利用石墨烯纳米材料廉价大量获取三维生长肿瘤细胞

摘要

本发明公开了利用石墨烯纳米材料廉价大量获取三维生长肿瘤细胞，此方法至少包括：将含有已经培养好的贴壁肿瘤细胞的培养瓶取出，进行常见的贴壁细胞传代操作，以制成细胞悬液。分别取一定体积的细胞悬液接种于新培养瓶中，而后往瓶中加入含血清的培养液。往新培养瓶中加入适量已经经过真空高压灭菌处理的功能石墨烯材料溶液，在培养箱中培养一段时间后，即可以观察到加入功能石墨烯材料的培养瓶中有大量三维生长的肿瘤细胞。该方法实用性广，原料取自于易于合成的石墨烯材料，且肿瘤细胞培养方法简便，只需比标准传代细胞培养步骤中多一步加入石墨烯纳米材料溶液，即可便捷得到三维生长的肿瘤细胞，为后期的细胞基础研究和药物筛选等提供方便廉价的预处理样品，极大的降低了成本且提高了效率。

说明书

技术领域

本发明涉及医用材料制备领域，具体涉及一种利用石墨烯纳米材料来方便廉价大量获取三维生长的肿瘤细胞的方法。可进行有关细胞方面的基础研究和药物筛选等应用。

背景技术

传统的细胞培养采用的是二维细胞培养技术，它不能完全模拟细胞在体内的生长和动力学情况。三维细胞培养技术可以观察肿瘤形成的模型和治疗肿瘤药物的作用，还可观察肿瘤的生物学行为比如转移等，也可以观察细胞之间的相互作用等，更能模拟体内的肿瘤组织因各种情况造成的细胞与基质相互作用的微环境。所以三维细胞培养是一种较完美模拟体内细胞情况的培养方式。目前已经有一些相关专利，如专利申请号CN103756904A描述了一种肿瘤细胞培养的三维培养系统，申请公布号CN102952279A描述了用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及应用，授权公告号CN102433258B公开了一种牵张-电联合刺激三维细胞培养装置。

目前已知的各种三维培养技术中，有依靠外界磁场或者电场作用，促使细胞离开培养皿底部而进行三维生长；另外有一些是通过倒置培养技术，使得液滴滴在培养皿上表面，将培养皿翻转培养；还有通过建立三维支架的方法，使得细胞在小通道内进行生长。总体来说，这些方法虽然较好的模拟了细胞三维生长模式，但对于这些方法涉及的实验技能还有支架等部件的设计和制作上，对于普通的实验操作员来说，操作复杂、需要长期培训、反复练习，才能达到实验要求。

本发明的优点在于普通具有生物细胞实验技能的实验员，均能顺利完成实验，而且能观察到清晰的三维细胞生长现象。操作简单，成本低廉，实验方便快捷。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用石墨烯纳米材料廉价大量获取三维生长的肿瘤细胞的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

1)将含有已经培养好的贴壁肿瘤细胞的培养瓶取出，进行常见的贴壁细胞传代操作，以制成细胞悬液。

2)分别取一定体积的细胞悬液接种于两个新培养瓶中，而后往瓶中加入含血清的培养液。

3)往步骤2）中的一个新培养瓶中加入适量已经经过真空高压灭菌处理的石墨烯纳米材料溶液。另外一个新培养瓶不加入。

4)将步骤3）的两个新培养瓶在37℃的5% CO₂培养箱中培养一段时间，即可以观察到加入石墨烯纳米材料溶液的培养瓶中有大量三维生长的肿瘤细胞；对于没有加入石墨烯纳米材料溶液的培养瓶，会发现贴壁生长的肿瘤细胞。

进一步的，步骤2）和3）可以交换不影响最后结果。即可以往新培养瓶中加入石墨烯纳米材料溶液再加入细胞悬液，而后进行培养。

进一步的，如步骤1)所述的贴壁肿瘤细胞，在培养瓶中培养一般表现为贴壁生长且接触抑制。

进一步的，如步骤1)所述的常见的贴壁细胞传代培养操作，具有以下步骤：吸掉或倒掉就培养液；往培养瓶中加入胰蛋白酶消化液进行消化；发现细胞单层收缩出现空隙时吸掉消化液；加入含血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。

进一步的，如步骤2）所述的一定体积的细胞悬液，一般指将步骤1）中的细胞悬液以1:2或者1:3进行分装。

进一步的，如步骤3）所述的石墨烯纳米材料，其直径范围为2到100纳米，同时材料表面的和边缘含有氧、氮、硫等多种元素组成的功能团，比如羟基、羧基、羰基、氨基、烷基等。

进一步的，如上所述的石墨成分的材料包括石墨、石墨纤维、介孔石墨、碳黑、单层或多层石墨烯、碳纳米管、富勒烯，也包括生物材料（比如树枝、树叶、竹子等）、石油、天然气等其他可燃的含碳材料通过高温碳化或者不充分燃烧收集黑烟等方式得到的材料。

进一步的，如上所述的含氧的石墨烯纳米材料，其合成方法的特征在于：将含有石墨成分的碳材料加入到浓硫酸、硝酸钠和高锰酸钾的溶液中，得到混合的黑色悬浊液，对其进行超声2个小时后，加热180度并搅拌回流反应超过24个小时，将溶液冷却到室温后加入大量去离子水，用碳酸钠调节pH到8，将溶液放入截留分子量为2000Da的透析袋中，进行透析超过3天，而后对透析袋外面的溶液进行加热蒸发干燥后得到干燥固体，即得到含氧的石墨烯纳米材料。根据需要再将固体加水溶解得到一定浓度的石墨烯纳米材料溶液。

进一步的，如上所述的含氮的石墨烯纳米材料，其合成方法的特征在于：将含有石墨成分的碳材料和柠檬酸加入到含氮的有机溶剂，比如二甲基甲酰胺（DMF），将黑色悬浊液放入到聚四氟乙烯高压反应釜中，加热到200度并反应超过5个小时，冷却到室温后，得到的液体通过0.22微米的过滤膜过滤，将滤液放入截留分子量为2000Da的透析袋中透析超过3天，去除多余的DMF溶剂，将溶液进行加热蒸发干燥后得到干燥固体，即得到含氮的石墨烯纳米材料。根据需要再将固体加水溶解得到一定浓度的石墨烯纳米材料溶液。

进一步的，如上所述的含硫的石墨烯纳米材料，其合成方法的特征在于：将含有石墨成分的碳材料、柠檬酸和含硫的有机物（比如二氯亚砜、硫代尿素等）加入到水中且超声2个小时，得到的黑色悬浊液加入到聚四氟乙烯高压反应釜中，加热到200度并反应超过5个小时，而后冷却到室温，将得到的液体通过0.22微米的过滤膜过滤，而后往滤液中加入乙醇，而后高速离心，将得到的沉淀水洗后加热干燥后得到的干燥固体，即为含硫的石墨烯纳米材料。根据需要再将固体加水溶解得到一定浓度的石墨烯纳米材料溶液。

进一步的，如上所述的含氧、氮、硫等多种元素的石墨烯纳米材料，其合成方法的特征也可以为：将权利5、6和7的所述步骤进行任意排列组合而形成的合成步骤。比如合成了如权利5所述的石墨烯纳米材料之后再进行权利6所述的合成步骤。

进一步的，本专利实施例中涉及的肿瘤细胞均可以在中国科学院上海生科院细胞资源中心购买。

如上所述，本发明的利用石墨烯纳米材料廉价大量获取三维生长肿瘤细胞的方法，具有以下有益成果：该方法实用性广，易于合成的石墨烯纳米材料，且肿瘤细胞培养方法简便，只需比标准传代细胞培养步骤中多一步加入石墨烯纳米材料溶液，即可便捷得到三维生长的肿瘤细胞，为后期的细胞基础研究和药物筛选等提供前提。本发明中所用的所有肿瘤细胞均可以商业购买得到且未经过任何前期处理。

附图说明

图1(a)和（b）分别为实例1、2中得到的石墨烯纳米材料的透射电子显微镜图(TEM)。

图2为实例2中的到的含氮的石墨烯纳米材料的光电子能谱图(XPS)。可以看到氮元素。

图3（a）和（b）分别为实例3中得到的石墨烯纳米材料的透射电子显微镜图(TEM)和光电子能谱图(XPS)。可以看到有硫元素。

图4（a）和（b）分别为实例1中未加入石墨烯纳米材料和加入石墨烯纳米材料的HeLa肿瘤细胞生长图。明显观察到（a）图是贴壁生长的肿瘤细胞，（b）图是三维生长的肿瘤细胞。

图5（a）和（b）分别为实例2中未加入石墨烯纳米材料和加入石墨烯纳米材料的A375肿瘤细胞生长图。明显观察到（a）图是贴壁生长的肿瘤细胞，（b）图是三维生长的肿瘤细胞。

图6为（a）和（b）分别为实例3中未加入石墨烯纳米材料和加入石墨烯纳米材料的A375肿瘤细胞生长图。明显观察到（a）图是贴壁生长的肿瘤细胞，（b）图是三维生长的肿瘤细胞。

图7为实例2得到的不同浓度下贴壁细胞和三维生长细胞的比例图。

具体实施方式

根据本发明所述技术方案选取具体实例进行说明如下：

实施例1：

将1g石墨纳米颗粒（graphite nanoparticles）加入到100ml 98%的浓硫酸、0.5g硝酸钠和0.2g高锰酸钾的溶液中，得到混合的黑色悬浊液，对其进行超声2个小时后，加热180度并搅拌回流反应超过24个小时，将溶液冷却到室温后加入800mL去离子水，用碳酸钠调节pH到8，将溶液放入截留分子量为2000Da的透析袋中，进行透析超过3天，而后对透析袋外面的溶液进行加热蒸发干燥后得到干燥固体，即得到含氧的石墨烯纳米材料。

将在37℃的5% CO₂培养箱中培养好的贴壁HeLa肿瘤细胞取出，尽量吸掉或者倒掉培养瓶内的旧培养液，向瓶内加入胰蛋白酶进行消化。当发现胞质回缩、细胞间隙变大则立即中止消化。

吸出消化液，往瓶内加入少量培养液，冲洗掉残留消化液，再加入少量含血清的培养液。反复吹打瓶壁HeLa细胞，使之脱离成细胞悬液。

往6孔板中加入约500μL的培养基和约1×10⁵ 个HeLa细胞，再加入已经经过真空高压灭菌处理的石墨烯纳米材料溶液，其浓度为100 μg/mL。

将培养瓶放入37℃的5% CO₂培养箱进行培养24个小时，即可以观察到成球状的HeLa肿瘤细胞，即三维生长的HeLa肿瘤细胞。

实施例1的透射电镜图像如图1（a）（左图）所示。可以看到石墨烯纳米材料约为10纳米。实施例1的未加入和加入石墨烯纳米材料溶液的细胞生长图如图4（a）和（b）所示，分别可以观察到明显的贴壁的HeLa细胞和成球状的三维生长肿瘤细胞情况。

 实施例2：

将1g碳黑和0.3g柠檬酸加入到10mL的二甲基甲酰胺（DMF），将黑色悬浊液放入到25mL聚四氟乙烯高压反应釜中，加热到200度并反应超过5个小时，冷却到室温后，得到的液体通过0.22微米的过滤膜过滤，将滤液放入截留分子量为2000Da的透析袋中透析超过3天，去除多余的DMF溶剂，将溶液进行加热蒸发干燥后得到干燥固体，即得到含氮的石墨烯纳米材料。

将在37℃的5% CO₂培养箱中培养好的贴壁A375肿瘤细胞取出，尽量吸掉或者倒掉培养瓶内的旧培养液，向瓶内加入胰蛋白酶进行消化。当发现胞质回缩、细胞间隙变大则立即中止消化。

吸出消化液，往瓶内加入少量培养液，冲洗掉残留消化液，再加入少量含血清的培养液。反复吹打瓶壁A375细胞，使之脱离成细胞悬液。

往6孔板中加入约500μL的培养基和约1×10⁵个A375细胞，再加入已经经过真空高压灭菌处理的石墨烯纳米材料溶液，其浓度为100 μg/mL。

将培养瓶放入37℃的5% CO₂培养箱进行培养24个小时，即可以观察到成球状的A375肿瘤细胞，即三维生长的A375肿瘤细胞。

另外，往6孔板中加入200μL的培养基和约1×10⁵ 个A375细胞，再加入已经经过真空高压灭菌处理的石墨烯纳米材料溶液，其浓度分别为0、25、50、75、100、150、175、200μg/mL, 分别培养24小时之后，通过观察视野内贴壁生长和三维生长肿瘤细胞的个数，得到不同生长情况下的细胞比例。

实施例2的透射电镜图像如图1（b）（右图）所示。可以看到石墨烯纳米材料约为10纳米。实施例2的光电子能谱图如图2所示。可以看到氮元素。实施例2的未加入和加入石墨烯纳米材料溶液的细胞生长图如图5（a）和（b）所示，分别可以观察到明显的贴壁的A375细胞和成球状的三维生长肿瘤细胞情况。实施例2的不同生长情况下的细胞比例如图7所示。

 实施例3：

将0.25g碳黑、0.25g柠檬酸和0.25g硫代尿素加入到20ml水中且超声2个小时，得到的黑色悬浊液加入到50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，加热到200度并反应超过5个小时，而后冷却到室温，将得到的液体通过0.22微米的过滤膜过滤，而后往滤液中加入乙醇，而后高速离心，将得到的沉淀水洗后加热干燥后得到的干燥固体，即为含硫的石墨烯纳米材料。

将在37℃的5% CO₂培养箱中培养好的贴壁A375肿瘤细胞取出，尽量吸掉或者倒掉培养瓶内的旧培养液，向瓶内加入胰蛋白酶进行消化。当发现胞质回缩、细胞间隙变大则立即中止消化。

吸出消化液，往瓶内加入少量培养液，冲洗掉残留消化液，再加入少量含血清的培养液。反复吹打瓶壁A375细胞，使之脱离成细胞悬液。

往6孔板中加入约500μL的培养基和约1×10⁵个A375细胞，再加入已经经过真空高压灭菌处理的石墨烯纳米材料溶液，其浓度为100 μg/mL。

将培养瓶放入37℃的5% CO₂培养箱进行培养24个小时，即可以观察到成球状的A375肿瘤细胞，即三维生长的A375肿瘤细胞。

实施例3的透射电镜图像如图3（a）（左图）所示。可以看到石墨烯纳米材料约为20纳米。实施例3的光电子能谱图如图3（b）（右图）所示。可以看到硫元素。实施例3的未加入和加入石墨烯纳米材料溶液的细胞生长图如图6（a）和（b）所示，分别可以观察到明显的贴壁的A375细胞和成球状的三维生长肿瘤细胞情况。

 需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术人员依据本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。