尖吻蝮蛇血凝酶-C

摘要

本发明提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶-C，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种血凝酶，分子量29213.4D，等电点5.7。该酶由α、β两条链构成，链间由二硫键连接，其中α链具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，β链具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。本发明丝氨酸蛋白酶是用以下纯化方法获得，包括通过硫酸铵分级沉淀预处理去除不溶物及杂蛋白，再通过两次阴离子交换柱层析，收集活性洗脱峰，经透析、超滤浓缩及脱盐后即得高纯度蛇毒血凝酶，其比活力不低于40U/mg蛋白，HPLC分析纯度可达95%以上，以蛇毒原料重量计纯化收得率为0.4%－0.5%。

说明书

本发明是下述发明的分案申请：

申请日：2013年02月21日 ；申请号：201310055128.3；发明名称：尖吻蝮蛇血凝酶–C。

技术领域

本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶-C，本发明还涉及其分离纯化方法。

背景技术

据国内外文献的报导，在蝮亚科（Crotalinae）蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”（thrombin-like enzyme, 简称：TLC）。类凝血酶与凝血酶（thrombin）的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。迄今已经发现现已在30多种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29～45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。

在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其代表产品“立芷雪”（Reptilase）是由巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）蛇毒中分离出的凝血酶，该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，相对分子量39～43kD，为单链糖蛋白。翟宁等（上海医药工业研究院&浙江海正药业）2005年报道：从皖南五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。SDS－PAGE显示为单链，还原和非还原电泳分子量分别为59.25kD和52.58kD，显示存在链内二硫键，比活为41.5/u/mg，苯甲基磺酰氟（PMSF）可导致该酶不可逆失活。

近十多年来的研究发现在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等（中国科技大学）1999年报导：从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α-亚基分子量15kD，β-亚基分子量14kD。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华（中科院昆明动物研究所）2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶Ⅰ的A亚基含有132个氨基酸，分子量16kD；B亚基含有123个氨基酸，分子量14kD，酶比活性为：160U/mg。凝血酶Ⅱ的A亚基含有122个氨基酸，分子量15kD；B亚基含有120个氨基酸，分子量13kD, 酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实验证明：均具有止血功效。唐松山2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。该酶由17kD和15kD两个亚基组成，等电点5.9。

本发明阐述从我国的广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutu)蛇毒中分离得到一种新的蛇毒血凝酶――尖吻蝮蛇血凝酶-C。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶-C。

本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。

本发明血凝酶-C是从中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）蛇毒中分离得到的血凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白含252个氨基酸，分子量为29213.4D，等电点pI为5.7。②由α、β两条链构成，链间由二硫键连接。③α链含129个氨基酸，分子量为14661.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；β链含123个氨基酸，分子量为14551.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟（PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。

本发明还提供上述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：

1）、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理；

2）、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE－Sephrose FF阴离子交换层析柱，用0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.02和0.06M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的 PBS分段洗脱，收集0.06M NaCl第一个洗脱峰；

3）、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经多次稀释超滤去除NaCl；

4）、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE－Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.0～7.5 的PBS洗柱，再用含0.05M NaCl的0.01M pH7.0～7.5 的PBS洗脱，收集0.05M NaCl洗脱的第二个洗脱峰；

5）、将上述洗脱液适当浓缩后用蒸馏水透析或采用Sephadex-G25柱脱盐。

其中，步骤1）蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01M pH7.0～7.5 PBS溶解，离心收集上清液，硫酸铵分级沉淀，收集70%硫酸铵沉淀，沉淀经PBS悬浮溶解后进行透析(透析袋截留分子量为7,000D~10,000D)，或采用切向流超滤（膜截留分子量为5,000D～10,000D）方法，将悬浮溶解液反复多次稀释、超滤浓缩脱盐。通过预处理可以去除不溶的杂质以及部分杂蛋白，并降低溶液离子强度。

具体地说，可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5~10倍体积预冷的0.01M pH7.0～7.5 的PBS于4~8℃的层析柜中搅拌溶解30~60分钟，向溶解液中缓慢添加硫酸铵至50％饱和度，静置2－4小时，之后于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟。收集离心上清液，再向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度，静置过夜，次日于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟。取离心沉淀加适量0.01M pH7.0～7.5的PBS悬浮溶解得溶解液。将溶解液倾入透析袋(截留分子量为7,000D~10,000D)，在层析柜中4~8℃对0.01M pH7.0～7.5的 PBS透析12~24小时，期间更换溶液2~4次；或将溶解液用分子截留值为5,000~10,000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱盐。

如上所述，透析步骤（取决于溶液体积）可采用切向流超滤（膜截留分子量为5,000~10000D）方法代替，通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。

其中，步骤2）和步骤4）可采用0.01M pH7.0～7.5 的PBS预平衡DEAE－Sephrose FF层析柱，然后上样。

其中，步骤3）和步骤5）的目的均是去除溶液中存在的NaCl。小体积洗脱液可直接进行透析，大体积洗脱液可通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以浓缩蛋白并脱去NaCl。最终被纯化的酶浓缩液可直接采用Sephadex-G25柱脱盐。

除盐后的溶液直接冷冻干燥，或加入冻干保护剂冷冻干燥。所述冻干保护剂可以是低分子右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、甘油、明胶等。不同冷冻保护剂的各自加入量为0.1%－2%(w/v)。

经本发明方法纯化的血凝酶比活力不低于40U/mg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）一条带，还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（还原SDS-PAGE）两条带；HPLC分析纯度95%以上。以蛇毒原料重量计，本法纯化收得率为0.4%－0.5%。

本发明血凝酶具有凝集活性，可制成各种止血药物，例如经适当稀释到规定酶活单位，再添加冻干保护剂（明胶或人血白蛋白等），经病毒膜过滤，冷冻干燥制成医用注射冻干粉针，用于外科手术中止血，以及各种临床出血症状。也可制成创伤外用止血贴剂、粉剂或液体喷雾剂。本发明提供一种新的血凝酶，扩大血凝酶种类，提高蛇毒利用率。

附图说明

图1 显示纯化后的血凝酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）为一条带（箭头所示）。

图2  显示纯化后的血凝酶-C经还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（RD-SDS-PAGE）为两条带（箭头所示），其中M为蛋白分子量标准，1为纯化后的血凝酶-C。

图3  显示纯化后的血凝酶-C的HPLC分析结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。本发明中类似“用蛇毒重量10倍体积预冷的”表述，其中的重量和体积的单位分别是g和ml。

实施例1 蛇毒血凝酶-C的纯化

取20g尖吻蝮蛇蛇毒干粉（批号：20061001，购自广西蛇毒研究所），用蛇毒重量10倍体积预冷的0.01M pH7.4 的磷酸钠盐缓冲液（PBS）于4℃的层析柜中搅拌溶解60分钟，于4℃、10000g离心10分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS搅拌洗涤，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4℃下静置4小时，使蛋白沉淀完全。之后将该溶液于4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟，4℃静置过夜。次日于4℃、10000g下离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用80ml 0.01M pH7.4 的PBS溶解后装入透析袋（分子量截至值为10000D）中，用0.01M pH7.4的 PBS进行缓慢搅拌透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液（105ml）。

将DEAE-Sephrose FF填料装至Φ3.5cm×30cm柱中，用0.01M 的PBS(pH7.4)平衡柱，待用。

将透析液上样到柱上，用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.02M NaCl的0.01M pH7.4的PBS洗脱，再用含0.06M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，收集洗脱的第一个峰。用含1M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。

经酶活测定（参照附录                                                或方法）和电泳分析，目的物出现在

0.06M NaCl溶液的洗脱峰中（176ml）。将该洗脱液倾入透析袋中，用0.01M pH7.4 的PBS于4℃透析，期间每6小时更换溶液一次，共换液3次。

将透析液上样到柱上，用0.01M pH7.4 的PBS冲洗柱。用含0.05MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，收集洗脱的第二个峰（145ml）。用含1MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。

经酶活测定（参照附录或方法）和电泳分析，目的物出现在

0.05M NaCl溶液的第二个洗脱峰中。测定溶液蛋白质浓度为0.64mg/ml。该溶液用无离子水进行透析16小时，期间换液3次。

透析溶液中总蛋白质含量为93mg，直接冷冻干燥。冻干粉测定酶比活力为48U/mg蛋白，最终收率0.47%。 PAGE为一条带（见图1），还原SDS－PAGE为两条带（见图2），其分子量分别大致为15kD和14.5kD。HPLC分析纯度97.3％（见图3及表1）。等电聚焦电泳测定该酶等电点pI为5.7。

表1 HPLC定量结果

采用DENOVO法测定其氨基酸序列，确定两条带的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。α链（SEQ ID No.1）含129个氨基酸，分子量为14661.7Dalton；β链（SEQ ID No.2）含123个氨基酸，分子量为14551.7Dalton。完整血凝酶-C分子量为29213.4Da。α链和β链间由二硫键连接。

实施例2 蛇毒血凝酶-C的纯化

取50g尖吻蝮蛇蛇毒干粉（批号：20061101，购自广西蛇毒研究所），用蛇毒重量10倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS于4℃的层析柜中搅拌溶解60分钟，于4℃、10000g离心10分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4℃下静置4小时，使蛋白沉淀完全。之后将该溶液于4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。

在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟，4℃下静置过夜。次日于4℃、10000g下离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用200ml的0.01M pH7.4 的PBS溶解，装入透析袋中，用0.01M pH7.4 的PBS进行搅拌透析，每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液（223ml）。

DEAE-Sephrose FF填料装至Φ5cm×30cm柱中，用 pH7.4的 0.01M磷酸钠盐缓冲液平衡柱后。将透析液上样。用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.02M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗脱。再用含0.06M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，收集洗脱的第一个峰（395ml）。用含1M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。

经酶活测定（参照附录或方法）和电泳分析，目的物出现在0.06M NaCl溶液的洗脱峰中。将该洗脱液倾入透析袋中，用0.01M pH7.4的PBS于4℃透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。

将透析液上样至柱上。用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.05M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS脱柱，收集洗脱的第二个峰（375ml）。用含1M氯化钠的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生。用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱。平衡后待用。

将该洗脱液倾入透析袋中，用0.01M pH7.4的PBS于4℃透析，期间每6小时换液一次，共换液3次。透析溶液中总蛋白质含量为230mg，直接进行冷冻干燥。冻干粉酶比活力为50U/mg蛋白，最终收率0.46%。PAGE和还原SDS－PAGE以及HPLC色谱图与实施例1相一致，HPLC分析纯度98.1％。

实施例3 蛇毒血凝酶-C的纯化

称取100克尖吻蝮蛇蛇毒干粉（批号20061101，购自广西蛇毒研究所）用1升预冷的0.01M pH7.4 的PBS于4－8℃的层析柜中搅拌溶解60分钟， 4℃10000g离心20分钟，收集上清液。离心沉淀再次加入蛇毒重量5倍体积预冷的0.01M pH7.4 的PBS搅拌悬浮，再次离心。合并两次离心上清液。在搅拌条件下向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至50%饱和度，待硫酸铵完全溶解后再持续搅拌20分钟，4℃下静置4小时，使蛋白沉淀完全。之后将该溶液于4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。在搅拌条件下向该上清液中缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵饱和度升至70%。待硫酸铵彻底溶解完全，继续搅拌20分钟后停止搅拌，4℃静置过夜。次日于4℃、10000g离心20分钟。弃去上清液，收集沉淀蛋白。沉淀蛋白用400ml的pH7.4的0.01M磷酸钠盐缓冲液溶解，装入透析袋中，用0.01M pH7.4的PBS进行透析，每6小时换液一次，共换液3次。透析完成后取出透析液。

DEAE-Sephrose FF填料装至Φ7cm×30cm柱中，用 0.01M pH7.4 的PBS平衡柱后。将透析液上样。用0.01M pH7.4 的PBS洗柱。用含0.02MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱，再用含0.06MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱。收集洗脱的第一个峰（876ml）。用含1MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生，用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。

经酶活测定（参照附录或方法）和电泳分析，目的物出现在0.06M NaCl溶液的洗脱峰中。用Millipore Pellicon 2 切向流超滤器（0.1M²cut off 5k膜）将洗脱液超滤浓缩至200ml，再加入预冷的1升0.01M pH7.4的PBS，再超滤至200ml。该超滤浓缩过程循环3次。

将超滤浓缩液上样至柱上，用含0.05MNaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗脱。收集0.05M NaCl溶液的第二个洗脱峰（810ml）。用含1M NaCl的0.01M pH7.4 的PBS洗柱再生，用0.01M pH7.4 的PBS平衡柱，平衡后待用。

将洗脱液用Millipore Pellicon 2 切向流超滤器（0.1M²cut off 5k膜）超滤浓缩至200ml。将该浓缩液上样至Sephadex-G25柱上，用无离子水洗柱脱盐，收集洗脱峰230ml。测定该溶液中总蛋白为503mg，比活力为47U/mg蛋白，最终收率0.5%。

脱盐收集液PAGE和还原SDS－PAGE以及HPLC色谱图与实施例1相一致。HPLC纯度达97.5％。

按脱盐收集液体积加入1%甘露醇、0.5%明胶作为冻干保护剂。滤液分装西林瓶后进行冷冻干燥。

实施例4 蛇毒血凝酶-C的丝氨酸蛋白属性实验

将实施例1中分离得到的血凝酶-C冻干粉用无离子水溶解，并稀释至酶活性为1U/ml。

用生理盐水配制1％的牛纤维蛋白原（Sigma公司）溶液。

用异丙醇溶解苯甲基磺酰氟（PMSF，Merck公司），溶液浓度为4mg/ml。

实验操作步骤如下：

（1）   取1%牛纤维蛋白原溶液2ml，37℃下恒温5分钟。

（2）   取三支小试管，分别标注1#、2#、3#，每管加入200μl血凝酶溶液。

（3）   分别向1#试管加入10μl蒸馏水，2#试管加入10μl异丙醇，3#试管加入10μl PMSF，于37℃水浴保温5分钟。

（4）   按试管编号顺序分别单独进行凝集试验观察。向试管中加入恒温好的1％牛纤维蛋白原溶液200μl，立即计时，同时轻轻摇动混匀，于37℃水浴中静置，观察试管中凝集反应的情况。以溶液白色絮团终止计时。

结果见表2

       表2、  PMSF对凝集时间的影响              

试管号1%纤维蛋白原溶液血凝酶溶液1U/ml考查内容凝集时间1#200μl200μl10μl蒸馏水56秒2#200μl200μl10μl异丙醇58秒3#200μl200μl10μl PMSF>600秒

根据表一中的实验结果，得出以下结论：①100ppm浓度的PMSF完全抑制了该血凝酶活性，证明该尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。②微量异丙醇对本凝集反应无影响。

附录

尖吻蝮蛇血凝酶单位定义及活性测定方法

①牛纤维蛋白原测定法   取生理盐水配制的1.0％牛纤维蛋白原（Sigma公司）溶液1ml置小试管中，37±0.5℃水浴保温3分钟，加入37±0.5℃预热的待测酶溶液1ml，立即计时，纤维蛋白原溶液在120±30秒内振摇出现白色絮团，则该酶溶液为1U/ml。

②标准人血浆测定法   取标准人血浆1ml置小试管中，置37℃±0.5℃水浴中预热3分钟，加入37±0.5℃预热的待测酶溶液1ml，立即计时，人血浆在60±20秒内振摇出现白色絮团，则该酶溶液为1U/ml。

注：测定未知高酶活性溶液时需用无离子水进行稀释，直至达到1U/ml用于测定；其稀释倍数即为每毫升原酶溶液中的酶活单位数。

序列表

<110>  北京康辰药业股份有限公司

 

<120>  尖吻蝮蛇血凝酶-C

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  129

<212>  PRT

<213>  Agkistrodon acutus

 

<400>  1

 

Asp Cys Ser Ser Gly Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys

1               5                   10                  15 

Val Phe Lys Gln Ser Lys Thr Trp Ala Asp Ala Glu Ser Phe Cys

                20                  25                  30 

Thr Lys Gln Val Asn Gly Gly His Leu Val Ser Ile Glu Ser Ser

                35                  40                  45 

Gly Glu Ala Asp Phe Val Gly Gln Leu Ile Ala Gln Lys Ile Lys

                50                  55                  60 

Ser Ala Lys Ile His Val Trp Ile Gly Leu Arg Ala Gln Asn Lys

65                  70                  75 

Glu Lys Gln Cys Ser Ile Glu Trp Ser Asp Gly Ser Ser Ile Ser

                80                  85                  90 

Tyr Glu Asn Trp Ile Glu Glu Glu Ser Lys Lys Cys Leu Gly Val

                95                  100                 105

His Ile Glu Thr Gly Phe His Lys Trp Glu Asn Phe Tyr Cys Glu

                110                 115                 120

Gln Gln Asp Pro Phe Val Cys Glu Ala

                125

 

 

<210>  2

<211>  123

<212>  PRT

<213>  Agkistrodon acutus

 

<400>  2

 

Asp Cys Pro Ser Asp Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr Lys

1               5                   10                  15 

Pro Phe Asn Glu Pro Lys Asn Trp Ala Asp Ala Glu Asn Phe Cys

                20                  25                  30 

Thr Gln Gln His Thr Gly Ser His Leu Val Ser Phe Gln Ser Thr

                35                  40                  45 

Glu Glu Ala Asp Phe Val Val Lys Leu Ala Phe Gln Thr Phe Asp

                50                  55                  60 

Tyr Gly Ile Phe Trp Met Gly Leu Ser Asn Ile Trp Asn Gln Cys

65                  70                  75 

Asn Trp Gln Trp Ser Asn Ala Ala Met Leu Lys Tyr Thr Asp Trp

                80                  85                  90 

Ala Glu Glu Ser Tyr Cys Val Tyr Phe Lys Ser Thr Asn Asn Lys

                95                  100                 105

Trp Arg Ser Ile Thr Cys Arg Met Ile Ala Asn Phe Val Cys Glu

                110                 115                 120

Phe Gln Ala