K-ras基因12和13密码子突变检测的方法

摘要

本发明涉及一种用于K-ras基因12和13密码子突变检测的方法，该方法可以检测患者体内分离出的DNA样本中K-ras基因是否存在K-ras基因12和13密码子突变。属于生命科学和技术领域。本发明的方法包括一个以聚合酶链式反应，反应体系中包含特异性的上游引物和下游引物以及按特定方法处理的一组探针，在特定条件下进行的核苷酸单链的杂交及解链过程，并利用荧光定量PCR仪收集解链时的荧光信号来判断变异的存在与否。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于诊断K-ras基因12和13密码子突变检测的方法，该方法可以检测患者体内分离出的DNA样本中K-ras基因是否存在某个特定的核苷酸变异。属于生命科学和技术领域。 

背景技术：

k-ras是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码K-ras蛋白。与肿瘤的生成，增值，迁移，扩散以及血管生成均有关系。Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。K-ras基因因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，K-ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。K-ras基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致，K-ras基因状态不会因治疗而发生变化。这些突变破坏了K-ras蛋白内在的GTPase活性，从而使得K-ras蛋白处于持续活性状，信号传递持续开放，从而自发的刺激细胞不断生长和分化，最终导致细胞癌变。K-ras基因突变检测，具有重大的临床意义：(1)正常人血检中出现K-ras基因异常，提示属于肿瘤高危人群；(2)良性肿瘤患者若是检出Kras基因突变，提示有恶变的可能；(3)大量多中心多期临床试验表明，靶向新药爱必妥(Erbitux，西妥昔单抗)和帕尼单抗(Panitumumab)仅适用于无突变的K-ras基因野生型患者，对K-ras突变患者无效。 

K-ras基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40％，胰腺癌为90％以上，肺癌约为15％。K-ras基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子(≥90％)。常见突变位点为K-ras基因2号外显子的12号密码子和13号密码子上，3号外显子的61号密码子，其中有7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V／D这7种突变占到了90％以上。 

用于K-ras基因突变检测的方法很多，包括如DNA直接测序、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、变性高效液相色谱法(HDPLC)、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、限制小片段长度多态性分析法(RFLP)等。其中DNA直接测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点：检测的敏感性不够高：如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用 直接测序法检测不到突变样本的存在；费时，操作过程复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；测序结果的判读主观性强；一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。因此直接测序法难以在临床普遍开展。本试剂盒采用引物增敏的扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)结合荧光PCR技术，针对K-ras基因突变区特异性扩增相应突变模板DNA。检测敏感性高，与突变检测“金标准”直接测序的结果符合率≥95％。此外本方法还具有快速，操作简单，闭管反应污染少等优点，适于在临床中普遍开展。 

基于上述内容，本方法用于用于人类癌症(主要包括结胰腺癌、直肠癌和肺癌等)组织K-ras基因12和13密码子突变的检测，检测结果可用于肿瘤的个体化分子诊断，进而指导肿瘤患者的临床个体化治疗方案。 

发明内容：

已知K-ras基因基因突变主要突变形式为位于K-ras基因12和13密码子突变。临床上需要一种能针对该突变进行检测，尤其是能快速、准确和简便的方法。本方法结合了PCR的高灵敏度和荧光探针的高精确性等优点，具有操作简单，结果直观和无污染的特点。 

本方法涉及一种使用特异性探针的检测方法，本方法在同一个PCR反应中进行Kras基因突变的检测，利用荧光定量PCR仪和荧光探针的简便性和高灵敏度读取结果，判读所检测的样本中是否存在K-ras基因12和13密码子突变。 

为达到上述目的，采取的技术方案： 

1.使用商业化的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化。 

2.根据本方法的特点设计引物和探针，其中探针的处理方法如表1所示。 

表1 

引物名称>序列>F primer>ATTATAAGGCCTGCTGAAAAT>Rprimer>TCTGAATTAGCTGTATCGTC>General probe>AATATAAACTTGTGGTAGT-BHQ>12-w probe>FAM-TGGAGCTGGTdIdICGTAGGCAA-PO4>13-w probe>TET-TGGAGCTdIdITGGCGTAGGCAA-PO4>

3.使用的PCR反应程序如表2： 

表2 

4.根据PCR仪显示的结果，对样本中是否存在K-ras基因12和13密码子突变进行判断。 

附图说明：

附图为PCR仪输出的溶解曲线图 

具体实施方式：

实施案例： 

检测疑似具有K-ras基因12和13密码子突变的肿瘤组织样本。 

1.设计合成如表1的引物探针。 

表1 

引物名称>序列>F primer>ATGAAGACCTCACAGTA>R primer>ATCCAGACAACTGTTCAAACTGA>General probe>TTTTGGTCTAGCTACAGTGAA-BHQ>T probe>FAM-ATCTCGATGGAGTGGG-PO4>A probe>TET-ATCTCGAAGGAGTGGG-PO4>

2.DNA提取：使用商业化的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化。 

3.扩增 

3.1PCR扩增体系 

按照以下方法配置PCR反应液。 

组份>体积>2×PCR Buffer>10ul>F primer>1ul>Rprimer>1ul>General probe>1ul>T probe>0.5ul>A probe>0.5ul>Taq酶>1ul>H₂O>5ul>DNA模板>5ul>共计>25ul>

3.2PCR扩增程序 

按照以下方法进行PCR扩增 

4.结果分析 

参照附图，根据溶解峰的位置，判断样本中是否存在Kras基因12和13密码子突变。例如，如果样本只在FAM通道出现单一峰信号，则表明样本中无Kras基因12密码子突变。如果样本在FAM通道出现双峰或多峰信号，则表明样本中存在Kras基因12密码子突变。