使树突细胞成熟的组合物以及用其制备抗原特异性树突细胞的方法

摘要

本发明涉及一种使树突细胞成熟的组合物，包括：作为成熟促进因子的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)、溶链菌制剂(OK432)和/或聚肌胞。本发明的使树突细胞成熟的组合物可具有不仅改进树突细胞诱导免疫应答的能力，而且可以降低树突细胞的抗原非特异性的免疫应答，并且提高树突细胞的抗原特异性的免疫应答，从而使免疫疗法的效果最大化。

说明书

技术领域

本发明涉及一种使树突细胞成熟的组合物，以及一种使用该组合物制备抗 原特异性的树突细胞的方法。

背景技术

树突细胞(DC)是抗原提呈细胞(APC)，具有在免疫系统的细胞中提呈 抗原的最大潜力。树突细胞刺激还没有暴露至抗原的T细胞(被称为幼稚T细 胞)，从而诱导免疫反应。因此，树突细胞是独特的免疫细胞，它与其它的APC 不同，能够有效诱导初次免疫应答并且活化记忆T细胞。已知，树突细胞在它 的表面表达高浓度的共刺激分子，以及MHC分子(I/II)，而且树突细胞释放T 细胞活化所需的细胞因子(IFN-α、IL-12、IL-18)。这是为什么树突细胞能够诱 导潜在的免疫应答的原因。通过释放与Th1免疫相关的细胞因子(诸如IFN-α、 IL-12等)，I型树突细胞能够诱导抗原特异性的Th1细胞的增殖以及细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)的活化，因此I型树突细胞在免疫疗法中具有有益的应用。

为了在癌症的免疫疗法中利用树突细胞，必需使用体外使单核细胞分化成 树突细胞，并使未成熟的树突细胞成熟为在诱导T细胞免疫时有用的成熟树突 细胞的技术。在本领域中，从体内的单核细胞制备未成熟的树突细胞的技术以 及成熟的工序还没有标准化。具体地，通过如下工序实现从单核细胞分化得到 的未成熟树突细胞的成熟：使未成熟树突细胞能够迁移到淋巴结中，未成熟树 突细胞在淋巴结中将抗原片段提呈给幼稚T细胞，以诱导Th1免疫应答。与未 成熟的树突细胞相比，完全成熟的树突细胞在它的表面上表达MHC I和II分子 以及高浓度的T细胞共刺激分子(即CD80和CD86)。此外，成熟的树突细胞 分泌很多细胞因子，这些细胞因子直接参与诱导T细胞免疫应答。在经历了成 熟引起的此种改变之后，树突细胞大大增加了诱导T细胞免疫应答的潜能。

已知，MCM(单核细胞条件培养基)可用于树突细胞的成熟。通过体外培 养单核细胞制备的MCM用作成熟因子的来源。但是，MCM途径并不能确保 从一个成熟工序至另一成熟工序都有一致的条件，因为，单核细胞响应于外部 信号所释放的促炎细胞因子的数量在不同人之间有很大不同。此外，另一缺点 是需要大量的外周血单核细胞来制备MCM。作为MCM途径的替代，开发了 选自MCM组分中的重要的细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE₂)组成的细 胞因子鸡尾酒。细胞因子鸡尾酒能够稳定生产具有相对较高功能的树突细胞， 且解决了MCM的问题。但是，仅有细胞因子鸡尾酒不能提供充分成熟的树突 细胞。

韩国专利申请未经审查的公开第10-2011-0035633号公开了，通过使用Th1 细胞核树突细胞在体外生成细胞毒性T细胞。但是，因为这种方法利用的是还 没有完全成熟的树突细胞，因此难以预期由此方法能够得到足够的免疫治疗效 果。

因此，非常需要更有效的树突细胞的成熟技术，通过该成熟技术能够诱导 针对癌症的潜在的抗原特异性免疫，从而产生对癌症的最好的免疫治疗效果。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供使树突细胞成熟的组合物，该组合物增强 树突细胞诱导免疫应答的能力，降低树突细胞的抗原非特异性的免疫应答，并 且提高树突细胞的抗原特异性的免疫应答，从而发挥最好的免疫治疗效果。

本发明的另一目的是提供抗原特异性的树突细胞，该抗原特异性的树突细 胞通过使用所述使树突细胞成熟的组合物来制备。

本发明的又一目的是提供制备抗原特异性的树突细胞的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种使树突细胞成熟的组合物，该 组合物包括：作为成熟因子的选自白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)、溶链菌 制剂(Picibanil)(OK432)和聚肌胞(Poly IC)中的至少一种。

根据本发明的另一方面，本发明提供了抗原特异性的树突细胞，该抗原特 异性的树突细胞通过使用上述组合物制备。

根据本发明的又一方面，本发明提供了制备抗原特异性的树突细胞的方法， 该方法包括：使用抗原使未成熟的树突细胞致敏；以及，使用选自以下成熟因 子中的至少一种成熟因子来处理经过致敏的树突细胞：白细胞介素-1β(IL-1β)、 白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺 素E2(PGE2)、溶链菌制剂(OK432)和聚肌胞。

除了提高树突细胞诱导免疫应答的能力之外，本发明的成熟组合物的组成 还能够提高抗原特异性的T细胞免疫应答，同时降低非特异性的免疫应答，从 而带来最好的免疫治疗效果。

附图说明

图1是同时使用抗原(Ag)和所有的成熟因子(CM)处理(B)，或在时 间滞后处仅使用成熟因子溶链菌制剂(OK432)处理(A)，来制备成熟的树突 细胞的示意图。

图2是示出了在实施例1-1(MAGE-1/OK+)和对比例1-1(MAGE-1/OK-) 中，在树突细胞的成熟过程中释放到树突细胞的培养液中的IL-12和IL-10的水 平的柱形图。在柱形图中，cvDC和sDC分别表示在实施例1-1和对比例1-1 中制备的树突细胞。

图3是示出了当从外周血细胞中分离的T细胞与实施例1-1(MAGE-1)或 对比例1-1的树突细胞共培养时，通过MTT测定测量的T细胞的增殖的柱形图。 在该柱形图中，cvDC和sDC分别表示在实施例1-1和对比例1-1中制备的树突 细胞。

图4是示出了当从外周血细胞中分离的T细胞与实施例1-1(MAGE-1)或 对比例1-1的树突细胞共培养时，通过ELISA测量的在培养上清液中的IFN-γ 的水平的柱形图。在该柱形图中，cvDC和sDC分别表示在实施例1-1和对比 例1-1中制备的树突细胞。

图5是示出了在三轮测量中释放到培养基中的IFN-γ的水平的曲线图，其 中在每次测量的过程中，以细胞间预先设定的混合比率，使用实施例1-2 (AFP/OK+)、对比例2(Un/OK+)、对比例3-2(AFP/OK-)和对比例4(Un/OK-) 的树突细胞刺激自身的T细胞。

图6是显示了通过IFN-γELISPOT分析测量的，由实施例1-3(GPC-3/OK+) 和对比例2(Un/OK+)、对比例3-3(GPC-3/OK-)及对比例4(Un/OK-)的树 突细胞诱导的CTL的抗原特异性的柱形图。

图7是示出了当通过实施例1-2(AFP/OK+)、对比例2(Un/OK+)、对比 例3-2(AFP/OK-)和对比例4(Un/OK-)的树突细胞活化的CTL与靶细胞反 应时，释放到培养基中的IFN-γ的水平的柱形图。

图8是示出了实施例1-2(AFP/OK+)和对比例3-2(AFP/OK-)的树突细 胞在它们的成熟过程中释放到培养基中的IL-12和IL-10的水平的柱形图。

图9是示出了当从外周血细胞中纯化的T细胞与实施例1-3(GPC-3/OK+) 和对比例3-3(GPC-3/OK-)的树突细胞共培养时，通过MTT测定测量的T细 胞增殖的柱形图。

图10是示出了当从外周血细胞中纯化的T细胞与实施例1-2(AFP/OK+) 或对比例3-2(AFP/OK-)的树突细胞共培养时，通过ELISA测量的在培养基 中的IFN-γ的水平的柱形图。

图11是示出了在实施例1-3(GPC-3/OK+)和对比例3-3(GPC-3/OK-)的 树突细胞所引起的CTL扩增的每一阶段中的细胞增殖的曲线图。

图12是示出了在使用实施例1-3(GPC-3/OK+)和对比例3-3(GPC-3/OK-) 的树突细胞诱导CTL期间，通过ELISA测量的在培养基中IFN-γ的水平的曲 线图。

图13是示出了通过实施例1-3(GPC-3/OK+)和实施例2-3(GPC-3/OK+) 的树突细胞活化的，通过IFN-γELISPOT分析测量的CTL的抗原特异性的柱形 图。如图1B中所示，CTL通过经抗原和除了溶链菌制剂之外的成熟因子处理 之后0或4小时又经溶链菌制剂(OK432)处理的树突细胞诱导。

图14示出了实施例1-3(GPC-3/OK+)和实施例2-3(GPC-3/OK+)的CTL 的抗原特异性的细胞毒性的曲线图。

图15是示出了通过实施例3-1至3-5的树突细胞诱导的T细胞增殖的柱形 图。

图16是示出了通过实施例3-1至3-5的树突细胞诱导的Th1免疫应答的柱 形图。

图17是示出了通过实施例3-1至3-5的树突细胞诱导的，通过IFN-γ ELISPOT分析测量的CTL的抗原特异性的柱形图。

具体实施方式

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种使树突细胞成熟的组合物，该 组合物包括含溶链菌制剂(OK432)成熟因子。本发明具体是发明人通过发现 以下过程来完成的：经过成熟因子溶链菌制剂(OK432)和抗原以一定时间间 隔进行的处理而成熟的树突细胞诱导免疫应答的能力明显提高。另外，通过本 发明的树突细胞，降低了抗原非特异性的免疫应答，同时提高了抗原特异性的 免疫应答，从而使免疫疗法的效果最大化。

在本发明中使用的成熟因子可以是选自白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介 素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2)、 溶链菌制剂(OK432)和聚肌胞中的至少一种，优选是溶链菌制剂(OK432)。

溶链菌制剂(OK432)是抗肿瘤的药物，用于增加细胞免疫力，并且是由 经青霉素预处理的冻干的溶血性链球菌制得的。在本领域中，只要是指溶链菌 制剂(OK432)的任何药剂都可以在本发明中使用，没有任何特别的限制。虽 然最初开发溶链菌制剂(OK432)是用于治疗消化系统癌症、甲状腺癌和肺癌， 但在本发明中，溶链菌制剂(OK432)用作树突细胞成熟因子，以大大增强树 突细胞诱导免疫应答的能力。而且，选自白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素 -6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、前列腺素E2(PGE2) 和聚肌胞中的任何物质都可用在本发明中，而没有任何限制。

在不依赖于诸如RPMI(洛斯维帕克纪念研究所)1640、无血清的X-VIVO 15等培养基的情况下，本发明的树突细胞显示出优异的诱导免疫应答的潜力。

根据本发明的成熟组合物不仅能增强树突细胞诱导免疫应答的能力，而且 还能提高抗原特异性的免疫应答，同时降低非特异性的免疫应答。

根据本发明的另一方面，本发明提出了使用上述成熟组合物制备的树突细 胞，该树突细胞能够诱导抗原特异性的免疫应答。

根据本发明的又一方面，本发明提出了制备能够诱导抗原特异性的免疫应 答的树突细胞的方法，该方法包括：使用抗原使未成熟的树突细胞致敏；以及， 使用成熟因子处理经过致敏的树突细胞。

使用抗原的致敏和使用成熟因子的处理可以同时进行或顺序进行。例如， 细胞可以同时与抗原和成熟因子一起孵育。可选择的，可以在使用抗原进行致 敏之后1至30小时，再使用成熟因子处理该细胞。这是优选的方法。

尤其当利用溶链菌制剂和不同的成熟因子时，更优选以一定时间间隔来使 用该溶链菌制剂和不同的成熟因子。也就是说，可以使用选自白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、 前列腺素E2(PGE2)和聚肌胞中的至少一种处理细胞，然后细胞再与溶链菌 制剂(OK432)一起孵育。优选的，在使用抗原进行致敏的同时或之后1小时 之内，使用除了溶链菌制剂之外的成熟因子的组合进行处理。对于溶链菌制剂， 优选在使用抗原的进行致敏之后1小时，并且更优选的，在经抗原的致敏和经 其它成熟因子的处理之后且在收获树突细胞之前1至4小时，进行溶链菌制剂 的施用。

在使用除了溶链菌制剂之外的成熟因子处理之后的预定时间时使用溶链菌 制剂进行处理，这样能够使树突细胞降低非特异性的免疫应答，并且显示出最 大的抗原特异性的免疫应答。

成熟因子如上所述。

树突细胞是抗原提呈细胞，在免疫系统的细胞中，它们具有提呈抗原的最 大潜力。因此，树突细胞具有通过抗原摄取和抗原加工提呈至MHC I/II分子的 能力，其中，抗原的类型并不特别限制为大的重组蛋白或肽、癌裂解物、核糖 核酸、癌细胞的融合物，或凋亡或坏死的癌细胞。因此，树突细胞能够有益于 不受具体类型限制的抗原。本发明中可用的抗原的实例包括：但并不限于，AFP (α-胎甲球蛋白)、GPC-3(磷脂酰基醇蛋白聚糖-3)、PSA(前列腺特异性抗原)、 MAGE-1(黑素瘤相关的抗原1)、PSMA(前列腺特异性的膜抗原)、PAP(前 列腺酸性磷酸酶)和癌细胞系的裂解物，或癌组织。

通过以下实施例可以更好地理解本发明，以下实施例用于例示本发明，但 并不能理解为限制本发明。

<实施例和对比例>

如下表1中所示，制备实施例和对比例的成熟的树突细胞。

表1

实施例1：通过使用抗原和成熟因子同时处理进行树突细胞的制备

如表1中所述，制备实施例1的成熟的树突细胞。

(1)从外周血单核细胞(PBMC)向未成熟的树突细胞的分化(PBMC→ imDC)

使用Ficoll-Paque Plus(淋巴细胞分离液)(无内毒素级)，在一定温度下对 从健康人中提取的血液样品进行密度梯度离心，以分离外周血单核细胞 (PBMC)，其中去除了网状红细胞、粒细胞、血小板和血浆。

通过离心收获PBMC之后，将PBMC以预定浓度悬浮在RPMI 1640中并 且培养在培养箱中，该RPMI 1640中添加有从同一人中提取的血浆。当使用冷 冻的PBMC时，使PBMC融化，并在使用之前用HBSS和无血清的培养基进行 清洗。

为了从PBMC中分离单核细胞，可利用单核细胞贴附至细胞培养盘或细胞 培养板的塑料底部的特性。详细来讲，将悬浮在培养基中的PBMC在37℃培 养之后，将没有贴壁的细胞与培养基一起丢弃，从而获得贴壁细胞，该贴壁细 胞中单核细胞被选择性调节至总血液细胞的80％或更高。

使用添加有细胞因子鸡尾酒(在大肠杆菌(E.coli)中表达的人类重组蛋 白IL-4(细胞白介素-4，终浓度：500ng/mL或更小))和GM-CSF(JW CreaGene， 终浓度：100ng/mL或更小)的RPMI 1640，作为诱导单核细胞向树突细胞分 化的培养基。

(2)使用抗原使未成熟的树突细胞致敏

经过三天的孵育，收获从底部脱离下来的漂浮的细胞，计数，并且在抗原 存在的情况下以预定密度进行孵育。

对于癌症特异性的免疫应答，使用预定浓度的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关 的抗原(AFP、GPC-3或MAGE-1；5～10μg/mL，JW CreaGene)，或癌裂解物 (T98G肿瘤细胞系的裂解物；50～100μg/mL，内部的(in-house))处理细胞。

(3)未成熟的树突细胞的成熟(imDC→mDC)

与抗原进行致敏的同时进行使未成熟的树突细胞成熟(2)(图1B)。为了 成熟，将未成熟的树突细胞与TNF-α(肿瘤坏死因子-α；10ng/mL)、IL-1β(白 细胞介素-1β；10ng/mL)、IL-6(白细胞介素-6；10ng/mL)和PGE2(前列腺 素E2；1μg/mL)一起孵育。向该培养基中还添加了聚肌胞(终浓度10μg/mL)、 溶链菌制剂(药物，OK432，JW Pharmaceutical(JW制药)，终浓度1～2μg/mL) 和IFN-γ(LG Life Science(LG生命科学)，终浓度30～1000U/mL)，以通过Toll 样受体刺激未成熟的树突细胞。

在孵育的最后一天，收获漂浮的细胞，清洗两次，并且将漂浮细胞悬浮在 冻存培养基(含DMSO的人类血清白蛋白或人类血浆)中，以进行储备。

实施例2：通过时间滞后的使用溶链菌制剂(OK432)的处理进行树突细 胞的制备

除了在使用抗原(2)和除了溶链菌制剂之外的成熟因子(3)处理之后4 小时施用溶链菌制剂之外(图1A)，以与实施例1中相同的方式制备树突细胞。

实施例3：通过时间滞后的使用溶链菌制剂(OK432)的处理进行树突细 胞的制备

除了施用抗原(2)、除了溶链菌制剂之外的成熟因子(3)和溶链菌制剂 (OK432)的时间点进行如下控制之外(图1)，以与实施例1中相同的方式制 备树突细胞。

表2

对比例1至4：在没有使用抗原进行致敏或使用溶链菌制剂(OK432)处 理的情况下，树突细胞的制备

除了细胞不使用抗原(2)和/或溶链菌制剂处理之外，根据上面的表1中 所述的组成，以与实施例1中相同的方式制备树突细胞。

<实验实施例>

实验实施例1：在成熟过程中从树突细胞释放的细胞因子的测定

在实施例1-1(MAGE-1/OK+)和对比例1-1(MAGE-1/OK-)中的树突细 胞的成熟过程中，测量树突细胞的培养物中释放的IL-12和IL-10，并且结果示 于图2中。当从外周血中分离的T细胞与实施例1-1或对比例1-1的树突细胞 共培养时，评价T细胞的增殖和IFN-γ的水平，并且结果分别示于图3和图4 中。

详细来讲，根据制造商提供的说明书，使用ELISA，确定在抗原处理和成 熟过程中树突细胞培养物中的IL-12和IL-10的水平。结果示于图2中。

独立地评价T细胞的增殖。以1x10⁵个细胞/孔的密度，与1x10⁴个树突细 胞10:1的比率，接种使用尼龙毛(nylon wool)纯化的自身T细胞，并且一式 三份在96-孔板中培养5天。然后，进行MTT测定以测量活的T细胞。结果示 于图3中。

自身T细胞核树突细胞共培养5天之后，使用ELISA测量培养物中的IFN-γ 的水平。结果示于图4中。

实验实施例2：由溶链菌制剂(OK432)诱导非特异性T细胞

为了评价溶链菌制剂(OK432)对于非特异性T细胞诱导的效果，如下进 行对在实施例和对比例中制备的成熟的树突细胞(mDC)的实验。

如下，从外周血单核细胞(PBMC)中分离的自身T细胞与实施例1-2 (AFP/OK+)、对比例2(Un/OK+)、对比例3-2(AFP/OK-)和对比例4(Un/OK-) 的树突细胞一起孵育。在每一刺激的第1天，测量培养物中的IFN-γ的水平。 就这一点而言，使用尼龙毛，从用于制备树突细胞的同一人提取的外周血中纯 化T细胞。成熟的树突细胞和经纯化的T细胞以1:10(2x10⁵:2x10⁶)的比率混 合6～7天。在初始刺激之后收获T细胞，并且通过抗原致敏的树突细胞再次刺 激收获的T细胞，其中经抗原致敏的树突细胞与T细胞之间以相同的比率(1:10) 设置。每隔2～3天，培养基(RPMI 1640+10％AB血清)被替换为新鲜的培 养基，以维持适当的培养条件。在初始刺激时，以5ng/mL的浓度添加IL-7 (Peprotech(派普泰克公司))。自第二次刺激开始，使用100U/mL的IL-2 (Proleukin)处理细胞。经抗原致敏的DC刺激T细胞2～4次，以诱导CTL， 然后测定CTL的抗原特异性和活性。对与树突细胞共培养的T细胞进行刺激之 后的第二天，提取上清液样品并且使用ELISA定量分析上清液样品中的IFN-γ。 结果示于图5中。

此外，测定T细胞的抗原特异性的免疫应答，其中该T细胞是通过经GPC-3 抗原刺激的树突细胞活化的。为此，使用IFN-γELISPOT测定，评估经实施例 1-3(GPC-3/OK+)、对比例2(Un/OK+)、对比例3-3(GPC-3/OK-)和对比例 4(Un/OK-)的树突细胞诱导的CTL的抗原特异性。详细来讲，在溶链菌制剂 (OK432)存在或不存在的情况下与树突细胞共培养之后，对产生IFN-γ的细 胞进行计数。经活化的T细胞(1～2x 10⁴个细胞)和树突细胞(1～2x10³个细 胞)以10:1的比率在培养箱中共培养18～24小时，然后根据试剂盒中包含的说 明书进行ELISPOT分析。结果示于图6中。

另外，测量诱导的CTL的CTL活性和抗原特异性的T细胞应答。为此， 通过实施例1-2(AFP/OK+)、对比例2(Un/OK+)、对比例3-2(AFP/OK-) 和对比例4(Un/OK-)的树突细胞刺激的CTL与靶细胞反应，并且测量分泌到 培养基中的IFN-γ的水平。详细来讲，HepG2细胞(1x10⁴个细胞)与CTL(1x10⁵个细胞)以1:10的比率在培养箱中共培养18～24小时，然后提取上清液并且使 用ELISA定量分析上清液中的IFN-γ，其中发现该HepG2细胞的HLA类型与 CTL相匹配且表达抗原(AFP)。IFN-γ水平的测量示于图7中。

根据图7中的数据，理解到使用溶链菌制剂(OK432)处理树突细胞导致 潜在的抗原非特异性T细胞的诱导。

实验实施例3：溶链菌制剂(OK432)对树突细胞的成熟的效果

在抗原进行致敏之后的成熟过程中，使用溶链菌制剂(OK432)处理树突 细胞(DC)，该树突细胞(DC)与不经处理的树突细胞进行功能上的对比。就 这一点而言，使用AFP-或GPC-3刺激的实施例1-2(AFP/OK+)、对比例3-2 (AFP/OK-)、实施例1-3(GPC-3/OK+)和对比例3-3(GPC-3/OK-)的树突 细胞诱导CTL，并且分析该CTL的增殖和成熟效果。

详细来讲，当制备实施例1-2(AFP/OK+)和对比例3-2(AFP/OK-)的树 突细胞时，使用ELISA测量成熟过程中培养基中的IL-12和IL-10的水平，并 且结果示于图8中。

使用尼龙毛纯化的T细胞(1x10⁵个细胞)和实施例1-3(GPC-3/OK+)及 对比例3-3(GPC-3/OK-)的树突细胞(1x10⁴个细胞)以10:1的比率，一式三 份在96-孔板中共培养5天。之后，通过在经MTT染色之后对存活的细胞进行 计数，来检验细胞增殖，并且结果示于图9中。

此外，当从外周血细胞中分离的T细胞与实施例1-2(AFP/OK+)和对比 例3-2(AFP/OK-)的树突细胞共培养时，使用ELISA分析培养基中的IFN-γ 的水平，并且结果示于图10中。

进一步地，在每次使用实施例1-3(GPC-3/OK+)和对比例3-3(GPC-3/OK-) 的树突细胞刺激CTL之后，测量细胞增殖，并且结果示于图11中。在每次使 用树突细胞刺激T细胞的第1天，提取上清液，用于使用ELISA分析ELISA IFN-γ的水平，并且结果示于图12中。

如在各图中所示，溶链菌制剂(OK432)的处理提高了IL-12的水平，IL-12 对于Th1免疫应答的诱导很重要(图8：抗原AFP)；诱导了T细胞增殖(图9： 抗原GPC-3)；并且，增强了Th1免疫应答(图10：抗原AFP)。同样，发现使 用溶链菌制剂的处理使活化T细胞的增殖(图11，抗原GPC-3)和功能(IFN-γ) (图12：抗原GPC-3)得到改善。

实验实施例4：时间滞后的使用抗原和溶链菌制剂(OK432)的处理的效 果(RPMI 1640)

对实施例1-3和实施例2-3的树突细胞进行ELISPOT测定和细胞毒性测试 (CV)，其中实施例1-3和实施例2-3的树突细胞在经抗原GPC-3进行致敏之 后的不同时间经溶链菌制剂(OK432)诱导成熟。

在抗原和成熟因子处理的同时，使用溶链菌制剂(OK432)处理树突细胞 (实施例1-3，同时)；或者，在抗原和成熟因子处理之后4小时，使用溶链菌 制剂(OK432)处理树突细胞(实施例2-3，4h)。在培养箱中的IFN-γ捕获抗 体涂敷的平板中，通过使用树突细胞处理自身T细胞来诱导的CTL(1～5x10⁴ 个细胞)与未经溶链菌制剂(OK432)处理的树突细胞(1～5x10³个细胞)以 10:1的比率共培养18～20小时。按照ELISPOT试剂盒提供的操作指南进行后续 程序。也就是说，使用蒸馏水和清洗缓冲液清洗每一个孔，并且向孔中施加检 测抗体。然后，该抗体与接合酶的第二抗体反应1小时，之后与适当的底物发 生酶反应。在终止反应之后，反应混合物干燥过夜，并且使用ELISPOT读出器 (ImmunoSpot(免疫斑点))对斑点进行计数。结果示于图13中。

在与靶细胞反应之后，测量诱导的CTL的细胞毒性。将HLA类型与CTL 相匹配且表达抗原的细胞(HepG2)，HLA类型与CTL相匹配但不表达抗原的 细胞(Hep3B)，和HLA类型不与CTL相匹配也不表达抗原的细胞(SN12C) 用作杀伤测定的靶细胞。在CTL活性测试之前的一天，将靶细胞以1x10⁴个细 胞/孔的密度接种在96-孔平底板中。将活化的T细胞以预定比率添加到靶细胞 中，并将它们共培养18～24小时。在10％福尔马林中固定1小时之后，细胞经 0.4％结晶紫染色30min，然后向细胞中添加80％的甲醇。读出在570nm处的吸 光度，以评价细胞毒性。结果示于图14中。

可以看出，在抗原处理之后4小时使用溶链菌制剂(OK432)处理的组(实 施例2-3)中检测到比进行同时处理的组(实施例1-3)高的抗原特异性(图13)， 并且在时间滞后处(4小时)进行处理的组中还获得了较高的细胞毒性(图14)。

实验实施例5：时间滞后的使用抗原和溶链菌制剂(OK432)的处理的效 果

测定实施例3-1至实施例3-5的细胞的树突细胞的免疫力诱导和CTL的抗 原特异性免疫应答，其中实施例3-1至实施例3-5的细胞在经抗原AFP、GPC-3 或MAGE-1进行致敏之后的不同时间经溶链菌制剂(OK432)诱导成熟。

首先，将分离的自身T细胞以5x10⁶个细胞的总量悬浮在2mL的培养基中， 并且将CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)以5～25μM的终浓度添加 到细胞悬浮液中。而且，它们在培养箱中，在37℃孵育15min。在使用培养基 清洗两轮之后，对细胞进行计数，并且以1x10⁵个细胞/孔的密度添加细胞。细 胞与1x10⁴个树突细胞共培养5天。之后，细胞经荧光标记的抗CD3的抗体染 色，并且通过流式细胞术(FACS)分析以计算T细胞的分数(CD3⁺CFSE^lo)。 通过收集抗原AFP、GPC-3和MAGE-1的每一个结果，将结果示于图15中。

此外，分离的自身T细胞以10:1的比率与树突细胞混合并且培养5天，并 且使用ELISA测定细胞培养物的IFN-γ水平并以相对指数的形式重新计算。通 过收集抗原AFP、GPC-3和MAGE-1的每一个结果，将结果示于图16中。

经诱导的CTL以10:1的比率与对比例3的树突细胞反应18～20小时，并 且通过ELISPOT测定分析产生IFN-γ的细胞并以相对指数的形式重新计算。通 过收集抗原AFP、GPC-3和MAGE-1的每一个结果，将结果示于图17中。

如由数据所理解的，如通过IFN-γELISPOT测定等所证实的，在抗原进行 致敏之后4小时使用溶链菌制剂(OK432)处理的组在杀伤活性和抗原特异性 方面都是优异的。

除了增强树突细胞诱导免疫应答的能力之外，本发明的成熟组合物的组成 还能够提高抗原特异性的T细胞免疫应答，同时降低非特异性的免疫应答，从 而带来最好的免疫治疗效果。