一种通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供一种通过建立大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，首先建立外固定支架固定的大鼠应力骨折模型，造模成功后，取出骨折断端组织，分离迁移细胞并进行培养。通过控制固定骨折处的力学环境，募集间充质干细胞，促进骨折愈合，本方法操作简单，科学合理，采用剪切法分离骨折断端组织中的迁移细胞，简便易行，对细胞损伤很小，骨折断端组织中的细胞大部分可以被分离出来，操作时间短，可用于研究骨折愈合早期应力环境对骨折断端间充质干细胞募集的影响，以及用于间充质干细胞分化等指标的进一步研究，指导确定骨折早期安全有效的康复方案，通过适宜应力募集更多间充质干细胞的同时，关节功能恢复正常。

说明书

技术领域

本发明涉及一种募集间充质干细胞的方法，具体涉及一种通过建立大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法。

背景技术

 在组织器官损伤修复、组织工程和疾病治疗领域，尽管胚胎干细胞等呼声很热，但是最理想的细胞依然是自体组织细胞。因此如何获得和利用自体组织、自体干细胞一直是研究人员关注的问题。

 现在，干细胞的来源和应用理论大体分为3个重要方向，第一，胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）；第二，间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）；第三，利用基因重编程（reprogramming）改造体细胞培育诱导性多能干细胞（induced pluripotent stemcell,iPS）。目前ES的研究由于受伦理学争议、免疫排斥、实验技术限制等影响，阻碍了其研究和在临床治疗中的应用。间充质干细胞因可以实现自体干细胞移植，而且具有体内迁移与增殖分化并参与修复过程的特性，而在近年成为研究热点。目前，多采用消化法分离骨折断端组织中的间充质干细胞，这种方法需要多种酶的参与，操作时间长，而且酶的使用会降低细胞的活力、减少细胞数目。

在骨科临床中，应用自体间充质干细胞（MSC）移植治疗股骨头坏死和骨不连等疾病取得了一定的疗效。在骨折治疗中，随着生物学内固定理念的创新和新技术的应用，认识到了保护血运、建立稳定性和骨折对位三者平衡对建立骨折愈合优良生物力学与生物学环境的重要性。骨折愈合需适当的生物力学环境和最佳应力水平，大量研究表明，在骨折愈合早期，微动能够促进骨折愈合：①适当的微动可促进骨折区毛细血管形成和PGE2的释放，PGE2具有较强的诱导成骨作用，可加速未分化的间充质干细胞在有氧条件下不断分化为成骨细胞和成软骨细胞，进一步促进骨折愈合；②骨细胞可以感受机械应力的刺激，骨细胞、成骨细胞等代谢活性增加；③前列腺素合成增加，促进骨细胞增殖；④延长骨折修复的炎症期，炎症期细胞及毛细血管均较旺盛，释放许多生化介质、骨生成因子等，使局部组织细胞释放成骨活性物质的能力恢复，从而诱导局部间充质干细胞增殖，分化为成骨细胞或成软骨细胞；⑤微动引起的生物反应参与了启动新骨形成的细胞募集和分化，所以骨折愈合早期为力学因素促进骨折愈合的最有效时期。但是关于微动促进骨折愈合的细胞学机制仍不十分清楚，如果阐明了微动与细胞分子活动之间的关系，将有可能通过控制力学环境来促进骨折愈合，对其深入研究，最终实现骨折病人量化控制康复过程，使康复过程引起的微动始终处于有利骨折愈合的安全范围，才能有效避免盲目康复引起的各种骨折并发症，实现骨折治疗目标。

发明内容

  本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种符合临床特点的，操作简单、科学合理的通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，通过控制固定骨折处的力学环境，可以募集较多数量的间充质干细胞参与骨折愈合的过程。有研究表明，在骨折初期，骨折局部只有少量的成骨细胞和成软骨细胞，如果仅依靠此时成骨细胞的数量，换算股骨干骨折愈合时间需要200-1000年。实际上，被骨折创伤激活的各种细胞在骨折愈合不同阶段会产生各种相应的生物活性物质，极大地加速了骨折愈合过程。首先是间充质干细胞的增殖和分化，这是骨折愈合的前提和关键。因此增加骨折局部间充质干细胞的数量成为促进骨折愈合的重要基础。本发明方法通过控制力学环境募集更多的间充质干细胞，间充质干细胞增殖和分化，使成骨细胞和成软骨细胞数量剧增，有效促进骨折愈合。本发明对指导骨折治疗和量化控制骨折康复过程有重要的临床意义。首先明确了骨折愈合早期是募集间充质干细胞的关键时期，此时也是预防关节粘连的关键时期，因此，肢体康复宜早期进行而且需要有限量的康复。肢体康复活动的应力既能使骨折断端募集间充质干细胞，又能防止肢体肌肉萎缩和关节粘连。肢体康复活动是治疗骨折的重要措施，决定骨折治疗的最终效果。但功能康复引起的微动必须始终处于有利骨折愈合的安全范围，本发明方法能够帮助确定肢体康复的安全范围，从而实现骨折病人量化控制康复过程，实现骨折治疗目标。

本发明技术方案理论依据：骨折愈合需要足够量的间充质干细胞（MSC）的参入，而在骨折初期，骨折局部只有少量的间充质干细胞、成骨细胞和成软骨细胞，间充质干细胞的增殖和分化，这是骨折愈合的前提和关键。因此增加骨折局部间充质干细胞的数量成为促进骨折愈合的重要基础。干细胞具有对组织损伤产生反应，可迁徙、增殖分化并参入修复过程。因此，骨折愈合早期是促进骨折愈合的关键时期，在骨折愈合早期，骨折断端在骨创伤和适度应力刺激的共同作用下，骨髓内的间充质干细胞（MSC）、周围肌肉和血液的成体干细胞，就会通过相应的途径向骨折处迁徙，这样骨折局部可以募集较多数量的干细胞。本发明采用适宜固定应力的外固定架，建立了大鼠股骨干骨折断端微动模型，即大鼠应力骨折模型，采用剪切法分离骨折断端组织中的细胞，简便易行，对细胞损伤很小。

 本发明技术方案为：首先建立外固定支架固定的大鼠应力骨折模型，造模成功后，在不同时点，取出骨折断端组织，分离间充质干细胞并进行培养，用于研究骨折愈合早期应力环境对骨折断端间充质干细胞募集的影响，及对间充质干细胞分化的进一步研究。

所述的外固定支架包括4枚钢针和2块横梁，4枚钢针呈梳齿状均匀排布在两块横梁之间，2块横梁由2枚钛合金微型螺钉固定在一起；外固定支架轴向固定应力为4.5N/mm。

所述的钢针选用意大利Orphfix产品。钢针的股骨接触端直径为0.8mm，另一端直径为1.2mm；所述的横梁，材料为高分子聚乙烯医用材料，其刚度、弹性、韧性均符合生物力学要求，且具有不遮挡x光线的特性和牢固固定钢针的独特优势；所述的钛合金微型螺钉直径为2.6mm；所述的外固定支架长、宽、高分别为20mm、5.5mm、6mm。

1本发明一种通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，步骤为：

1）建立大鼠应力骨折模型

 大鼠称重后，3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，手术侧股骨去毛备皮，消毒铺巾，手术在严格无菌条件下进行，从股骨外侧切口，自外侧肌间隙暴露股骨，首先放置外固定支架，外固定支架自股骨小粗隆至股骨髁上跨越股骨全长，固定完成后，在内侧2个固定钢针之间用厚度1mm的微锯横行切断股骨，冲洗刀口，用可吸收线缝合肌肉组织，用不可吸收线缝合皮肤，手术后3天将大鼠的饮用水中加入12mg/500ml的镇痛药盐酸曲马多，手术前30min及手术后3天皮下注射45mg/kg的克林霉素，防止细菌感染；手术完成后，大鼠自由活动，每天钢钉处常规消毒；

2）细胞的分离及原代培养

按步骤1）方法建立大鼠应力骨折模型，分别于造模后第6、9、12、15、18天时，处死大鼠，取出骨折断端组织和健侧股骨，按照下面方法分离细胞：取出的骨折断端组织用磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗2次，剪切至糊状；用培养基反复轻轻吹打，使之穿过200目筛网，收集迁移细胞(migratingcells，MCS)悬液，收集未滤过的材料，重复用培养基重悬，过滤，收集合并迁移细胞悬液，离心后用培养基重悬细胞；按照以下的方法分离大鼠的骨髓细胞，PBS液冲出骨髓，收集骨髓细胞悬液，调整细胞浓度至10⁶/ml，按体积比1∶1加入Ficoll分离液，1800r/min离心20min，吸取界面单个核细胞，用PBS洗2次，用培养基重悬细胞，将分离的骨髓细胞、迁移细胞浓度调整到1×10⁶/ml，接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，移入37℃、5%CO₂的培养箱中培养；3天后全量更换新培养液，去除未贴壁细胞，细胞密度达80%～90%，即进行传代。

所述的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基。

2观察及评价方法

1）骨折断端组织细胞计数：分别于造模后第6、9、12、15、18天时，处死大鼠，取出骨折断端组织和健侧股骨，用D-Hanks液漂洗,剪切材料加入等量的DMEM培养基，台盼蓝染色，细胞计数。

2）形态学观察：在倒置显微镜(Olympus公司)下每日观察细胞的形态学特征。

3）细胞增殖曲线分析：将骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以2×10⁵cells/ml/孔接种在24孔板内，每隔24h消化3个孔，收集细胞，并用0.4%的台盼蓝计数活细胞，绘制生长曲线。并按下式计算细胞倍增时间:TD=t×［lg2/(lgN_t-lgN₀)］。N_t:收集细胞数；N₀:接种细胞数；t:培养时间。

4）细胞的诱导分化

成骨诱导分化：取骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以10⁵/孔的密度接种于6-fL板中，待细胞融合80%，加入成骨诱导培养基，诱导21d后，行茜素红染色，并在倒置显微镜下观察染色情况。

成软骨诱导分化:取海绵或骨髓来源的第3代细胞，以10⁵/孔的密度接种于6-fL板中，待细胞融80%，加入成软骨诱导培养基，诱导21d后，行阿辛蓝染色，并在倒置显微镜下观察染色情况。

成脂诱导分化:取骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以10⁵/孔的密度接种于6-fL板中，待细胞融合90%，加入成脂诱导培养基，诱导21d后，油红O染色，并在倒置显微镜下观察染色情况。

5）统计学分析：实验数据均以均值±标准差表示。用SPSS17.0软件分析，利用单向方差分析(One-wayANOVA)法进行比较，计量资料采用t检验，计数资料的比较采用χ²检验。以P＜0.05为差异有显著性意义，P＜0.01差异有非常显著性意义。

本发明提供的一种通过大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法，其有益效果是：

1）通过建立大鼠应力骨折模型，控制固定骨折处的力学环境，募集间充质干细胞，促进骨折愈合，本方法操作简单，科学合理。

2）验证了应力微动与细胞分子活动之间的关系，可用于研究骨折愈合早期应力环境对骨折断端间充质干细胞募集的影响，以及用于间充质干细胞分化等指标的进一步研究，指导确定骨折早期安全有效的康复方案，通过适宜应力募集更多间充质干细胞的同时，关节功能恢复正常。

3）采用剪切法分离骨折断端组织中的迁移细胞，简便易行，对细胞损伤很小，骨折断端组织中的细胞大部分可以被分离出来，操作时间短，不需要酶的参与，因此不会降低细胞的活力、减少细胞数目。

附图说明

图1为大鼠应力外固定支架结构

图2为建立的大鼠应力骨折模型

图3为大鼠应力外固定支架结构图

图4为细胞的形态学特征图(100×)

图5为倒置显微镜下迁移细胞来源(a，b，c)细胞的体外分化能力图，图5（a）为向脂肪诱导(油红O染色c，200×），图5（b）为向成骨诱导(茜素红染色a，40×)，图5（c）为向软骨诱导(阿利辛蓝染色b，200×)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明方法进行具体说明。

1材料与方法

1、1材料

动物与分组：实验用健康雄性SD大鼠36只，体重250～300g，由山东省医学科学院提供。随机分为对照组和实验组，每组18只。

实验组：外固定架固定后，股骨干完全横断产生微动；对照组：外固定架固定后，股骨干只横断一半，有骨损伤但无微动。两组大鼠在相同生活环境下自由活动。

主要材料及设备：

大鼠MSC诱导分化培养基和显色液购自广州Cyagengs公司；

DMEM培养基、胎牛血清购自杭州四季青公司；

双抗购自Gibco公司；

结晶紫染色液、台盼蓝和0.25%胰蛋白酶购自碧云天公司；

Ficoll分离液购自Pharmacia公司；

外固定支架钢针选用意大利Orphfix产品，钛合金螺钉购自强生公司。

1、2方法

1、2、1外固定支架 （如图1、3所示）

 外固定支架包括4枚意大利Orphfix钢针和2块高分子聚乙烯医用材料制成的横梁，4枚钢针呈梳齿状均匀排布在两块横梁之间，2块横梁由2枚直径为2.6mm钛合金微型螺钉固定在一起，外固定支架长、宽、高分别为20mm、5.5mm、6mm；钢针的股骨接触端直径为0.8mm，另一端直径为1.2mm。

1、2、2建立大鼠应力骨折模型

     大鼠称重后，3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，手术侧股骨去毛备皮。消毒铺巾，手术在严格无菌条件下进行。从股骨外侧切口，自外侧肌间隙暴露股骨，首先放置外固定支架，外固定支架自股骨小粗隆至股骨髁上跨越股骨全长。固定完成后，实验组在内侧2个固定钢针之间用厚度1mm的微锯横行切断股骨（图2），对照组在内侧2个固定钢针之间用厚度1mm的微锯横行切断1/2股骨。冲洗刀口，用可吸收线缝合肌肉组织，用不可吸收线缝合皮肤。手术后3天将大鼠的饮用水中加入12mg/500ml的镇痛药盐酸曲马多，手术前30min及手术后3天皮下注射45mg/kg的克林霉素，防止细菌感染。手术完成后，即可让大鼠自用活动。每天钢钉处常规消毒。

1、2、3细胞的分离培养

   建立大鼠应力骨折模型，分别于造模后第6、9、12、15、18天时，取出骨折断端组织和大鼠健侧的股骨。按照下面方法分离细胞：取出的骨折断端组织用PBS漂洗2次，剪切至糊状；用含10%胎牛血清的DMEM培养基反复轻轻吹打，使之穿过200目筛网，收集迁移细胞悬液，收集未滤过的材料，重复用培养基重悬，过滤，收集合并迁移细胞悬液，离心后用培养基重悬细胞；用PBS液冲出骨髓，收集骨髓细胞悬液，调整细胞浓度至10⁶/ml，按体积比1∶1加入Ficoll分离液，1800r/min离心20min，吸取界面单个核细胞，用PBS洗2次，用培养基重悬细胞，将分离的骨髓细胞、迁移细胞浓度调整到1×10⁶/ml，接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶中，移入37℃、5%CO₂的培养箱中培养；3天后全量更换新培养液，去除未贴壁细胞，细胞密度达80%～90%，即进行传代。

2观察及评价方法

2、1骨折断端组织细胞计数

    分别于造模后第6、9、12、15、18天时，随机选择3只大鼠处死，取出骨折断端组织和大鼠健侧的股骨，用D-Hanks液漂洗,剪切材料加入等量的DMEM培养基，台盼蓝染色，细胞计数。

2、2形态学观察

    在倒置显微镜(Olympus公司)下每日观察细胞的形态学特征。

2、3细胞增殖曲线分析

    将骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以2×10⁵cells/ml/孔接种在24孔板内，每隔24h消化3个孔，收集细胞，并用0.4%的台盼蓝计数活细胞，绘制生长曲线。并按下式计算细胞倍增时间:TD=t×［lg2/(lgN_t-lgN₀)］。N_t:收集细胞数；N₀:接种细胞数；t:培养时间。

2、4细胞的诱导分化

成骨诱导分化：取骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以10⁵/孔的密度接种于6-fL板中，待细胞融合80%，加入成骨诱导培养基，诱导21d后，行茜素红染色，并在倒置显微镜下观察染色情况。

成软骨诱导分化:取海绵或骨髓来源的第3代细胞，以10⁵/孔的密度接种于6-fL板中，待细胞融80%，加入成软骨诱导培养基，诱导21d后，行阿辛蓝染色，并在倒置显微镜下观察染色情况。

成脂诱导分化:取骨折断端或骨髓来源的第3代细胞，以10⁵/孔的密度接种于6-fL板中，待细胞融合90%，加入成脂诱导培养基，诱导21d后，油红O染色，并在倒置显微镜下观察染色情况。

2、5统计学分析

   实验数据均以均值±标准差表示。用SPSS17.0软件分析，利用单向方差分析(One-wayANOVA)法进行比较，计量资料采用t检验，计数资料的比较采用χ²检验。以P＜0.05为差异有显著性意义，P＜0.01差异有非常显著性意义。

3结果分析

3、1细胞数量

  分别在第6、9、12、15、18天时取出骨折断端组织，细胞计数结果显示，对照组与实验组迁移细胞数量均随时间延长而增加，实验组在第18天时迁移细胞数量达到最大值，而对照组在15天时迁移细胞数量达到最大值(如表1所示)

           表1大鼠股骨干骨折断端应力与无应力不同时间点捕获的细胞数量×10⁶（x±s）

 与对照组比较，*p＜0.05；Δp＜0.01

3、2细胞形态学观察

  迁移细胞接种24h后开始贴壁，部分细胞呈现细长梭形；全量换液去除未贴壁细胞，此时贴壁细胞呈单个分散或成簇生长，细胞形态均匀，多呈长梭形、纺锤形；此后贴壁细胞迅速增殖，细胞体积增大，形态变为长梭形，多边形，细胞集落明显增大、增多。培养至8～10天细胞达80%～90%融合，经过传代，细胞逐渐表现为较均一的长梭形，并呈漩涡状生长，对照组与实验组一致，它们均与骨髓来源贴壁细胞二者形态相似（图4）。

3、3细胞增殖特点

   两组迁移细胞来源的第3代细胞生长曲线基本为S型，与骨髓来源的细胞生长曲线基本相同。经过24h潜伏期后，从第2天进入对数生长期，于第6天细胞进入稳定期。计算对数期内骨折断端和骨髓源MSCs的倍增时间分别为22.6±3.5h（对照组）、22.1±4.6（实验组）和21.3±5.3h（骨髓源）。

3、4细胞分化能力鉴定

两组迁移细胞成脂诱导分化鉴定诱导48h后，细胞内有小脂滴出现；两周后脂滴数量增加并互相融合，细胞由梭形变成圆形或者多边形，油红O染色显示有大量的脂质沉积(图5a)，提示细胞已分化成脂肪细胞。成骨诱导分化鉴定成骨诱导后，细胞体积随时间增加而膨大，由长梭形变成多角形、立方形，呈铺路石状，多处集聚生长，诱导后10天左右形成了明显的结节，结节大小不均一。诱导培养21天后，可见沉积的小片状结节，经茜素红染色结节呈橘红色，边界清晰，提示有矿化基质沉积(图5b)。成软骨诱导分化鉴定细胞经诱导分化后，细胞胞体变圆，胞质减少。在诱导21天阿辛蓝染色可见细胞浆和细胞间质呈亮绿色(图5c)，提示细胞已分化成软骨细胞。

通过上述实验及结果可见，骨折断端组织中细胞数量在15天时达到了最大值。剪切法分离骨折断端组织中的细胞，简便易行，对细胞损伤很小，骨折断端组织中的细胞大部分可以被分离出来。本发明采用差速贴壁法分离的贴壁细胞形态比较均一，纯度较高，虽然差速贴壁法分离的干细胞纯度比较有限，但这种方法分离纯化干细胞快，简单易行。本发明实验结果证实分离的干细胞和骨髓源间充质干细胞有相似的细胞形态，增殖能力，向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞诱导分化能力。此外，本发明在前期研究中进行了干细胞的表型检测，细胞低表达造血干细胞标记物CD34及CD45，高表达CD105和干细胞标记物Sca-1，与骨髓间充质干细胞相似的表面标志物，不表达成肌细胞标记物MyoD。另外，本发明对大鼠应力骨折模型的骨折愈合情况，进行了组织观察，表现骨折愈合速度明显增快，骨折周围成骨能力更强，新生骨细胞多且活跃。

   本发明实验研究表明，骨折断端在应力环境下，能够募集到更多的迁移细胞，上述研究表明，骨折断端募集到的这些迁移细胞与骨髓间充质干细胞相似的表面标志物，并能向成骨细胞和成软骨细胞方向分化，与间充质干细胞特征一致。本发明通过建立大鼠应力骨折模型募集间充质干细胞的方法简单易行，是促进骨折愈合的重要方法。