当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法

摘要

本发明公开了一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法，其制备方法为：将灭菌后贮藏根切片，置于筛选培养基上处理后促使根切片中非形成层细胞的部分死亡或损伤或停止生长；再将切片放入分离培养基中培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，初步分离得形成层细胞；将其移至继代培养基中培养后，再移至分离培养基中重复交替地培养，直到获得一种稳定的含有大量小液泡的细胞。本发明提供的形成层干细胞培养方法有悬浮培养和发酵罐培养的方法。本发明实现了对当归属形成层干细胞的分离，并对其扩大培养提供了新的方法，对当归属植物贮藏根形成层干细胞大量的工业生产奠定了基础，也为当归属植物贮藏根形成层干细胞提供了新的细胞来源。

说明书

技术领域

本发明涉及当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法。

背景技术

目前植物生物技术都以诱导愈伤组织、培养植物器官或是分离原生质体等方法进行研究，而形成层的分离培养方法近期才出现。

愈伤组织为植物脱分化后形成的薄壁组织，但是经过脱分化后，其次级代谢产物的量与种类都会减少，同时含有中央大液泡，在扩大培养（如发酵罐培养等）时中央大液泡容易碎裂导致细胞死亡，培养环境苛刻。

植物的器官培养一般包括植物根或是芽的培养，保持了植物的体细胞的一些状态，相对于愈伤组织而言，次级代谢产物的含量较多，但由于其易分化成为植物个体，导致其不能较好的用于工业生产。

植物的原生质体不含有细胞壁，细胞较为脆弱，对渗透压，pH等要求特别严格，一般用于转基因介导，再用于植株再生，很难用于工业生产中。

由于形成层分生组织拥有无限增殖的特征，因而被称为“植物干细胞”。形成层细胞系的分离和扩大培养在近期才出现，2010年11月，Nature Biotechnology中刊登了一篇名为《Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products》的文章，成功的分离扩大了红豆杉的形成层干细胞系。这种未脱分化细胞的细胞活性以及次级代谢产物含量较愈伤组织多100倍以上，同时发现其具有大量小液泡结构，在工业生产中具有更大的优势。

在含有贮藏根的植物中，贮藏根的作用为吸收无机盐贮存养分，含有大量的淀粉以及较多的次级代谢产物，而植物根的形成层是通过细胞横向分裂并分化成为根的髓部以及韧皮部，因此贮藏根的形成层是这些植物根部增粗的主要组织。但是在生长过程中贮藏根中含有大量的内生菌与共生菌。所以在作为外植体培养组织时需要进行深度灭菌来减少组织培养过程中的污染。

国际专利WO2010/137878 KO以及中国专利CN102459572A公开了银杏科的形成层来源的植物干细胞及其分离方法提供了木本植物的形成层干细胞系的分离扩大的方法。

国际专利WO2009/038416 EN 以及中国专利CN101939415A公开了来自静止中心的植物干细胞系及其分离方法。

国际专利 WO2009/038417 EN以及中国专利CN101939414A公开了将来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法，将人参、胡萝卜等一些贮藏根植物的干细胞进行分离扩大。该方法将含有贮藏根植物的根进行切片，通过渗透压处理，使切片中非形成层部分死亡或是不分裂，再通过适合的培养基将形成层干细胞系分离并扩大。

目前检测其细胞是否为干细胞的方法有通过显微镜检查是否为含有大量小液泡状态以及对辐射或是类辐射药物的敏感性来确定是否为植物干细胞系。

现有技术的缺点存在以下方面，通过实际运用，模仿关于贮藏根形成层细胞分离方法的专利的实验，发现在一些当归属植物中如当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels），白芷（Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav），紫花前胡（Angelica decursiva (Miq.) Franch. et Savat）等植物中不能够分离出形成层干细胞系。说明现有贮藏根形成层细胞分离技术方法在如上植物中不适用，需要新的方法来处理这类植物，以分离出形成层干细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处理，使外植体的表面和内部均无菌体存在；

2）外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片；

3）筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4℃~30℃条件下处理16~72h，使切片中非形成层部分的细胞不发生分裂； 

所述筛选培养基为含有蔗糖1～6%和琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为2～12；

4）分离培养：将上述筛选培养后的外植体切片取出放入切片液中进行恢复，然后再将切片放入分离培养基中进行培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组织细胞死亡或是不分裂；培养6~16天后获得初步分离出来的形成层细胞；

所述分离培养基为含有生长素0.1～2mg/L、蔗糖1～6%、琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9；

所述生长素选自二氯苯氧乙酸（2，4-D）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IBA）中至少一种；

5）继代培养：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5～16天，然后转移至分离培养基中培养5～16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞；

所述继代培养基为含蔗糖1～6%、0.2~1.2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA、7.5~8.5g/L琼脂、0.08~0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

进一步的，上述步骤1）中所述灭菌处理的具体过程为：先进行表面灭菌，即对洗净的外植体依次经乙醇溶液、次氯酸钠溶液、升汞溶液进行表面灭菌，清洗干净后；再进行深层灭菌，即将表面灭菌后的外植体在防褐化深层灭菌液中振摇20～40min。

进一步的，上述防褐化深层灭菌液为含有蔗糖1～6%、青霉素100~400mg/L、链霉素100~400mg/L、头孢霉素100~400mg/L、多菌灵0.5~2g/L、L-抗坏血酸100~400mg/L、柠檬酸100~400mg/L、0.008‰~0.020‰吐温-20的1/2MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

进一步的，上述步骤2）中所述外植体切片厚0.5～2mm，含有形成层。

进一步的，上述步骤3）中所述筛选培养基的pH为2～5或8~12。

进一步的，上述步骤4）中所述切片液为含有蔗糖1～6%、青霉素100~400mg/L、链霉素100~400mg/L、头孢霉素100~400mg/L、L-抗坏血酸100~400mg/L、柠檬酸100~400mg/L的1/2MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

进一步的，上述步骤4）分离培养的培养条件和步骤5）中所述继代培养的培养条件均为：温度为24~26℃、湿度为50~70%。

进一步的，上述当归属植物包括当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels、白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav、紫花前胡Angelica decursiva (Miq.) Franch. et Savat、疏叶当归Angelica laxifoliata Diels、拐芹Angelica polymorpha Maxim、重齿当归Angelica biserrata (Shan et Yuan) Yuan et Shan。

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞悬浮培养的方法，包括以下步骤：将上述方法制备的植物干细胞以湿重40~120g/L接种于液体的悬浮培养基中，在温度为23℃~27℃，转速为100~140rpm的条件进行培养，培养10~25天，即可；

所述悬浮培养基为含1～6%蔗糖、0.2~2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA的B5培养基，该培养基pH为5.0~5.9。

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的发酵罐培养方法，包括以下步骤：将上述方法制备的植物干细胞接种于液体继代培养基中，接种量为每升培养基中含湿重28~32g的植物干细胞，在温度为23℃~27℃，溶氧率为0.20~0.40，转速为100~140rpm的条件培养10~25天；

所述液体继代培养基为含1～6%蔗糖、0.2~2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA 、0.08~0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5.0~5.9。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新的植物形成层干细胞的制备方法，实现了对当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的分离，并对其扩大培养的方法进行了研究，提供了适应其扩大培养的悬浮培养方法和发酵罐培养方法，这对当归属植物在药用植物组织培养方面提供新的制备和培养方式，对当归属植物贮藏根形成层干细胞大量的工业生产奠定了基础，也为当归属植物贮藏根形成层干细胞提供了新的细胞来源。

附图说明

图1为分离培养过程中当归贮藏根外植体切片的生长情况，其中a为切片从筛选培养基中取出并进行分离培养的第1天的照片，b为分离培养第2天的状态，c为分离培养第4天的状态，d为分离培养第6天的状态；

图2为继代培养稳定后，获得的形成层干细胞系；

图3为本发明制备的形成层干细胞与愈伤组织细胞的显微结构；a为形成层干细胞的显微结构，b为中性红染色后的形成层干细胞，c为愈伤组织细胞的显微结构， d为中性红染色后的愈伤组织细胞；

图4为本发明制备的形成层干细胞的中性红染色图；

图5愈伤组织细胞与本发明制备的形成层干细胞经博来霉素处理后的细胞死亡率；

图6为悬浮培养15天后形成层干细胞的状态；

图7为愈伤组织悬浮培养15天后的图片。

具体实施方式

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处理，使外植体的表面和内部均无菌体存在；

2）外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片；

3）筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4℃~30℃条件下处理16~72h，使切片中非形成层部分的细胞分裂不发生分裂；

4）分离培养：将上述筛选培养后的外植体切片取出放入切片液中进行恢复，然后再将切片放入分离培养基中进行培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组织细胞死亡或是不分裂；培养6~16天后获得初步分离出来的形成层细胞；

5）继代培养：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5～16天，然后转移至分离培养基中培养5～16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞。

优选的，上述外植体为当归属植物一年生幼苗的直径为0.5～1cm含有形成层的贮藏根。

优选的，上述步骤1）中所述灭菌处理的具体过程为：先进行表面灭菌，即对洗净的外植体依次经乙醇溶液、次氯酸钠溶液、升汞溶液进行表面灭菌，清洗干净后；再进行深层灭菌，即将表面灭菌后的外植体在防褐化深层灭菌液中振摇20～40min。

优选的，上述防褐化深层灭菌液为含有蔗糖1～6%、青霉素100~400mg/L、链霉素100~400mg/L、头孢霉素100~400mg/L、多菌灵0.5~2g/L、L-抗坏血酸100~400mg/L、柠檬酸100~400mg/L、0.008‰~0.020‰吐温-20的1/2MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

优选的，上述步骤2）中所述外植体切片厚0.5～2mm，含有形成层。

优选的，上述切片液的配方为含有蔗糖1～6%、青霉素100~400mg/L、链霉素100~400mg/L、头孢霉素100~400mg/L、L-抗坏血酸100~400mg/L、柠檬酸100~400mg/L的1/2MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

优选的，上述筛选培养基为含有蔗糖1～6%和琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为2～12。

优选的，上述筛选培养基的pH值为2～5或8～12。

优选的，上述分离培养基为含有生长素0.1～2mg/L、蔗糖1～6%、琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

更优选的，上述分离培养基中生长素的浓度为0.2~1.3 mg/L。

优选的，上述生长素选自二氯苯氧乙酸（2，4-D）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IBA）中至少一种。

优选的，上述步骤4）中外植体切片在分离培养基中进行培养的条件为：温度24~26℃、湿度50~70%。

优选的，上述步骤5）中所述培养的条件均为：温度为24~26℃、湿度为50~70%。

优选的，上述继代培养基为含蔗糖1～6%、0.2~2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA、7.5~8.5g/L琼脂、0.08~0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5.0-5.9。

优选的，上述当归属植物包括当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels、白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav、紫花前胡Angelica decursiva (Miq.) Franch. et Savat、疏叶当归Angelica laxifoliata Diels、拐芹Angelica polymorpha Maxim、重齿当归Angelica biserrata (Shan et Yuan) Yuan et Shan。

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞悬浮培养的方法，包括以下步骤：将上述方法制备的植物干细胞以湿重40~120g/L接种于液体的悬浮培养基中，在温度为23℃~27℃，转速为100~140rpm的条件进行培养10~25天；

所述悬浮培养基为含1～6%蔗糖、0.2~2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA的B5培养基，该培养基pH为5.0~5.9。

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的发酵罐培养方法，包括以下步骤：将上述方法制备的植物干细胞接种于液体继代培养基中，接种量为每升培养基中含湿重28~32g的植物干细胞，在温度为23℃~27℃，溶氧率为0.2~0.4，转速为100~140rpm的条件培养10~25天；

所述含1～6%蔗糖、0.2~2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA、0.08~0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5.0~5.9。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法

（1）外植体的选取和灭菌

选取一年生当归幼苗直径0.8cm左右的完整根，去除表面泥土，用自来水冲洗30分钟，得到洁净的外植体。在无菌操作台中用75%乙醇将外植体浸泡30秒，用无菌水清洗2次。然后用1~2%次氯酸钠浸泡并振摇4分钟后用无菌水清洗2次，最后用0.1%升汞浸泡振摇4分钟，并用无菌水清洗4~5次，得到表面完全灭菌的外植体。

将表面灭菌完毕的外植体放入防褐化深层灭菌液中振摇30分钟。所述防褐化深层灭菌液含有蔗糖3%、青霉素200mg/L、链霉素300mg/L、头孢霉素300mg/L、多菌灵1g/L、L-抗坏血酸100mg/L、柠檬酸100mg/L、0.01‰吐温-20的1/2MS培养基（如表1所示），pH为5.0-5.9。

表1防褐化深层灭菌液配方

其中在配制过程中，将青霉素、链霉素、头孢霉素、L-抗坏血酸和柠檬酸用无菌水混合溶解后调节pH至5.8，再通过0.22微米滤膜过滤除菌加入灭菌后冷却的培养基中。灭菌后冷却的培养基为表1中其他成分混合后于121℃高温灭菌20分钟所得的培养基。

其中，MS配方为：NH₄NO₃ 1650mg/L，KNO₃ 1900mg/L，CaCl₂·2H₂O 440mg/L，MgSO₄·7H₂O 370mg/L，KH₂PO4 170mg/L，FeSO4 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₄ 6.2 mg/L，MnSO₄·4H₂O 2.23 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，L-甘氨酸 20mg/L，盐酸吡哆醇（维生素B6） 5mg/L，烟酸 5mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1) 1mg/L，肌醇100mg/L，余量为水（以下所有MS配方均为此）。

1/2MS为：大量元素CaCl₂，KNO₃，NH₄NO₃，MgSO₄，KH₂PO4 的用量为MS培养基的一半，其他成分均与MS培养基相同。

（2）外植体的切片

将外植体取出放在培养皿中进行切片，切片厚度为0.5～2mm，含有形成层，并尽量保持切片的完整。

所述切片液的配方为含有蔗糖3%、青霉素100mg/L、链霉素150mg/L、头孢霉素150mg/L、L-抗坏血酸100mg/L、柠檬酸200mg/L的1/2MS培养基（配方如表2所示），该培养基pH为5.0~5.9。

表2切片液配方

其中在配制过程中，将青霉素、链霉素、头孢霉素、抗坏血酸和柠檬酸用无菌水混合溶解后调节pH至5.8，再通过0.22微米滤膜过滤除菌加入灭菌后冷却的培养基中。灭菌后冷却的培养基为表2中其他成分混合后于121℃高温灭菌20分钟所得的培养基。

（3）筛选培养

将上述切片贴附于pH为8的固体筛选培养基上，在4~30℃条件下处理16~72小时，使形成层以外的组织细胞不分裂。温度较低时，可处理较长时间，且效果较好。所述筛选培养基为含有蔗糖3%和琼脂8g/L的MS培养基，该培养基pH为8（如表3所示），该筛选培养的pH值还可以为2~5或8~12间的任意值。

外植体切片附在上述筛选培养上处理一段时间，使得贮藏根形成层以外的组织（包括韧皮部，髓部等）失去脱分化成愈伤组织的能力，而外皮（木栓层）在表面灭菌时已经发生死亡。

表3 筛选培养基配方

（4）分离培养基使外植体的形成层干细胞系生长：

如图1所示的贮藏根中形成层被分离的过程；将上述筛选培养后的外植体切片放在切片液中浸泡30秒进行恢复，使切片温度恢复为24~26℃，使pH恢复为5.0~5.9；然后再将其放入分离培养基中（如图1a所示），在25℃的条件下培养，培养至第2天时的状态如图1b所示，培养至第4天时的状态如图1c所示，可以观察到形成层细胞横向分裂使切片拱起呈碗形，培养至第6天时的状态如图1d所示，可观察到更为明显的碗形状态，形成层细胞进一步增多；当培养6~16天后结束分离培养，可获得初步分离出来的形成层细胞；

在分离培养过程中，切片在适合形成层细胞生长的分离培养基中迅速分裂且不发生脱分化，得到一定数量的形成层细胞，而其他组织细胞在筛选培养基中处理后已经死亡或是不分裂则被忽略不计；从而分离得到了形成层细胞。

在上述分离培养过程中，本发明还对分离培养基的配方进行了大量的筛选，尤其是对配方中激素的筛选，以使切片中形成层细胞不会脱分化成愈伤组织 ，从而确保最终分离出的形成层干细胞是纯天然的，而不是经过脱分化形成的。

所述分离培养基为含有生长素2,4-D和IAA 各0.6～0.8mg/L、蔗糖3%、琼脂8g/L的MS培养基，该培养基pH为5.0~5.9（如表4所示）。

上述分离培养基中生长素的总浓度还可以为0.1～2mg/L范围中的任意值，其中生长素可以选择二氯苯氧乙酸（2，4-D）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IBA）中至少一种。

表4分离培养基的配方

（5）继代培养

形成层细胞虽然被分离出并有一定数量，但是此时细胞的生长速度比较慢，分离培养基不适合持续继代。所以优选适合其迅速生长的培养基作为继代培养基（其配方如表5所示）。

继代培养的具体操作为：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5～16天，然后转移至分离培养基中培养5～16天，再转移至继代培养基中，用分离培养基和继代培养基反复交替地进行继代培养，在重复多个周期后通过显微镜检查细胞，确定依旧保持有大量小液泡结构，则这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞系。

所述继代培养基为含蔗糖3%、2,4-D 1mg/L、激动素（KT）0.01mg/L、NAA 1mg/L、琼脂 8g/L、活性炭0.1g/L的B5培养基，该培养基pH为5.0～5.9（如表5所示）。

表5继代培养基配方

B5培养基配方：KNO₃ 2500mg/L，(NH₄)₂SO₄ 134 mg/LL，MgSO₄·7H₂O 121.56mg/L，CaCl₂·2H₂O 113.23mg/L，FeSO4 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L，NaH₂PO₄·H₂O 130.44 mg/L ，MnSO₄·4H₂O 10mg/L ，ZnSO₄·7H₂O 2mg/L，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg/L，H₃BO₄ 3 mg/L，KI 0.75 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1) 20mg/L，烟酸 2mg/L，盐酸吡哆醇（维生素B6）2mg/L，L-抗坏血酸 50 mg/L，柠檬酸75 mg/L，L-天冬氨酸 133 mg/L，L-精氨酸 175 mg/L，L-甘氨酸 75 mg/L，L-脯氨酸115 mg/L。

如图2为上述继代培养后获得的形成层干细胞系；该干细胞系为淡黄色松软的组织状态。

下面对上述实施例中制备的形成层干细胞进行相关特性的鉴定。

一、显微结构鉴定

将实施例1制备的形成层干细胞的显微结构进行观察，并与脱分化形成的愈伤组织细胞进行对比，结果如图3所示，图3a为实施例1制备的形成层干细胞的显微照片，图3c为愈伤组织细胞的显微照片，图3b和图4为实施例1制备的形成层干细胞在中性红染色后的照片，图3d为愈伤组织细胞中性红染色后的照片，通过中性红染色液泡图片的对比（图3b、图4和图3d），可明显看出本发明制备出的形成层干细胞中具有大量的小液泡结构，与根尖茎尖分生组织的特征相似，而愈伤组织细胞中为中央大液泡的结构。

二、类辐射药物处理实验

将愈伤组织细胞与本发明制备的形成层干细胞在不同浓度博来霉素下处理24h和48h后，对细胞死亡率进行统计。

使用类辐射药物博来霉素0-200μg/mL处理形成层干细胞系与愈伤组织的液体悬浮细胞24小时与48小时，用Evans Blue和FDA染色统计细胞死亡率（FDA将染色后在红色激发光源下发散绿色荧光，表示细胞为活细胞；Evans Blue将细胞染色后在蓝色激发光源下发散红色荧光，表示细胞为死细胞），发现在较高浓度下（大于80μg/mL），形成层干细胞的死亡率更高。说明形成层干细胞比愈伤组织对博来霉素更加敏感。即形成层干细胞对类辐射药物较为敏感，进一步说明本发明方法制备出来的形成层干细胞为天然干细胞，不是经过脱分化而成的愈伤组织。

实施例 2：当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的培养方法

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞悬浮培养的方法

在植物细胞工程的运用中，需要建立悬浮体系而有助于进一步的研究。具体的悬浮培养操作如下：将实施例1中得到的形成层干细胞系以湿重40g/L接种于液体培养基中，在100~120rpm，23℃~27℃环境下培养，其中悬浮培养基配方如表5所示。在悬浮培养15天后观察发现形成层干细胞系为白色均匀的细胞（如图6所示），而愈伤组织细胞有褐化的特征，且愈伤组织中组织团块大小不同（如图7所示）。

表6悬浮培养基成分

下面对实施例2所述悬浮培养法获得的形成层干细胞的相关功能进行检测。

阿魏酸生物合成的检测

L-苯丙氨酸在阿魏酸的合成中处于较上游的原料，在植物当归中的生物合成顺序为L-苯丙氨酸→桂皮酸→对香豆酸→咖啡酸→阿魏酸的合成路线，天然的当归细胞会利用环境中的L-苯丙氨酸通过体内生物合成途径合成阿魏酸。而阿魏酸是检测当归质量的指标性成分。

将50mL含有500mg/L L-苯丙氨酸的悬浮培养基加入250mL的锥形瓶中，再将实施例1中制备的形成层干细胞系、愈伤组织按80g/L的量接种到锥形瓶中。悬浮培养10天后，收集细胞，并用甲醇提取，乙酸乙酯萃取后，检测细胞萃取液中阿魏酸的量。

通过HPLC检测316nm下的吸收峰，发现实施例2所述悬浮培养法获得的形成层干细胞中的阿魏酸量为9.118mg/千克湿重细胞，而在愈伤组织中没有检测到阿魏酸。

上述结果说明本发明制得的形成层干细胞系不同于愈伤组织，本发明制得的形成层干细胞系的次级代谢产物合成的活性更强。

实施例 3：当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的培养方法

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞发酵罐培养的方法

使用5L的气升式发酵罐进行培养，按细胞湿重为40g/L的量，分别将实施例1制备的形成层植物干细胞和愈伤组织接种于液体继代培养基中，并于转速105-115rpm，温度25℃，溶氧率（OD值）0.3的条件下进行培养 21天。

结果发现愈伤组织的生长率仅为1.67，并且细胞发生褐化。本发明制备的形成层干细胞系的生长率为2.83。说明本发明制备的形成层干细胞在发酵罐培养的条件下具有快速增殖的能力。

另外，申请人还对当归属中其它种的植物进行了上述实施例1~3所述的实验，所选取的植物有白芷（Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav），紫花前胡（Angelica decursiva (Miq.) Franch. et Savat），疏叶当归（Angelica laxifoliata Diels），拐芹（Angelica polymorpha Maxim.），重齿当归（Angelica biserrata (Shan et Yuan) Yuan et Shan）等均取得了如实施例1~3所述的类似的结果，进一步说明了本发明方法适用于当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备及其培养。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。