模拟赭曲霉毒素A的抗原模拟表位及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及赭曲霉毒素A的抗原模拟表位，其氨基酸序列为DGFQLHTPFSAK。本发明OTA抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的OTA标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于OTA的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然OTA分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了OTA对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及赭曲霉毒素A抗原模拟表位及其应用。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)是一种常见的真菌毒素，是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢产物。研究表明OTA易蓄积于组织中，其作用的主要靶器官是肾脏、肝脏，属烈性的肾脏和肝脏毒素，实验表明动物摄入被这种毒素污染的饲料后，会发生急性或慢性中毒症。此外，据文献报导，OTA还具有致癌、致畸和致突变性。OTA的产毒菌株广泛地存在于自然界中，在各种农作物、食品、饲料和人类及动物的组织、血液中都能检测到OTA的污染。对OTA污染进行及时检测是预防和控制其危害的有效手段。

目前，检测食品中OTA的方法主要有高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱及免疫学检测等方法，免疫学检测方法以其灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势在OTA的检测中得到了广泛的应用。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必须使用OTA标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，OTA不仅价格昂贵而且具有极强的致癌性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。有鉴于此，人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。

本发明通过用噬菌体展示肽库技术，从肽库中筛选出能与靶分子（抗OTA单克隆抗体）特异性结合的多肽（抗原模拟表位），该抗原模拟表位具有与天然OTA分子相似的免疫反应特性，通过获得的OTA抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的OTA标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于OTA的免疫学检测。

发明内容

本发明以抗OTA单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行亲和淘选，获得了四种OTA的抗原模拟表位。它们的氨基酸序列如下：KLGFQLHQPSWP、FNLHQPIHNWPL、AQFFQLHSQAYS或DGFQLHTPFSAK。

本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，分别对应为：

AAGCTTGGGTTTCAGTTGCATCAGCCTAGTTGGCCG、TTTAATTTGCATCAGCCGATTCATAATTGGCCGCTG、GCTCAGTTTTTTTAGCTGCATTCGCAGGCGTATTCG、GATGGTTTTCAGTTGCATACTCCTTTTTCTGCTAAG

上述抗原模拟表位（多肽）结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，P代表脯氨酸残基，R代表精氨酸残基，K代表赖氨酸残基，H代表组氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，V代表缬氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，S代表丝氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，E代表谷氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基，G代表甘氨酸残基，L代表亮氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，W代表色氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，A代表丙氨酸残基，T代表苏氨酸残基。

本发明提及的OTA抗原模拟表位（多肽）可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有OTA抗原模拟表位（多肽）的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有OTA抗原模拟表位（多肽）的噬菌体粒子。化学合成是指依据OTA抗原模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码OTA抗原模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行OTA抗原模拟表位的大量制备。

本发明还涉及所述OTA抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。

本发明OTA抗原模拟表位（KLGFQLHQPSWP、FNLHQPIHNWPL、AQFFQLHSQAYS或DGFQLHTPFSAK）在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有OTA抗原模拟表位（多肽）的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将OTA抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替OTA标准品来进行免疫学检测分析。

还涉及OTA抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。

还涉及OTA抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。

前述OTA抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的OTA标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于OTA的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然OTA分子相似的免疫反应特性，效果非常好。

本发明的有益效果是：本发明OTA抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的OTA标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于OTA的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然OTA分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了OTA对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。

附图说明

图1 以OTA抗原模拟表位建立的间接竞争ELISA标准曲线。OTA抗原模拟表位Ph-1（KLGFQLHQPSWP）、Ph-7（FNLHQPIHNWPL）、Ph-18（AQFFQLHSQAYS）、Ph-5(DGFQLHTPFSAK)与抗OTA抗体的IC₅₀值分别为553，495，509 pg/ml和1.03 ng/ml。

具体实施方式

实施例1.  OTA抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定

1）OTA抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗OTA单克隆抗体，并以终浓度100 μg/mL 包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用TBST (50 mM NaCl, pH 7.5包含0.1% Tween-20 (v/v) ) 洗涤10次后，加入300 μl封闭液（3% BSA-PBS）4℃孵育2小时。2小时后弃封闭液，用TBST洗涤5次，每孔加入100 μl噬菌体肽库（噬菌体展示十二肽库，购自NEB公司，用TBS 10倍稀释噬菌体原液，约1.0×10¹¹ pfu），22-26℃振荡反应1小时。弃去未结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，结合上的噬菌体用0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2) 洗脱，并立即用15 μl 1 M Tris-HCl (pH 9.1) 中和。取10 μl洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20 mL生长至对数前期的E. coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。

在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗OTA单克隆抗体浓度分别为75 μg/mL和50 μg/mL，所用的TBST浓度为0.25%和0.5%，其余步骤同上。

2）阳性噬菌体克隆的鉴定： 从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法（Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay, I-ELISA）进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗OTA单克隆抗体，10 μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100 μl噬菌体斑扩增液（1.0×10¹¹ pfu），以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37 ℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μl，37 ℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，酶标仪（Thermo Scientific Multiskan FC）读取450 nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

3) OTA抗原模拟表位的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行OTA抗原模拟表位的鉴定，具体方法为：用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗OTA单克隆抗体，10 μg/mL包被酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入50 μl经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆（1.0×10¹¹ pfu）和50 μl OTA标准品（浓度范围为0-20 ng/ml），37℃孵育1小时；加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μl，37℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，读取OD₄₅₀，能结合抗OTA单克隆抗体，且能被OTA标准品所阻断的噬菌体，鉴定为OTA的抗原模拟表位。

实施例2.  OTA抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经过间接竞争ELISA鉴定展示有OTA抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800 μl含噬菌体上清转入一新离心管。加入200 μl PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100 μl碘化物缓冲液 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI)，加入250 μl无水乙醇沉淀DNA，离心后再用70%乙醇洗涤沉淀（DNA测序模板）。沉淀最终重悬于20 μl灭菌水，取2 μl进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5 μL噬菌体模板进行DNA测序，其-96 gIII 测序引物为：5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依据DNA测序结果及密码子表可获得OTA抗原模拟表位的氨基酸序列。它们的氨基酸序列如下：KLGFQLHQPSWP、FNLHQPIHNWPL、AQFFQLHSQAYS或DGFQLHTPFSAK。

实施例3.  OTA 抗原模拟表位作为竞争抗原在ELISA中的应用

 (1) 样品提取

称取5g 样品（谷物及其相关食品），加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1毫升滤液加入4毫升 PBS（磷酸盐缓冲液，pH=7.2）混匀后，即为样品提取液，待用。

（2）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗OTA单克隆抗体，10 μg/mL包被酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

（3）标准曲线的建立

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μl展示有OTA抗原模拟表位的噬菌体（1.0×10¹¹ pfu）和一系列不同浓度的50 μl OTA标准品，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以OTA浓度对数为横坐标，结合率（加入OTA的孔的OD₄₅₀/未加入OTA的孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好（图1）。如图1，以OTA抗原模拟表位建立的间接竞争ELISA标准曲线。OTA抗原模拟表位Ph-1（KLGFQLHQPSWP）、Ph-7（FNLHQPIHNWPL）、Ph-18（AQFFQLHSQAYS）、Ph-5(DGFQLHTPFSAK)与抗OTA抗体的IC50值分别为553，495，509 pg/ml和1.03 ng/ml。

（4）样品的检测

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μl展示有OTA抗原模拟表位的噬菌体（1.0×10¹¹ pfu）和待测样品提取液，37℃孵育1小时。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀，计算结合率，并根据标准曲线，倒推出样品中OTA的含量。

实施例4.  OTA 抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用

(1) 样品提取

称取5g 样品（谷物及其相关食品），加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1毫升滤液加入4毫升 PBS（磷酸盐缓冲液，pH=7.2）混匀后，即为样品提取液，待用。

（2）包被及封闭

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有OTA抗原模拟表位的噬菌体（2.0×10¹¹ pfu），100微升包被于酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。

（3）标准曲线的建立

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μl 抗OTA单克隆抗体（0.5 ng/ml）和一系列不同浓度的50 μl OTA标准品，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以OTA浓度对数为横坐标，结合率（加入OTA的孔的OD₄₅₀/未加入OTA的孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

（4）样品的检测

取出经步骤（2）处理好的板条，每孔分别投入50 μl 抗OTA单克隆抗体（0.5 ng/ml）和一系列不同浓度的50 μl OTA标准品，37℃孵育1小时。加入1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取OD₄₅₀。以OTA浓度对数为横坐标，结合率（加入OTA的孔的OD₄₅₀/未加入OTA的孔的OD₄₅₀×100%）为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

实施例5.  OTA 抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用

(1) 样品提取

称取5g 样品（谷物及其相关食品），加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液，200 rpm振荡5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后，取1毫升滤液加入4毫升 PBS（磷酸盐缓冲液，pH=7.2）混匀后，即为样品提取液，待用。

（2）噬菌体及控制线的点阵

用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有OTA抗原模拟表位的噬菌体（2.0×10¹¹ pfu），用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上（孔径0.2-0.45微米），作为检测线；将0.5 mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，用点阵仪或微量移液划线于同一张硝酸纤维素膜上（位于检测线的上方，距离大于5毫米），作为控制线。

（3）胶体金标记OTA抗体

将OTA抗体逐滴加入胶体金溶液（pH=8.2）中，边滴边搅拌，30分钟后，取1% PEG加入上述溶液中，继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的 10% BSA溶液，搅拌15分钟后，静置30分钟，离心后去上清，得到胶体金标记的OTA抗体溶液。

（4）胶体金检测卡的组装

将胶体金标记的OTA抗体点喷于胶金垫上（1.0 微克/毫升），将样品垫、胶金垫，点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装，切成试纸条，装入检测卡中待用。

（5）样品的检测

将样品提取液加入样品垫中，静置10分钟，若样品中含有OTA且超过胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域不显色，而控制线区域显色；若样品中不含有OTA且低于胶体金检测试纸的检测阈值，则检测线区域显色，控制线区域也显色。若控制线区域不显色，表明试纸条失效。

实施例6  OTA抗原模拟表位的大量制备

（1）以噬菌体扩增的方式

将展示有OTA抗原模拟表位的噬菌体加入至20 ml接种有ER 2738的培养物中，37 度220 rpm振荡培养4.5 h。将培养物转入另一离心管中，4 ℃ 10000 rpm离心10 min，将上清的上部80 %转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4 ℃下静置120 min。4℃ 10000 rpm离心PEG/NaCL静置溶液 15 min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL TBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。

（2）以OTA抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备

   A.  PCR扩增OTA抗原模拟表位的外源编码基因

PCR 反应体系： (50 μL)

              10 × Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)                                    5 μL

                            dNTP Mixture (each for 2.5 mM)                                 4 μL

                            M13KE insert extension primer (10 mM）                   1 μL

                            -96 gIII sequencing primer (10 mM)                            1 μL

                            噬菌体DNA模板                                                         1 μL

               Pyrobest DNA Polymerase                         0.5 μL

                            灭菌ddH2O                                                                 37.5 μL

PCR 反应条件：95℃ 5 min，接着 95℃ 30 sec， 55℃ 30 sec， 72℃ 40sec ， 72℃ 10 min共30 cycles

采用 PCR 产物回收试剂盒纯化 PCR 产物，微量核酸定量仪定量。本发明OTA抗原模拟表位的编码基因序列分别对应为：

AAGCTTGGGTTTCAGTTGCATCAGCCTAGTTGGCCG、TTTAATTTGCATCAGCCGATTCATAATTGGCCGCTG、GCTCAGTTTTTTTAGCTGCATTCGCAGGCGTATTCG、GATGGTTTTCAGTTGCATACTCCTTTTTCTGCTAAG

B. 外源编码基因及表达载体的双酶切

分别采用ACC65I和Eag I 酶对外源编码基因和表达载体（pMAl-pIII, NEB公司，可表达MBP融合蛋白）进行双酶切。

C. 酶切后产物的连接及转化

将质粒pMal-PIII 和目的片段以1∶10（摩尔比）混匀，于 16 ℃ 水浴连接 12 h, 取10 μL连接产物加至100 μL感受态细胞TB1中，充分混匀。冰浴30 min后，42 ℃ 水浴热激90 s，立即冰浴5 min后补加600 μL LB液体培养液，37 ℃，200 rpm培养1 h，10000 rpm离心2 min，吸去上清留取约200 μL，涂布于LB-A固体（Ampr）培养基中，37 ℃过夜培养，得到阳性克隆。

OTA抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达                                                                                     

将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37℃，220 r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1 %接种量（v/v）接种于50 mL的LB-A，0.2 %蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37℃，220 r/min振荡培养，当培养物细菌浓度OD600达到0.6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，220 r/min振荡培养，将诱导物（PEG溶液）于4 ℃，4000 g，离心20 min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400 mL 30 mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g细胞湿重)，加入EDTA至1 mM，室温下震荡5-10 min，8000 g，4℃，离心20 min，弃上清，沉淀重悬于400 ml预冷的5 mM MgSO4，冰上震荡10 min，8000 g，4℃，离心20 min，保留上清，向上清液中加入8 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.4，获得OTA抗原模拟表位-MBP融合蛋白。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南昌大学

 

<120>  模拟赭曲霉毒素A的抗原模拟表位及其应用

 

<130>  1

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Lys Leu Gly Phe Gln Leu His Gln Pro Ser Trp Pro

1               5                   10         

 

 

<210>  2

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 

Phe Asn Leu His Gln Pro Ile His Asn Trp Pro Leu

1               5                   10         

 

 

<210>  3

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  3

 

Ala Gln Phe Phe Gln Leu His Ser Gln Ala Tyr Ser

1               5                   10         

 

 

<210>  4

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  4

 

Asp Gly Phe Gln Leu His Thr Pro Phe Ser Ala Lys

1               5                   10         

 

 

<210>  5

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

aagcttgggt ttcagttgca tcagcctagt tggccg                               36

 

 

<210>  6

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

tttaatttgc atcagccgat tcataattgg ccgctg                               36

 

 

<210>  7

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gctcagtttt tttagctgca ttcgcaggcg tattcg                               36

 

 

<210>  8

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

gatggttttc agttgcatac tcctttttct gctaag                               36