一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，以ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以ACLSV-Probe作为探针进行实时荧光定量PCR检测。该检测方法选用特定的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，特异性高，重复性好，灵敏度高。实时荧光定量PCR检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行后续处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；实现了待测样本的定量检测；待测样本的实时荧光定量PCR检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比，大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间。

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体而言，涉及一种苹果褪绿叶斑 病毒实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)可侵染苹果、梨、桃、李、杏、 樱桃等多种果树，对果树的生长、产量、果品质量等造成严重的影 响。目前检测ACLSV的方法主要是常规RT-PCR技术。

ACLSV的常规RT-PCR检测技术方案具体为：

(1)设计常规RT-PCR检测引物

(2)提取果树供试样品的RNA并反转录成cDNA

(3)以cDNA为模版，利用特异扩增引物进行常规PCR扩增

(4)将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳

(5)通过凝胶成像系统对电泳结果进行观察拍照，若观察到特 异扩增条带可证明供试样品中含有ACLSV，反正则没有。

ACLSV的常规RT-PCR检测技术存在以下缺点：

(1)操作步骤较为繁琐，费时费力；

(2)需要对PCR扩增产物进行后处理，只有将扩增产物经过 琼脂糖凝胶电泳才能得到检测结果，但琼脂糖凝胶制作过程中需要 加入致癌物质EB，易污染实验室环境，对实验人员的健康构成威胁， 同时后处理过程中不同样品间易发生交叉污染，造成检测结果的假 阳性现象；

(3)常规RT-PCR技术只能对病毒进行定性检测，无法定量检 测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量 PCR检测方法，以解决上述操作步骤较为繁琐、费时费力、不同样 品间易发生交叉污染、无法定量检测的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法，以 ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以ACLSV-Probe 作为探针进行实时荧光定量PCR检测，其中，

ACLSV-Probe-F：CAGAGAAAAGATGACCCAAATCATG；

ACLSV-Probe-R：AACAGCCTGGATGGCAACA；

ACLSV-Probe：TTGAGACCTTCAATGTGCCTGCCATGT。

本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方 法，以ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R作为引物，并以 ACLSV-Probe作为探针进行实时荧光定量PCR检测特异性高，重复 性好，灵敏度高。

优选地，所述实时荧光定量PCR检测之前先制作由Ct值和起 始模板的不同拷贝数构成的标准曲线。

其中的起始模板可以直接为苹果褪绿叶斑病毒的RNA反转录 得到的cDNA，也可以为苹果褪绿叶斑病毒的RNA反转录得到的 cDNA进行扩增，得到的含有ACLSV-Probe-F和ACLSV-Probe-R 扩增产物的片段。将待测样本的苹果褪绿叶斑病毒的cDNA直接以 与标准曲线相同的条件进行实时荧光定量PCR，得到的Ct值与标 准曲线直接比较，即可得到待测样本中起始模板的拷贝数。

具体地，所述实时荧光定量PCR检测采用的模板为苹果褪绿 叶斑病毒的cDNA；

所述cDNA与所述标准曲线以相同的条件进行实时荧光定量 PCR，得到的Ct值直接与所述标准曲线比对即可。

其中，相同的条件是指PCR反应体系和PCR扩增程序相同。 由于实时荧光定量PCR检测结果可由电脑软件直接读出，不需 要进行后续处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的 污染；实现了待测样本的定量检测；待测样本的实时荧光定量 PCR检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比，大大 简化了检测步骤，缩短了检测的时间。

优选地，所述标准曲线的纵横坐标分别为Ct值和起始模板的 不同拷贝数的对数值。Ct值和起始模板的不同拷贝数的对数值具有 很好的线性关系，更便于将待测样本的数值与标准曲线比对以得到 检测结果。

进一步地，所述起始模板由以下方法制备：

(a)、先提取苹果褪绿叶斑病毒的RNA，RNA经反转录获得 cDNA；

(b)、以引物ACLSV-cp-F和ACLSV-cp-R对cDNA进行PCR 扩增，扩增后对目标片段回收，其中，

ACLSV-cp-F：GAAGATCGCAGAAGGGGATATTC

ACLSV-cp-R：GTCTACAGGCTATTTATTATAAG；

(c)、回收的目标片段即得。

用于标准曲线的起始模板是先将含有ACLSV-Probe-F和 ACLSV-Probe-R的片段进行扩增，具体为：根据GenBank中登录的 苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)外壳蛋白基因(cp)的核苷酸序列， 利用Primer Primer 5.0设计出扩增cp基因全序列的引物 ACLSV-cp-F/R，用于阳性质粒标准品序列的克隆；利用clustalX (1.81)对该发明中克隆得到的苹果褪绿叶斑病毒cp基因序列及 GenBank中已发表的苹果褪绿叶斑病毒cp基因序列进行多重比对， 选择相对稳定的保守区域作为检测靶标序列，利用Primer Primer 5.0 和Primer Express v3.0软件设计特异性扩增引物(ACLSV-Probe-F 和ACLSV-Probe-R)和TaqMan探针ACLSV-Probe，该探针5’端 标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。该扩增得到的片段相当于将特 定的片段先进行了预先分离和纯化，这样制作标准曲线更稳定，重 复性好。

以ACLSV-cp-F/ACLSV-cp-R为引物扩增后，由于回收的片段 量比较少，并且由于回收过程中可能会含有一些杂质，进一步地， 所述步骤(c)还包括：将回收的目标片段连接至载体上，进行质粒 扩增，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒即为起始模板。

更进一步地，所述载体为pEASY-T3载体；

所述质粒扩增具体为：

将回收的目标片段连接至载体，转化至E.coli DH5α感受态细 胞，挑取阳性克隆进行增菌培养。

该质粒扩增的方法简单易行，且容易获得大量含有目标片段的 质粒。

为了使质粒进行实时荧光定量PCR得到的标准曲线更稳定，优 选地，作为起始模板的质粒OD260/OD280比值在1.8-2.0之间。

为了得到的标准曲线更稳定，并具有更大的范围，以便于待测 样本的比对，优选地，所述起始模板的不同拷贝数的范围为：1.0× 10¹拷贝-1.0×10⁸拷贝，以10倍进行等分。

优选地，所述实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为： TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，ACLSV-Probe-F 4-5pmol、 ACLSV-Probe-R 4-5pmol，ACLSV-Probe 4-5pmol，模板1pg-1μg， 双蒸水补齐至20μl。

待测样本采用该PCR反应体系进行实时荧光定量PCR，得到 的曲线稳定。此外，PCR反应体系的选择可以根据选用的试剂盒推 荐进行，还可以选用其他体积，如常用的25μl体系、50μl体系、15μl 体系等，其中成分的含量只需要相应地降低或升高即可。

优选地，实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性30-35s； 94℃变性5-7s，55℃退火10-15s，72℃延伸15-20s，共35-40个循 环。以该实时荧光定量PCR扩增程序进行扩增，扩增特异性好，扩 增得到的数据稳定。

此外，标准曲线也采用相同的PCR反应体系和PCR扩增程序 得到数据，其中，PCR反应体系的模板即为起始模板。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检 测方法，检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处 理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；

(2)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检 测方法，通过标准曲线的制作实现对供试材料中ACSLV病毒的 定量检测，而常规PCR技术只能实现ACLSV的定性检测；

(3)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检 测方法，检测过程只需要1小时左右，与常规PCR技术相比， 大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间；

(4)本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检 测方法，与常规PCR技术对比，其灵敏度是常规RT-PCR技术 的100倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以 下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2实时荧光定量PCR特异性分析图；

图2为本发明实施例4常规PCR产物电泳检测图；

图3为本发明实施例4实时荧光定量PCR特异性分析图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件 或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市售获得的常规产品。

下面实施例中，涉及的材料、试剂和设备具体来源为：

1、材料：感染ACLSV的田间苹果叶片于2012年6月采自河 北省清苑县温仁村，田间供试材料2013年8月采自河北省卢龙县狮 子庄村，苹果脱毒组培苗由河北农业大学生物技术实验室提供。

2、主要试剂和设备：

RNAiso Plus，RNAiso-mate for Plant Tissue，EASY Dilution for  Real Time PCR)，购自大连宝生物工程有限公司；TransStart Probe  qPCR Super Mix，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA  Synthesis SuperMix及pEASY-T3Cloning Kit购自北京全式金生物 技术有有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购 自生工生物工程(上海)有限公司。

3、设备：Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪为美国Bio-Rad公 司产品，NanoDrop 2000微量紫外分光度计为美国Thermo Scientific 公司产品。

实施例1

1、引物、探针的设计和合成

根据GenBank中登录的苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)外壳蛋 白基因(cp)的核苷酸序列(登录号：D14996.1)，利用Primer Primer 5.0设计出扩增cp基因全序列的引物ACLSV-cp-F/R(表1)，用于 阳性质粒标准品序列的克隆。

利用clustalX(1.81)对本研究中克隆得到的苹果褪绿叶斑病毒 cp基因序列及GenBank中已发表的苹果褪绿叶斑病毒cp基因(登 录号：D14996.1，JN848991，HQ398252，NC001409，JN849007， GU328004.1)序列进行多重比对，选择相对对稳定的保守区域作为 检测靶标序列，利用Primer Primer 5.0和Primer Express v3.0软件设 计特异性扩增引物和TaqMan探针(表1)，探针5’端标记荧光基 团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1，由大连宝生物工程有限公司 合成。

表1 引物及探针序列

2、总RNA的提取及cDNA的合成

称取0.1g苹果样品叶片，利用试剂盒RNAiso Plus及 RNAiso-mate for Plant Tissue提取总RNA，以Oligo(dT)18为引物利 用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis  SuperMix试剂盒进行反转录获得cDNA。

3、重组质粒标准品的制备

利用引物ACLSV-cp-F/R对田间染病苹果叶片的cDNA进行 ACLSV-cp基因的PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用 DNA凝胶回收试剂盒对符合目标片段大小(1784bp)的特异条带进 行切胶回收，纯化后连接至pEASY-T3载体上，并转化至E.coli DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，用质粒小量提取试剂 盒提取后测序和双酶切(Not I和Nde I)鉴定。经鉴定正确的阳性 重组质粒作为标准品，命名为ACLSV-cp，置于-70℃备用。

4、标准曲线的绘制

用NanoDrop 2000测定提取质粒的OD260和OD280值及其浓 度，OD260/OD280比值在1.8-2.0的质粒则用于制作标准曲线。根 据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度：copies/μl＝ (ng/μl×10^-9)×(6.02×10²³)/(DNA length×660)；用Easy Dilution 将质粒依次稀释成1.0×10⁸拷贝/μl～1.0×10¹拷贝/μl，共制得8个浓 度梯度的模板。以此为模板参照试剂盒说明书建立20μl扩增体系： TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，上、下游引物(10pmol/μl) 各0.4μl，Taqman探针(10pmol/μl)0.4μl，模板1.0μl，双蒸水7.8μl。 在Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪上按下列反应参数进行扩增： 94℃预变性30s；94℃变性5s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共 40个循环。反应结束后，利用分析软件自动生成标准曲线。

结果标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系，相关 系数R²达0.999，扩增效率E为103.7％，标准曲线的回归方程为： Y＝-3.24log(x)+43.37，其中，Y为Ct值，x为起始模板的不同拷 贝数的对数值。

实施例2

特异性试验

以苹果褪绿叶斑病毒cp基因重组质粒(ACLSV-cp)为阳性对 照，以苹果茎痘病毒cp基因重组质粒(ASPV-cp)、苹果茎沟病毒cp 基因重组质粒(ASGV-cp)为阴性对照，设双蒸水为空白对照，其 中，各质粒的浓度为10000拷贝每微升；实时荧光定量PCR反应体 系及程序同实施例1。得到的结果如图1所示。

其中，图1中，1为ACLSV-cp；2为ASPV-cp；3为ASGV-cp；4 为ddH₂O。从图1可以看出，利用建立的实时荧光定量PCR方法对 ACLSV-cp、ASPV-cp、ASGV-cp三种重组质粒进行检测，设空白对 照，结果只有ACLSV-cp反应管中检测到特异扩增信号，其它反应 管均无荧光信号积累，表明该方法具有良好的特异性。

实施例3

重复性试验

以稀释成10⁷拷贝/μl、10⁵拷贝/μl和10³拷贝/μl三个浓度梯度 的ACLSV-cp质粒为模板，每个浓度重复3孔进行组内重复性检测； 进行组间重复性检测时，同一次反应每个浓度重复3孔，重复3次 反应。实时荧光定量PCR反应体系及程序同实施例1。结果如表2 所示。

表2 实时荧光定量PCR的重复性分析

从表2可以看出，各浓度质粒组内、组间的Ct值的变异系数均 小于1％，表明该方法具有良好的重复性。

实施例4

与常规PCR灵敏度的比较试验

以10倍倍比稀释成10⁸拷贝/μl～10¹拷贝/μl的8个浓度的 ACLSV-cp质粒为模板，分别进行ACLSV病毒的实时荧光定量PCR 和常规PCR检测，对比两种方法的灵敏度。常规PCR检测方法参 考陈红霞的方法进行(陈红霞等，2012)。结果如图2和图3所示。 其中，图2中序号1-8对应10⁸拷贝/μl-10¹拷贝/μl，序号9为阴性 对照；图3中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度。

从图2可以看出，当质粒浓度为10³拷贝/μl及以下时，电泳图 上未出现特异性扩增条带，说明常规PCR的检测下限为10⁴/μl拷贝。 用相同浓度梯度的质粒进行实时荧光定量PCR检测，结果如图3所 示，当质粒浓度为10⁸～10²拷贝/μl时，其荧光信号强度高于检测阈 值，表明该实时荧光定量PCR方法的检测下限为10²拷贝/μl，其灵 敏度是常规PCR的100倍。

实施例5

利用建立的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测方法对 15份田间苹果叶片和1份苹果脱毒组培苗叶片进行检测，设空白对 照。具体为：

1、总RNA的提取及cDNA的合成

各称取0.1g苹果样品叶片，利用试剂盒RNAiso Plus及 RNAiso-mate for Plant Tissue提取总RNA，以Oligo(dT)18为引物利 用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis  SuperMix试剂盒进行反转录分别获得不同样品的cDNA。

2、控制cDNA的浓度在1pg-1μg进行实时荧光定量PCR。

PCR反应体系为：TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl， ACLSV-Probe-F 4pmol、ACLSV-Probe-R 4pmol，ACLSV-Probe 4pmol，模板1pg-1μg，双蒸水补齐至20μl；

其中，引物和探针的基因序列为：

ACLSV-Probe-F：CAGAGAAAAGATGACCCAAATCATG；

ACLSV-Probe-R：AACAGCCTGGATGGCAACA；

ACLSV-Probe：TTGAGACCTTCAATGTGCCTGCCATGT；

实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s， 55℃退火15s，72℃延伸15s，共40个循环。

实时荧光定量PCR在Bio-Rad iQTM5荧光定量PCR仪上进 行。其中的软件为Bio-Rad iQ5Optical System Software Version 2.1。 该软件直接读出供试材料中的ACLSV的检测结果。检测结果如表3 所示。

表3 检测结果

样品 检测结果 Ct值 1 + 26.48 2 + 34.31 3 + 31.02 4 + 30.66 5 - 0 6 + 30.29 7 + 33.91

8 + 34.08 9 + 29.88 10 - 0 11 + 35.05 12 + 30.71 13 + 34.49 14 + 28.71 15 + 33.51 苹果脱毒组培苗叶片 - 0 CK - 0

从表3可以看出，15份田间样品ACLSV的检出率为86.7％， Ct值为26.48-35.05，脱毒组培苗和空白对照无特异扩增信号，表明 该方法可用于田间苹果样品中ACLSV的检测。

此外，实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为： TransStart Probe qPCR Super Mix 10μl，ACLSV-Probe-F 5pmol、 ACLSV-Probe-R 5pmol，ACLSV-Probe 5pmol，模板1pg-1μg，双蒸 水补齐至20μl；

实时荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性35s；94℃变性7s， 55℃退火10s，72℃延伸20s，共35个循环；得到的结果同实施例 1-5结果一致。

综上，本发明提供的苹果褪绿叶斑病毒实时荧光定量PCR检测 方法，根据ACLSV外壳蛋白基因保守序列设计了特异性引物和 Taqman探针，建立了ACLSV的基于Taqman探针的实时荧光定量 PCR检测方法，整个检测过程只需要1h左右，检测结果直接由电 脑软件得出，不需要进行PCR后处理，可有效地防止检测过程中的 污染和假阳性。该方法可在20μl反应体系中检测到100拷贝/μl的 ACLSV-cp重组质粒，并对其它病毒重组质粒(ASGV-cp、ASPV-cp) 无特异扩增，且批内和批间重复检测结果的变异系数均小于1％。 因此，同以往检测方法相比，具有简便、快速、准确、灵敏、稳定 等优点，本方法将为进一步研究ACLSV的侵染、增殖、分布及时 序变化等规律提供可靠的技术保障。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到， 在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和 修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的 所有这些变化和修改。