一株海洋希瓦氏细菌及其在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用

摘要

本发明公开了一株海洋希瓦氏细菌及其在诱导厚壳贻贝稚贝附着中的应用，保藏编号为CGMCC No：9798，分类命名：希瓦氏菌Shewanella sp。实验证实，本发明成功分离、纯化和鉴定的海洋希瓦氏细菌菌株ECSMB56形成的微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着具有诱导作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一株海洋希瓦氏细菌及其在诱导厚壳贻贝稚贝附着方面的应用，具体 涉及一株海洋希瓦氏细菌(Shewanella sp.ECSMB56)的分离、纯化、鉴定和保藏以及其 在不同初始细菌密度条件下形成的微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响作用。

背景技术

因此，现有技术存在缺陷，需要改进厚壳贻贝(Mytilus coruscus)，隶属于软体动 物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，贻贝目(Mytilodia)，贻贝科(Mytilidae)，是我 国重要的海产贝类养殖品种，分布于黄海、渤海和东海沿岸。在厚壳贻贝生活史中，浮 游生活阶段的幼虫成熟后，便会附着变态成为稚贝，并最终发育为成贝。在由稚贝向成 贝生长发育的过程中，当环境发生变化时，厚壳贻贝稚贝能够自行切断足丝，开始爬行 并重新选择适宜的附着基进行再次附着。另外，厚壳贻贝具有生长快、抗病能力和环境 适应能力强等特点，但由于自然资源的大量采捕和人工培育技术的不足，制约了厚壳贻 贝养殖产业的发展。因此，探索利用细菌形成微生物被膜诱导厚壳贻贝附着技术等生物 工程技术显得尤为必要。

发明内容

本发明涉及的海洋希瓦氏细菌(Shewanella sp.ECSMB56)来源于浙江省舟山市枸 杞岛海域(122°46′E；30°43′N)的自然微生物被膜。利用ZoBell 2216E固体培养基分离、 纯化得到纯种菌落，并通过16S rRNA基因测序与GENEBAN (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中核酸数据进行比对后上传至NCBI数据库。最终确定 菌名为希瓦氏细菌，获取序列号为KM369861，该细菌菌株ECSMB56保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2014年10月20日，保藏 编号为CGMCC No：9798，分类命名：希瓦氏菌Shewanella sp.

实验证实，本发明成功分离、纯化和鉴定的海洋希瓦氏细菌菌株ECSMB56形成的 微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着具有诱导作用。

附图说明

图1不同初始细菌密度形成的微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的诱导作用；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

菌株的分离及保藏：

本发明涉及的海洋希瓦氏细菌(Shewanella sp.ECSMB56)来源于浙江省舟山市枸 杞岛海域(122°46′E；30°43′N)的自然微生物被膜。利用ZoBell 2216E固体培养基分离、 纯化得到纯种菌落，并通过16S rRNA基因测序与GENEBAN (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中核酸数据进行比对后上传至NCBI数据库。最终确定 菌名为希瓦氏细菌，获取序列号为KM369861，该细菌菌株ECSMB56保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2014年10月20日，保藏 编号为CGMCC No：9798，分类命名：希瓦氏菌Shewanella sp.

本发明涉及的海洋希瓦氏细菌对厚壳贻贝稚贝附着的诱导实验是将纯种菌株先接 到ZoBell 2216E液体培养基中扩大培养，离心洗涤并制成悬浮液。然后用吖啶橙染色并 在荧光显微镜1000倍镜头下随机选取10个点进行计数，确定菌液总密度为3.4×10⁸cells/ml。之后将一枚灭菌的载玻片放在盛有20ml菌液初始细菌密度为1.0×10⁶cells/ml、 3.0×10⁶cells/ml、6.0×10⁶cells/ml和10×10⁶cells/ml的培养皿中，在18℃、黑暗条件下培 养48h形成微生物被膜。最后将一枚附有微生物被膜的载玻片及10只厚壳贻贝稚贝(壳 长1.22±0.05mm；壳高0.75±0.02mm)放入含有灭菌过滤海水的培养皿中，在12h 时记录稚贝的附着率，即载玻片上附着的稚贝个数占该培养皿中稚贝总个数的百分比。

研究发现该细菌形成的微生物被膜对厚壳贻贝稚贝的附着有较高的诱导活性，实验 结果如图1所示，在初始密度为10×10⁶cells/ml时(当初始细菌密度大于10×10⁶cells/ml时，附着率基本保持不变)，形成的微生物被膜对稚贝附着的诱导率高达55％， 相比与无微生物被膜的对照组提高了45％。另外，不同初始密度条件下形成的微生物被 膜对稚贝的诱导活性也有所不同，初始密度为1.0×10⁶cells/ml时形成的微生物被膜对 稚贝的诱导活性仅为37％。由此可得，该株海洋希瓦氏细菌形成的微生物被膜能够有效 诱导海产贝类厚壳贻贝稚贝的附着，本研究成果对于阐明厚壳贻贝稚贝附着机制和厚壳 贻贝培育与养殖均具有重要的意义。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。