一种从国槐中分离出的山奈酚衍生物及其制备方法和用途

摘要

本发明属于林产化学及树木活性成分技术领域，具体涉及一种新的山奈酚衍生物即山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷[kaempferol-3-O-(4″-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside]及其制备方法和在制备抑菌产品中的应用。本发明以国槐(Sophorajapon1ca L.)根皮为原料，其制备工艺规范简单，实验证明山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷对菌株的生长有较强的抑制作用。

说明书

技术领域

本发明属于林产化学及树木活性成分技术领域，具体涉及从国槐(Sophora japonica L.) 根皮中分离得到一种新的山奈酚衍生物即山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷 [kaempferol-3-O-(4″-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside]及其制备方法和用途。

背景技术

国槐(Sophorajaponica L.)为豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Fabaceae)槐属(Sophora  L.)的落叶乔木，别名槐树、中国槐、家槐、守宫槐、细叶槐、槐米树等，其广泛分布在我 国的大部分地区。国槐树高可达15-25m，有根瘤，适宜于湿润肥沃的土壤(杨鑫，等，北方 园艺，2011，(19)：175-178)。文献记载表明，国槐的槐叶、槐花、槐胶、果实、树皮及树根皆 可入药(赵垦田，等，植物研究，1999，19(3)：281-285)。到现在为止，研究人员已从国槐诸多 部位提取分离到了多种次生代谢产物，其中，黄酮类化合物为其主要成分(Zhang LB，et a1.， Fitoterapia，2013，87：89-92)。

近年来，因诸多原因，耐药菌株持续增多，细菌及真菌等菌株中致病菌的耐药性持续增 强，导致临床感染病死率持续增高。目前，食品届、医药界科研人员正积极致力于寻找安全、 高效、广谱的天然抑菌剂。植物是抑菌活性物质的天然宝库，文献表明，全世界已报道过1600 多种具有抑制有害生物的高等植物，其中抑真菌的有94种，抑细菌的有11种，抑病毒的有17 种。另有资料记载至少1389种植物将有可能作为杀菌剂(张应烙，等，西南民族大学学报(自 然科学版)，31(3)：402-409)。因而，在植物次生代谢天然成分中寻找具有抑菌活性的物质已成 为开发高效杀菌剂的重要思路(刘海燕，等，河北农业科学，2005，21(4)：254-257，328)。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的山奈酚衍生物即山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠 李糖苷[kaempferol-3-O-(4″-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside]。

本发明的另一个目的是提供从豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Fabaceae)槐属(Sophora  L.)树木国槐(Sophora japonica L.)的根皮中制备山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李 糖苷的方法。

本发明的第三个目的是提供山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的抑菌活性 功效用途。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供的山奈酚衍生物为下述结构式的化合物：

本发明的化合物分子式为C₂₈H₂₄O₁₄，化学名为山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李 糖苷，其对应的英文名为kaempferol-3-O-(4″-galloyl)-α-L-rhamnopyranoside。

从国槐根皮中制备山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的方法，包括如下步骤：

(1)取粉碎的国槐根皮植物原料，按质量比为1∶1～1∶15加入体积百分浓度为1％～ 99％的丙酮水溶液，常温或加热或微波或超声波提取1～6次，每次1～48小时，过滤，滤液 减压浓缩至原体积的1％～20％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量1～6倍的水，搅拌，加入粗提物质量1～6倍的正己烷萃取1～6 次，分离，将剩余水层加入粗提物质量1～6倍的氯仿萃取1～6次，分离，将再次剩余水层 加入粗提物质量1～6倍的乙酸乙酯萃取1～6次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将乙酸乙 酯层减压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经硅胶柱层析和凝胶柱层析之至少一种制备得到山奈酚-3-O-(4″-没 食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷。

该制备方法具有得率高、生产成本低、工艺简单规范的特点。

实验证实山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷对革兰氏阳性菌中的金黄色葡 萄球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌中的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia) 均有较强的抑制作用(对上述两种菌株的对应最小抑菌浓度分别为0.5和4.0μg/ml)，其抑菌 效果与正对照组新霉素(neomycin)的抑菌效果相当(新霉素对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷 伯氏菌最小抑菌浓度分别为0.5和2.0μg/ml)。这表明山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃 鼠李糖苷能抑制常见致病菌株的生长，可用作高效的抗菌剂应用于食品、保健品、医药品、 化妆品等领域。

具体实施方式

参考下列实施例将更容易、更全面地理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不 是以任何方式限制本发明。

实施例1：

山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的制备

(1)取粉碎的国槐根皮植物原料，按质量比为1∶3加入体积百分浓度为70％的丙酮水 溶液，常温提取3次，每次36小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的10％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量3倍的水，搅拌，加入粗提物质量3倍的正己烷萃取3次，分离， 将剩余水层加入粗提物质量3倍的氯仿萃取3次，分离，将再次剩余水层加入粗提物质量3 倍的乙酸乙酯萃取3次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯 萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经硅胶柱层析制备得到山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李 糖苷。

该化合物的结构鉴定：

由快原子轰击质谱(FAB MS)显示该化合物的m/z[M+Na]⁺为607，m/z[M+H]⁺为585， 结合¹H NMR和¹³C NMR谱得出其分子式为C₂₈H₂₄O₁₄。

¹H NMR谱(数据见表1)中的质子峰[δ8.01(2H，d，J＝8.5Hz，H-2′，6′)和δ6.90(2H， d，J＝8.5Hz，H-3′，5′)]显示该化合物的B环为典型AA′BB′式质子芳香环。质子信号[δ6.20 (1H，d，J＝2.3Hz，H-6)和δ6.39(1H，d，J＝2.3Hz，H-8)]表明其A环为间苯三酚型。而¹³C NMR 峰数据[δ159.4(C-2)，134.8(C-3)，179.4(C-4)]揭示该化合物为典型的黄酮醇。因此，该化合物 的苷元被确定为山奈酚。

在¹H NMR谱中，显示该化合物中含有一个α-L-吡喃鼠李糖苷[1个端基氢δ5.29(1H， br s，H-1″)、一个甲基δ0.95(3H，d，J＝6.1Hz，H-6″)及δ3.52～5.03(4H，H-2″，3″，4″，5″)]。

质子信号δ7.09(2H，s，H-2″′，6″′)结合¹³C NMR数据[δ121.9(C-1″′)，110.1(C-2″′，6″′)， 146.4(C-3″′，5″′)，139.9(C-4″′)]表明该化合物中包含一个没食子酰基。

HMBC谱显示该化合物的鼠李糖端基氢δ5.29(1H，br s，H-1″)与山奈酚上的碳信号δ 134.8(C-3)有远程相关性，确定α-L-吡喃鼠李糖苷与山奈酚的C-3位相连。而鼠李糖上质 子峰δ5.03(1H，dd，J＝10.3Hz，J＝9.7Hz，H-4″)与没食子酰基上的碳信号δ168.3(C-7″′)有远 程相关性，则确定了没食子酰基的7″′号位与α-L-吡喃鼠李糖苷4″号位相连。

综上，该化合物的结构被确定为山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷。

经检索，该化合物为此前从未报道过的新的山奈酚衍生物。该化合物为白色无定型粉末， 熔点为191～193℃，旋光度该化合物在紫外灯254nm波长下 有紫外吸收，以1％的三氯化铁乙醇溶液(质量百分比)喷雾显色反应呈深绿色。TLC试验 中，以冰乙酸-水体积比3∶47的溶剂系统展开时，该化合物的R_f值为0.49，而以叔丁醇-冰 乙酸-水体积比3∶1∶1的溶剂系统展开时，该化合物的R_f值为0.73。

表1.山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的¹H(400MHz)及¹³C NMR(100MHz) 谱数据(CD₃OD)

实施例2：

山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的制备

(1)取粉碎的国槐根皮植物原料，按质量比为1∶4加入体积百分浓度为60％的丙酮水 溶液，微波提取4次，每次3小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的8％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量2倍的水，搅拌，加入粗提物质量2倍的正己烷萃取4次，分离， 将剩余水层加入粗提物质量2倍的氯仿萃取4次，分离，将再次剩余水层加入粗提物质量2 倍的乙酸乙酯萃取4次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯 萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经凝胶柱层析制备得到山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖 苷。

实施例3：

山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的制备

(1)取粉碎的国槐根皮植物原料，按质量比为1∶2加入体积百分浓度为80％的丙酮水 溶液，超声提取2次，每次4小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的5％，得粗提 物；

(2)加入粗提物质量4倍的水，搅拌，加入粗提物质量4倍的正己烷萃取2次，分离， 将剩余水层加入粗提物质量4倍的氯仿萃取2次，分离，将再次剩余水层加入粗提 物质量4倍的乙酸乙酯萃取2次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将乙酸乙酯层减 压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经凝胶柱层析和硅胶柱层析制备得到山奈酚-3-O-(4″-没食子酰 基)-α-L-吡喃鼠李糖苷。

实施例4：

以最小抑菌浓度法评价山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷的抑菌活性

1.实验材料

1.1实验菌株：本实验中供试菌种采用革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌(Staphylococous  aureus)和革兰氏阴性菌中的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)。以上两种菌株均由天 津科技大学食品工程学院微生物实验室提供。

1.2实验设备：恒温震荡器、恒温培养箱、超净工作台等。

1.3待测药品：上述山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷经HPLC测定后纯度 为99.9％，选用的正对照组为广谱高效的新霉素。

2.操作步骤：试验采用的最小抑菌浓度方法参照文献中记述步骤进行(Rabe T，van Staden  J，Journal of Ethnopharmacology，2000，73，171-174)。各组实验均独立进行三次，取其平均值 计算。

实验结果如表2所示。结果表明，山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷对金黄 色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌均有较强的抑制活性，其抑菌效果和正对照组新霉素抑菌效果 相当。

表2.山奈酚-3-O-(4″-没食子酰基)-α-L-吡喃鼠李糖苷和新霉素对实验菌株的最小抑菌浓度 (μg/ml)