5)34个进化枝2.3的分离株及(6)1个进化枝7的分离株，产生了6个独立的共有序列。在第二层级中，使用3个在所述第一层级中产生的进化枝2共有序列(进化枝2.1、进化枝2.2和进化枝2.3共有序列)产生了进化枝2共有序列。使用在所述第一层级中产生的单独的进化枝0、进化枝1和进化枝7共有序列和在所述第二层级中产生的进化枝2共有序列，产生了最终的共有序列。该PATH H5N1 COBRA序列如下文所示，并在本文中示出为SEQ ID NO:1。

PATH H5N1 COBRA HA(SEQ ID NO:1)

MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKASPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSNHEASSGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFLAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVKNGTYDYPQYSEEARLNREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLXLXIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI

实施例2：H1N1流感COBRA序列的产生

本实施例描述了使用205个人和猪H1N1流感HA序列来产生H1N1流感HA COBRA共有序列。所得COBRA序列被称为“PATHH1N1 COBRA”。

为产生最终H1N1流感HA COBRA序列，产生两个层级的共有序列(图2)。在第一层级中，使用(1)1933-1934年分离的8个人毒株；(2)1935-1947年分离的13个人毒株；(3)1948-1957年分离的12个人毒株；(4)2009-2011年分离的123个人毒株和(5)49个猪毒株，产生了5个独立的共有序列。使用在所述第一层级中产生的5个独立的共有序列，产生了最终共有序列。该PATH H1N1 COBRA序列如下文所示，并在本文中示出为SEQ ID NO:2。

PATH H1N1 COBRA HA(SEQ ID NO:2)

MKARLLVLLCALAATDADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNLAGWLLGNPECESLLSARSWSYIVETPNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTKKGGSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPSTSTDQQSLYQNENAYVSVVSSNYNRRFTPEIAERPKVRGQAGRMNYYWTLLEPGDTIIFEATGNLIAPWYAFALSRGSGSGIITSNASMHECNTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGALAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

实施例3：密码子优化的COBRA基因序列

本文公开的COBRA氨基酸序列被反向翻译，并被优化以用于在哺乳动物细胞中表达，包括密码子使用和RNA优化(GeneArt；Regensburg,Germany)。可将优化的核酸序列插入适当的表达载体，例如pTR600表达载体中(美国专利申请公开No.2002/0106798；Rosset al.,Nat Immunol.1(2):102-103,2000；Green et al.,Vaccine20:242-248,2001)。编码所述密码子优化的COBRA基因序列的表达载体可用于，例如，产生含有所述COBRA HA的VLP。

实施例4：制备流感VLP并使用流感VLP进行免疫

以下方法可用于产生和表征包含COBRA HA的流感VLP。免疫小鼠、雪貂和猕猴的示例性方法也如下所述(也参见，Giles and Ross,Vaccine 29(16):3043-3054,2011)。

疫苗制备

使用表达M1、NA和优化的HA的质粒瞬时转染293T细胞，在37℃下孵育72小时。所述编码M1、NA和HA的序列可被密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。收集上清液，通过低速离心及随后通过0.22μm无菌滤器进行真空过滤来去除细胞碎片。通过在4℃下超速离心(100,000x g通过20％甘油，重量/体积)4小时来纯化VLP。然后将所得沉淀重悬于pH 7.2的PBS中，并以单次使用的等分试样保存于-80℃直至使用。使用Micro BCA^TM蛋白测定试剂盒(PierceBiotechnology,Rockford,IL,USA)确定总蛋白浓度。

剂量确定

可通过蛋白质印迹和密度测定法(densitometry assay)来确定HA具体含量。以标准总蛋白量制备纯化的重组体COBRA HA和纯化的VLP，将其在10％SDS-PAGE凝胶上电泳，并转移至PVDF膜。将所述印迹用来源于流感感染的小鼠的小鼠多克隆抗血清探测，使用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech；Birmingham,AL,美国)检测HA-抗体复合体。用化学发光底物(Pierce Biotechnology；Rockford IL,美国)检测HRP，曝光到X-光片(ThermoFisher；Pittsburgh,PA,美国)。用ImageJ软件(NIH)确定条带密度。重组体HA条带的密度用于计算标准曲线，并且使用所述重组体HA的结果内插所述纯化VLP的密度。

小鼠研究

BALB/c小鼠(小家鼠(Mus musculis),雌性,6-8周龄)可购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN,美国)。小鼠饲养在微隔离单元(microisolator unit)中，自由取食食物和水，并根据USDA的用于实验室动物的指导管理。在0周时，基于密度测定法获得的HA含量，通过肌内注射，用纯化的COBRA HA VLP的三个剂量(1.5μg、0.3μg或0.06μg)之一接种小鼠，然后在第3周时用相同剂量加强。每个剂量的疫苗都用明矾佐剂(Imject Alum,PierceBiotechnology；Rockford,IL,美国)、CpG寡核苷酸或单独的载体配制。每次疫苗接种后的14-21天，从麻醉的小鼠中经眶后丛收集血液，并转移至微量离心管中。将管离心，移出血清，并将其冷冻于-80±5℃。在第5周时，使用代表性的重排病毒(reassortant virus)或COBRA HA VLP来确定每个疫苗组的血凝抑制(HAI)血清抗体滴度。

末次接种后三周，用50μl体积的致病性H5N1或H1N1流感病毒对小鼠进行鼻内激发。感染后，在感染后的14天内，每天监测小鼠的体重减轻、疾病征象和死亡。接种后，每天记录每组的个体体重、疾病评分(Toapanta and Ross,Respiratory Research 10(1):112,2009)和死亡。

雪貂研究

艾鼬雪貂(Fitch ferret，Mustela putorius furo，雌性，6-12月龄)，未感染过流感且去臭腺(de-scented)，可购自马歇尔农场(Sayre,PA,美国)。雪貂成对饲养于含有Sani-chipsLaboratory AnimalBedding(P.J.Murphy Forest Products,Montville,NJ,USA)的不锈钢笼子(Shor-line,Kansas City,KS,USA)中。无限制地给雪貂提供TekladGlobal Ferret Diet(Harlan Teklad,Madison,WI,USA)和淡水。用pH7.2的PBS稀释所述COBRA HA VLP至终浓度。在0周时，基于通过密度测定法确定的HA含量，通过以0.25ml的体积，用纯化的COBRA HA VLP的两个剂量(15μg、3μg)之一在四头肌处肌内注射免疫雪貂，然后在第3周时用相同剂量加强。疫苗在使用前在-80℃下保存，用明矾佐剂(Imject Alum；Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)配制后立即使用。在接种方案期间每周监测动物的不利事件，包括体重减轻、体温、活动减少、流涕、打喷嚏和腹泻。接种之前，通过HAI测定确认动物对于传播的A型流感和B型流感病毒是血清反应阴性的。每次接种后14-21天，从麻醉的雪貂中经前腔静脉收集血液，并转移至微量离心管中。将管离心并移出血清，将血清冷冻于-80±5℃。第5周时，使用有代表性的重排病毒或COBRA HA VLP，确定每个疫苗组的HAI血清抗体滴度。

末次接种后三周，用1ml体积的致病性H5N1或H1N1流感病毒对雪貂进行鼻内攻击。感染后，在感染后的14天内，每天监测雪貂的体重减轻、疾病征象和死亡。接种后，每天记录每组的个体体重、患病评分和死亡。接种后的7天内，每天通过将3ml的PBS滴入麻醉的雪貂的鼻孔内，来进行鼻洗涤。收集洗涤物并保存于-80℃直至使用。

灵长类免疫接种

短尾猕猴(Cynomolgus macaques)(食蟹猴(Macacafascicularis)，雄性，3-5岁)可购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN,美国)。在0周时，基于密度测定法获得的HA含量，通过肌内注射，用纯化的COBRA HA VLP(15μg)接种猕猴，然后在第3周和第6周时用相同剂量加强。疫苗用明矾佐剂(ImjectAlum；Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)配制后立即使用。每次接种后21天，从麻醉的猕猴经股静脉收集血液，并将血液转移至血清分离管中。使管中血液凝结，然后离心，移出血清并将血清冷冻在-80±5℃下。在第5周时，使用有代表性的重排病毒或COBRA HAVLP确定每个疫苗组的终点IgG滴度和HAI血清抗体滴度。

末次接种后三周，用1ml体积的致病性H5N1或H1N1流感病毒通过鼻内、气管内和眼窝接种对猕猴进行攻击。感染后，在感染后的5天内，每天监测猕猴的体重减轻、疾病征象和死亡。接种后，每天记录每组的个体体重、患病评分和死亡。

实施例5：含有PATH H5N1 COBRA HA的VLP的免疫原性和保护效能

本实施例描述了4个在小鼠中进行的研究，以测试PATH H5N1COBRA HA VLP的免疫原性和保护效能。

COBRA研究1

进行该研究以测试PATH H5N1 COBRA HA VLP的免疫原性以及针对进化枝1和进化枝2攻击的保护效能。使用含有人进化枝2COBRA HA的VLP(人COBRA-2 VLP)进行比较。

用3μg的含有所述PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有所述人COBRA-2 HA序列的VLP或含有大天鹅(A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005)流感病毒HA的VLP通过肌内接种小鼠。在第0周和第3周时在使用佐剂(Imject^TM)的情况下进行疫苗接种。在第5周期间，用5000PFU的印度尼西亚进化枝2.1病毒(A/Indonesia/5/2005)或5000PFU的越南进化枝1病毒(A/Vietnam/1203/2004)攻击小鼠。在第0周、第3周和第5周时收集血液样品。在攻击后的第3天(D3)收获肺用于测定病毒滴度。

图3示出了在接种的小鼠中针对PATH H5N1 COBRA VLP(阳性对照)、越南进化枝1病毒、印度尼西亚进化枝2.1病毒、大天鹅进化枝2.2病毒、埃及/3300/08进化枝2.2.1、埃及/321/07进化枝2.2.1、安徽进化枝2.3病毒和鸡/越南进化枝7病毒的HAI滴度。该结果证明，使用含有PATH H5N1 COBRA HA的VLP进行的疫苗接种可引起能够识别进化枝1和进化枝2流感病毒的抗体应答。

图4和图5分别示出了用印度尼西亚进化枝2.1和用越南进化枝1攻击后直至第14天(D14)，接种的小鼠和未接种的小鼠的体重。如图4中所示，随着时间的推移，所有接种的小鼠的体重变化很小，而未接种的小鼠的体重在用进化枝2.1病毒攻击后第5天(D5)表现出急剧降低。如图5中所示，用PATH H5N1 VLP接种的小鼠的体重在用进化枝1病毒攻击后没有明显变化。与此不同，未接种的小鼠在攻击后第三天开始，表现出快速的体重减轻。

COBRA研究2A

进行本研究以测试在用含有PATH H5N1 COBRA VLP的VLP对小鼠的单次接种后针对进化枝1攻击的保护效能。

用3μg含有所述PATH H5N1 COBRA HA序列(SEQ ID NO:1)的VLP、含有所述人COBRA-2 HA序列的VLP或含有大天鹅(A/Whooper Swan/Mongolia/244/2005)流感病毒HA的VLP通过肌内接种小鼠。在使用佐剂(Imject^TM)的情况下在第0周时进行疫苗接种。在第4周期间用5000PFU的印度尼西亚进化枝2.1病毒(A/Indonesia/5/2005)或5000PFU的越南进化枝1病毒(A/Vietnam/1203/2004)攻击小鼠。在第0周和第3周时收集血液样品。在攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定病毒滴度。

如图6中所示，在用越南进化枝1病毒攻击后，接种的小鼠的体重没有显著变化，而未接种的小鼠在第三天(D3)后显示出明显的体重降低。

COBRA研究4A

进行本研究以测试在不使用佐剂的情况下单次接种后，针对进化枝1病毒的保护效能。在不使用佐剂的情况下，用3μg的PATHH5N1 COBRA VLP、人COBRA-2 VLP或大天鹅VLP通过肌内接种小鼠。在第4周期间，用5000PFU的越南进化枝1病毒攻击小鼠。在第0周和第3周时收集血液样品。在攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定病毒滴度。

如图7中所示，未接种的小鼠到第7天都死于感染，而40-60％的接种的小鼠在攻击后14天仍存活。特别地，60％的用人COBRA-2VLP接种的小鼠在攻击后仍存活，而40％的用PATH H5N1 COBRAVLP或大天鹅VLP接种的小鼠在攻击后仍存活。

COBRA研究5A

进行本研究以测试在以较低剂量的VLP(0.6μg)与佐剂(Imject^TM)进行一次接种后，针对进化枝1病毒的保护效能。在存在佐剂的情况下，用0.6μg的PATH H5N1 COBRA VLP、人COBRA-2VLP或大天鹅VLP通过肌内免疫接种小鼠。在第4周期间用5000PFU的越南进化枝1病毒攻击小鼠。在第0周和第3周时收集血液样品。在攻击后的第2天(D2)和第3天(D3)收获肺用于测定测病毒滴度。

如图8中所示，接种的小鼠的体重在病毒攻击后轻微地降低但是到第10天恢复到正常水平。相反，未接种的小鼠的体重显著降低并且所述小鼠不会恢复。

鉴于所公开的发明的原理可应用于许多可能的实施方案，应认识到，所示出的实施方案只是本发明的优选实例，不应被认为是对本发明范围的限制。而是，本发明的范围是由以下的权力要求书限定。因此，申请人要求保护落入这些权利要求的范围和主旨的所有发明。