灰毛豆内生真菌TPL25及其在防治植物病害中的应用

摘要

本发明公开了一株灰毛豆（Tephrosia purpurea）内生真菌灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014607，以及其发酵产物在抗植物病原真菌中的应用。本发明菌发酵液以及发酵液提取物和菌丝体提取物对油菜菌核病，烟草黒胫病等植物病原菌等具有较强的菌丝生长抑制作用，为微生物源农药的开发提供了优良的菌株，另外本发明所述均是在灰毛豆内生真菌方面的首次研究。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25及其在防治植物病害中的应用。

背景技术

灰毛豆（Tephrosia purpurea）是豆科（Leguminosae）灰毛豆属（Tephrosia Pers.）的多年生木本植物，主要分布于热带、亚热带地区，如印度、巴基斯坦、越南、柬埔寨、老挝、缅甸以及中国的广东、广西、云南、福建及湖南等地。灰毛豆枝叶可作绿肥，捣烂投水中可毒鱼，也是良好的固砂及堤岸保土植物。现阶段对灰毛豆的研究主要集中在植物化学和药理学方面，在内生真菌方面还鲜有报道。

植物病害一直是制约农作物优质高产的重要因素之一，而在植物病害中，70%- 80% 的病害是由病原真菌侵染所引发的。植物真菌病害不仅直接造成农作物产量下降与品质降低， 而且部分病原真菌在侵染农作物过程中, 可分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢物，对农产品的安全性构成极大威胁。

化学防治是控制农作物病害的有效方法，但化学农药污染环境，诱导病菌产生抗药性，破坏生态平衡，引起残毒等问题也随之而来，因此，植物病害的生物防治研究越来越受到重视。而内生真菌作为生物防治的手段之一，有着发酵成本低廉，技术手段简单，不易让病原菌产生抗药性等特点，潜力非常巨大。由于研究内生真菌中抗菌活性物质具有十分重要的理论意义和应用前景，另外内生真菌普遍存在抗菌活性，所以近年来在这方面的进展十分迅速。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一株分离自灰毛豆叶片的内生真菌灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25，该菌株的发酵液以及发酵液提取物和菌丝体提取物都对油菜菌核菌等病原菌具有较高的生防活性，因此可以将TPL25作为生防菌应用于相应的病原真菌引起的植物病害中，亦可继续利用该内生真菌资源获得天然活性物质，为生物源农药的开发提供依据。

本发明提供的技术方案是：一株灰毛豆（Tephrosia purpurea）内生真菌灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25，其于2014年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国，武汉，武汉大学），保藏编号CCTCC NO：M 2014607，经检测存活。

本发明所述灰毛豆（Tephrosia purpurea）内生真菌系从中国湖南省湖南农业大学校园内的灰毛豆植物活体中，经分离、培养、发酵和活性测试等步骤获得并保存的。

灰黄青霉TPL25的固体培养特征为：在PDA培养基上，28℃恒温培养，菌落初为淡绿色，边缘为白色，后期变为墨绿色，质地绒状兼颗粒状，分生孢子大量产生，反面淡橘黄色，可溶性色素类似反面较淡的颜色。显微镜形态特征：分生孢子串生，无色，球形。

灰黄青霉TPL25的分子生物学特征：采用PCR技术，DNA序列测定分析，TPL25菌株ITSrDNA基因组由542个碱基组成。于美国国家生物技术信息中心（NCBI）进行同源性比对分析并构建系统发育树，显示菌株与Penicillium griseofulvum GU565099.1聚在一枝上，序列相似性为99%，可确定该菌株为灰黄青霉。

本发明灰毛豆内生真菌抗植物病原真菌发酵液的具体制备操作步骤如下：

（1）    菌种的活化。用接种针将已保存于斜面的内生真菌TPL25转接于已灭菌PDA

平板上，28℃恒温培养4-5天，得到活化菌种。

（2）    发酵培养。在已纯化的内生真菌TPL25 PDA平板边缘，用无菌的打孔器打成直

径6mm的菌饼，接种2块菌饼于装有100mLPDB的250mL锥形瓶中，在28℃±1℃，200r·min^-1摇床上震荡培养6-7天，即得到灰毛豆内生真菌TPL25的发酵液。用滤纸过滤除去菌丝体，菌液再过0.22um针头式过滤器，即得到灰毛豆内生真菌TPL25抗病原真菌的发酵液。

发酵所需培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）。称取新鲜马铃薯200克,去皮切成小片，加超纯水煮沸30分钟，四层纱布过滤，滤液加入葡萄糖20克混匀，加水定容至1升，pH自然。121℃，35分钟灭菌备用。活化菌种所需固体培养基：上述培养基中加入20克琼脂，即PDA培养基。

本发明所述菌株TPL25的抗菌实验：

所述植物致病真菌包括：油菜菌核菌，水稻纹枯菌，草莓灰霉菌，黄瓜疫霉菌，烟草黒胫菌，柑橘炭疽菌。上述植物病原真菌均采用PDA培养基培养。

采用平板对峙方法进行初筛，将内生真菌菌株TPL25和病原真菌分别用 6mm 的打孔器制成菌饼，分别置于PDA 平板的 1/3 处，28℃下培养，观察内生菌株和供试病原真菌是否有拮抗作用。

菌株TPL25发酵液对病原菌菌丝生长抑制测定。量取一定量的无菌发酵液(对照用空白发酵液)与融化状态下的PDA培养基(40-50℃，无菌发酵液与培养基的体积比为1︰9)混均，倒平板(每皿约10mL)，待凝固后接植物病原真菌(菌饼直径6mm)，处理、对照各重复3次。置于28±1℃培养箱内培养3-5天后，用十字交叉法测量病原菌真菌菌落直径，按照下式计算抑制率。

菌丝生长抑制率(℅)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－6)×100

测定结果表明：灰黄青霉TPL25的发酵液对油菜菌核菌、烟草黑胫菌和黄瓜疫霉菌有很好的抑菌活性，抑菌率分别为85.29%、83.82%和82.35%，都在80%以上。该代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。

菌株TPL25发酵液提取物和菌丝体提取物对病原真菌的活性测定。用8层纱布将菌丝体和发酵液分离，发酵液分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取 3 次，浓缩得到各萃取层浸膏，菌丝以 100 mL 甲醇提取 3 次，减压浓缩为菌丝体提取物。再以滤纸片法测定TPL25各提取物的活性。结果表明：菌株TPL25的活性代谢产物主要集中在发酵液乙酸乙酯萃取层，尤其是对黄瓜疫霉菌、油菜菌核菌和烟草黒胫菌有明显的抑制作用。

同时，本发明还提供所述灰毛豆内生真菌灰黄青霉TPL25在防治植物病原真菌所致植物病害中的应用，其利用所述真菌的发酵液、发酵液提取物或菌丝体提取物进行应用。

所述的植物病害是油菜菌核病、烟草黒胫病、黄瓜疫霉病。

本发明还提供一种农用杀菌剂，其包含所述的发酵液，或其发酵液提取物，或其菌丝体提取物。

所述杀菌剂，所述发酵液提取物是分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取2-4 次，浓缩得到各萃取层浸膏即成；所述菌丝体提取物是以甲醇提取2-4次，减压浓缩即为菌丝体提取物。

本发明的优点：首次从灰毛豆中分离内生真菌，并得到活性菌株灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25，该菌株的发酵液以及发酵液提取物和菌丝提取物都对油菜菌核菌、烟草黒胫菌、黄瓜疫霉菌等病原菌具有较高的生防活性，抑菌率分别为85.29%、83.82%和82.35%，都在80%以上。因此可以将TPL25作为生防菌应用于相应的病原真菌引起的植物疾病中，亦可继续利用该内生真菌资源获得天然活性物质，为生物源农药的开发提供依据。

说明书附图

图1为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25的菌落形态。

图2为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25的分生孢子梗和分生孢子（40X）。

图3为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25基于ITS序列构建的系统发育树图。

图4为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25与部分病原真菌对峙效果图。A为油菜菌核菌。

图5为灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25的发酵提取物对不同病原真菌的抑制效果图，其CK为溶剂空白对照，A为TPL25发酵液乙酸乙酯萃取物，供试病原菌从左至右依次是油菜菌核菌和烟草黑胫菌。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25的分离纯化

本发明灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25来自于中国湖南省湖南农业大学校园内的灰毛豆叶片。分离方法：组织表面消毒：用无菌水将灰毛豆叶片冲洗干净，剪成 0.5cm×0.5cm的小块。将以上材料在超净台内进行表面消毒，程序为：体积分数 75%酒精漂洗 3-5min→1g·L^-1升汞漂洗30s-1min→无菌水冲洗 5 次。分离纯化：将消毒后的组织材料接种于已倒好的 PDA 平板培养基上，每皿 3-4 块，放置于 28±1℃避光培养3-7天。待材料外沿切口处长出菌丝(菌落)，采用尖端菌丝挑取法，将菌丝转移至纯化PDA培养基平板上，直到获得单一菌株。

实施例2：灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25菌种的鉴定

结合形态学和分子生物学的方法对菌种进行了鉴定。灰黄青霉TPL25在PDA培养基上可生长，28±1℃恒温培养，菌落初为淡绿色，边缘为白色，后期变为墨绿色，质地绒状兼颗粒状，分生孢子大量产生，反面淡橘黄色，可溶性色素类似反面较淡的颜色（如图1）。显微镜形态特征：分生孢子串生，无色，球形（如图2）。利用ITS序列通用引物ITS4和ITS5（ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）对菌株TPL25进行PCR扩增。以TPL25总DNA为模板，PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。扩增基因序列送生物公司测序，即获得菌株TPL25的ITS序列，（TPL25的ITS rDNA基因组由542个碱基组成，序列如SEQ ID No.1所示）。将序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI）进行同源性比对分析并构建系统发育树，显示菌株与Penicillium griseofulvum GU565099.1聚在一枝上（请参见图3），序列相似性为99%，可确定该菌株为灰黄青霉。

实施例3：灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25抗病原真菌活性初筛。

在无菌条件下，采用平板对峙方法初筛（如图4），将内生真菌菌株TPL25和病原真菌分别用 6mm 的打孔器制成菌饼，分别放于PDA 平板的 1/3 处，28℃下培养，观察内生菌株和供试病原真菌是否有拮抗作用，并测量抑菌带的宽度，对比各内生真菌菌株的活性大小。

实施例4：灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25具有抗病原真菌活性发酵液的制备方法及其抗菌活性复筛。

灰黄青霉TPL25具有抗病原真菌活性发酵液的制备：

（1）    菌种的活化。用接种针将已保存于斜面的内生真菌TPL25转接于已灭菌PDA

平板上，28℃恒温培养4-5天，得到活化菌种。

（2）    发酵培养。在已纯化的内生真菌TPL25 PDA平板边缘，用无菌的打孔器打成直

径6mm的菌饼，接种2块菌饼于装有100mLPDB的250mL锥形瓶中，在28℃±1℃，200r·min^-1摇床上震荡培养6-7天，即得到灰毛豆内生真菌TPL25的发酵液。用滤纸过滤除去菌丝体，菌液再过0.22um针头式过滤器，即得到灰毛豆内生真菌TPL25抗病原真菌的发酵液。

采用含毒介质法复筛：

含毒培养基的制备：在无菌条件下，PDA 培养基冷却至40-50℃，将无菌发酵液和 PDA 培养基以 1:9 混合，得到相应的含毒培养基，充分振荡混匀后倒人直径7.5cm 的培养皿中，凝固后，将活化好的病原真菌用打孔器打成6mm 的菌饼，分别放在含毒培养基和对照培养基上面。设置 3 个重复，对照添加等量空白发酵液。观察菌落的生长情况，并测量菌落直径，抑菌效果用抑菌率表示。

菌丝生长抑制率(℅)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－6)×100

表1：灰毛豆内生真菌TPL25的发酵液对六种植物病原真菌的抗菌结果

植物病原真菌抑菌率（%）油菜菌核病菌85.29水稻纹枯病菌40.74柑橘炭疽病菌14.71黄瓜疫霉病菌82.35烟草黒胫病菌83.82草莓灰霉病菌35.33

测定结果表明：灰黄青霉TPL25的发酵液对油菜菌核菌、烟草黑胫菌和黄瓜疫霉菌都有很好的抑菌活性，抑菌率分别为85.29%、83.82%和82.35%，都在80%以上。因此，该代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。

实施例5：灰黄青霉（Penicillium griseofulvum）TPL25发酵液提取物和菌丝体提取物对病原真菌的活性测定。

用8层纱布将菌株TPL25的菌丝体和发酵液分离，发酵液分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取 3 次，浓缩得到各萃取层浸膏，菌丝以 100 mL 甲醇提取 3 次，减压浓缩为菌丝体提取物。除石油醚层配置成40 mg/ml氯仿溶液外，上述所得代谢物粗品分别配成 40 mg/ml 的甲醇溶液。然后取滤纸片（Φ=6mm，已灭菌）浸没于各粗品溶液中，使其充分饱和，略微风干后，备用。将打好的6mm的病原真菌菌饼放在PDA平板中央，再将制备好的无菌滤纸片贴放在距离病原菌菌饼约3cm处,每个平板放四片，一片为溶剂空白对照（分别为纯氯仿溶液和甲醇溶液），其他3片为各提取物滤纸浸片（各内生真菌的代谢物粗品对测试菌分别作 3 个重复）。测定内生真菌初提物滤纸片对病原真菌的拮抗带宽度，以拮抗带宽度平均值作为内生真菌拮抗活性强弱的指标。

结果表明：菌株TPL25的活性代谢产物主要集中在发酵液乙酸乙酯萃取层，尤其是对油菜菌核菌和烟草黒胫菌有明显的抑制作用（如图5）。

<110>湖南农业大学

<120>灰毛豆内生真菌TPL25及其在防治植物病害中的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 542

<212> DNA

<400> 1

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