一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用

摘要

本发明公开了一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用。本发明提供了一种油菜抗菌肽BnCRP1，其序列为SEQ ID NO.2所示。通过overlap PCR方法完成该基因的人工合成，将合成的抗菌肽基因克隆到pET30a/His-EDDIE-GFP表达载体上并转化到大肠杆菌中进行体外表达，获得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽产物。抑菌活性检测结果表明抗菌肽BnCRP1对细菌和真菌都具有较强的抑菌活性。离体叶片涂抹接菌实验证实 BnCRP1 能够显著增强植物对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。BnCRP1能够作为生防制剂用于菌核病的防治中，也可以作为抗性标记用于油菜抗病品种的选育。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和生物技术领域。具体涉及一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用。

背景技术

病原菌可引起包括人类，牲畜，作物和其他生物的严重病害，造成严重的经济损失。植 物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80％以上的植物病害(张福丽，王占斌，王志英. 几丁质酶在植物抗真菌病害中的作用.林业科技.2006，31(3)：24-27)，造成世界粮食作物减 产约20％(Knight S.C.,Anthony V.M.,Brady A.M.,et al.Rationale and perspectives o n the developmentof fungicides.Annu Rev Phytopathol,1997,35:349-372)。许多重要植 物病害都是真菌造成的，如马铃薯晚疫病、稻瘟病、小麦白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰 斑病、油菜菌核病等，每年都造成非常巨大的经济损失。另一方面，真菌在侵染植物的过程 中，释放出来的代谢产物——真菌毒素(mycotoxin)，对农作物以及人类的健康也造成极大的 危害，如黄曲霉毒素(aflatoxin)等。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘菌科、核 盘菌属。是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盘菌可以广泛地侵染很多 单子叶和双子叶植物。核盘菌引起的菌核病是一种类似于灰霉的腐生营养型真菌，这种破坏 性病源侵染超过400种植物，分布广泛。目前对菌核病的防治主要依靠化学农药，然而化学 防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想；同时，食品的安全性也受到严重影响。油 菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，茎和角果的腐烂，导致了巨大的产 量损失。尽管菌核病严重威胁了农业生产，植物对核盘菌的寄主抗性的分子机制，我们依然 知之甚少。暨今为止还没有发现完全免疫或者高抗的油菜栽培品种(Liu,S.,Wang,H.,Zha ng,J.,Fitt,B.D.,Xu,Z.,Evans,N.,Liu,Y.,Yang,W.,and Guo,X.2005.In vitro mu tation and selection of doubled-haploid Brassica napus lines with improved resistance to S clerotinia sclerotiorum.Plant Cell Rep.24:133-144),因此，探究植物对这种病源的抗性机 制，发现新的抗性基因具有深远意义。

目前常用的病害防治措施，主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境， 而且防效也不理想；同时，食品的安全性也会受到严重影响。随着社会的进步，人们越来越 深刻地认识到长期大量使用化学农药对生态环境和人类健康的危害。生物防治可以有效地克 服这些弊端,因而生物农药越来越受到人们的重视。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有抗菌活性的天然小分子蛋白，广泛 存在于生物界，是机体非特异性免疫的重要组成部分，在体内体外均具有抗菌活性(Gordo n YJ,Romanowski EG,A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential  as Anti-Infective Drugs.Curr Eye Res.2005,30(7):505–515)。抗菌肽的广泛的生物学活性， 对细菌真菌、原生动物、病毒和肿瘤等有很强的抑制作用，具有高效、环保、不使病原菌产 生耐药性等优点使它在生物防治和医学上具有良好的应用前景(Gordon YJ,Romanowski E G,A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Dr ugs.Curr Eye Res.2005,30(7):505–515)。近年来已经成为植物抗病基因工程、养殖饲料 添加剂，食品防腐剂、新兴医药等领域的研究热点，在疾病防治领域中是抗生素的理想替代 品(Boman HG，Peptide antibiotics and their role in innateimmunity.Annu Rev Immuno1.1 995，13：6l-92)。在农业生产过程中，用抗菌肽进行植保工作可以避免农用抗生素通过食 物链的传递对人体产生的威胁。

按照氨基酸序列及二级结构，已发现的植物抗菌肽可以分为植物防御素(plant defensins)、 转脂蛋白(1ipidtransfer proteins，LTPs)，硫素(thionins)，蜕皮素(snakins)，橡胶蛋白类(hevei n-like)，打结素类(knottin-like peptides)，凤仙花素(IbAMP)，和新近发现的荠菜素(sheph erdins)、环肽(cyclotides)等(Hancock REW,Chapple DS，Peptide Antibiotics.Antimicrob Ag ent Chemother，l999，43(6)：l3l7-l323)。抗菌肽基本上都具有一些共性，如：小分子量(< 10KDa),阳离子表面、正电荷以及两亲性，这些特性使得抗菌肽能够和细胞膜绑定并能够插 入到细胞内部，大部分抗菌肽是通过破坏细胞膜从而使目标细胞死亡而达到杀菌目的。而另 一些抗菌肽却能够通过细胞膜上的离子通道进入到细胞内部破坏细胞而不破坏细胞膜(Vog el PMHaHJ:Structure–function relationships of antimicrobial peptides.Biochem Cell Biol 1 998,76:235-246.)。大多数类型的植物源抗菌肽对动物和植物细胞都没有毒性(Murad AM. Pelegrini PB.Neto SM.Novel Findings of Defensins and their Utilization in Construction o f Transgenic Plants.Transgenic Plant Journal 2001(1):39-48)。与动物源抗菌肽相比，植物 源抗菌肽更易于在作物中表达和调控，不容易被细胞内的蛋白酶降解。与其他杀菌剂相比， 植物来源的抗菌肽对环境的影响更小，更友好，更具开发成为抗真菌生物制剂的潜力(Han cock REW,Chapple DS，Peptide Antibiotics.Antimicrob Agent Chemother，l999，43(6):l 3l7-l323)。如将Rs-AFPs等植物抗菌肽基因导入微生物中进行发酵，更容易克服对宿主的毒 性作用而进行大量生产。

抗菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的小分子肽,它能被细菌、真菌 或物理的、化学的刺激所诱导,甚至有些抗菌肽在植物体内能形成组成性的表达。它不仅能 抗多种细菌,而且可以抑杀真菌、病毒等,可用于转化农作物、培养抗病品种,因而在植物 育种基因工程领域中具有广阔的应用前景。首先在模式植物烟草与马铃薯抗青枯病研究中获 得成功,随后在水稻白叶枯病菌和细条病菌苹果的梨火疫病,菊花、辣椒、茄子等作物的细 菌、真菌病研究中均取得了一定效果。将萝卜抗菌肽基因(AFP)转基因到马铃薯中可获得晚 疫病抗性等(任玉霞,陈凌娜,陈继峰,陈正华,马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及抗晚疫 病的初步鉴定,中国蔬菜2012(6):68-73)。

植物源抗菌肽都有广谱抗真菌或细菌活性，在一种植物中发现的抗菌肽可以有效的应用 到其他多种植物中，如萝卜中来源的抗菌肽能够通过转基因的方法转到野罂粟、马铃薯和小 麦中分别达到抗马铃薯晚疫病和小麦镰刀菌的效果(魏玉杰,张梅秀,常瑛,雒淑珍,陈凌娜， 野罂粟花粉介导法转萝卜抗菌肽基因方法研究，甘肃农业科技2009(11)：6-9；任玉霞，陈 凌娜，陈继峰，陈正华,马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及抗晚疫病的初步鉴定,中国 蔬菜2012(6):68-73；Zhao Li，Miaoping Zhou，Zengyan，ZhangLi，juan Ren，Lipu Du，Boqiao Zhang，Huijun Xu，Zhiyong Xin，Expression of a radish defensin in tra nsgenic wheat confers increased resistance to Fusarium graminearum and Rhizoctonia cerea lis Funct Integr Genomics 2011,11:63–70)。抗菌肽作为新兴抗病基因资源，对改良水稻、 大豆、棉花、油菜等作物对真菌病害的抗性有着重要意义。

抗菌肽因其独特的抗菌机理，广谱的抗菌性以及不易产生耐药性等特点，在各行各业中 都有良好的应用前景，因此也已经受到越来多的关注，成为前沿领域的研究热点(Hancock  REW,Chapple DS，Peptide Antibiotics.Antimicrob Agent Chemother，l999，43(6)：l3l7-l 323)。但是，目前植物来源的抗菌肽还很难真正应用到农业生产实践中。主要是因为目前鉴 定的有功能的植物来源抗菌肽数量很少，从而在很大程度上限制了植物抗菌肽的应用。抗菌 肽数据库中经过验证的抗菌肽基因目前达到1600多个，而植物抗菌肽仅有不到300个(htt p://ercbinfo1.ucd.ie/APPDb/)。被鉴定的植物来源抗菌肽基因数量少的主要原因如下：1、抗 菌肽基因相对比较小，容易降解，且含量低，难以检测和鉴定；2、抗菌肽分子量小，分离 纯化困难，提取步骤烦琐、得率低；3、体外表达纯化困难，导致难以开展体外抑菌活性检 测来验证功能；4、缺乏高效的预测筛选方法；5、抗菌肽化学合成成本高，价格昂贵。如何 高效的预测具有功能的新植物抗菌肽，实现其水平表达并降低成本成为目前抗菌肽研究与应 用的瓶颈。

由本发明申请人中国农业科学院油料作物研究所负责、中国农科院蔬菜所、深圳华大基 因研究院、华中农业大学、湖南大学、西南农业大学、江苏农科院、四川农科院、青海大学， 并吸收英、澳、美、法等国相关研究机构科研人员合作完成了甘蓝和油菜的全基因组测序和 分析，甘蓝和油菜基因组部分结果论文已发表(Shengyi Liu,Yumei Liu,Xinhua Yang,Ch aobo Tong,David Edwards,Isobel A.P.Parkin,Meixia Zhao,Jianxin Ma,Jingyin Yu,Shu nmou Huang,Xiyin Wang,Junyi Wang,Kun Lu,Zhiyuan Fang,Ian Bancroft,Tae-Jin Yan g,Qiong Hu,XinfaWang,Zhen Yue,Haojie Li,Linfeng Yang,Jian Wu,Qing Zhou,Wa nxin Wang,Graham J.King,J.Chris Pires,Changxin Lu,ZhangyanWu,Perumal Sampath, ZhuoWang,Hui Guo,Shengkai Pan,Limei Yang,Jiumeng Min,Dong Zhang,Dianchuan J in,Wanshun Li,Harry Belcram,Jinxing Tu,Mei Guan,Cunkou Qi18,Dezhi Du1,Jiana Li, Liangcai Jiang,Jacqueline Batley,Andrew G.Sharpe,Beom-Seok Park,Pradeep Ruperao, Feng Cheng,Nomar Espinosa Waminal Yin Huang,Caihua Dong,LiWang,Jingping Li,Z hiyong Hu,Mu Zhuang,Yi Huang,Junyan Huang,Jiaqin Shi,Desheng Mei,Jing Liu,T ae-Ho Lee,Jinpeng Wang,Huizhe Jin,Zaiyun Li,Xun Li,Jiefu Zhang,Lu Xiao,Yongmi ng Zhou,Zhongsong Liu,Xuequn Liu,Rui Qin,Xu Tang,Wenbin Liu,YupengWang,Yang yong Zhang,Jonghoon Lee,Hyun Hee Kim,France Denoeud,Xun Xu,Xinming Liang, Wei Hua,Xiaowu Wang,Jun Wang,Boulos Chalhoub&Andrew H.Paterson.The Bras sica oleracea genome reveals the asymmetrical evolution of polyploid genomes.2014.Natu re Communication.5:3930.；Chalhoub B,Denoeud F,Liu S,Parkin IA,Tang H5,Wang  X,Chiquet J,etc.Plant genetics.Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassic  a napus oilseed genome.Science.2014,22；345(6199):950-3.)。白菜、甘蓝以及甘蓝型油菜全 基因组测序信息已经建立可供申请人查询的数据库http://www.ocri-genomicls.org/bolbase(C heng F,Liu S,Wu J,Fang L,Sun S,Liu B,Li P,Hua W,Wang X:BRAD.the genetic s and genomics database for brassica plants.BMC Plant Biol,2011,11:136；Jingyin Yu, Meixia Zhao,Xiaowu Wang,Chaobo Tong,Shunmou Huang,Sadia Tehrim,Yumei Liu,We i Hua and Shengyi Liu.Bolbase:a comprehensive genomics database for Brassica oleracea. BMC Genomics,2013,14:664)。通过使用生物信息学分析手段，利用上述资源，可进行 基因的预测和分析，获得大批量的与已知抗菌肽有类似序列结构特征的预选基因，从中筛选 感兴趣的基因，是快速发掘基因的一个捷径。而抗菌肽本身基因长度小，可以利用PCR人 工合成技术，低成本快速合成，不需要cDNA序列做模板进行克隆等工作，可以大大加快 获得抗菌肽的速度并且降低研究难度。

申请人利用甘蓝型油菜组织转录组测序数据，开发出一个预测分析潜在新抗菌肽基因的 方法，获得抗菌肽新基因BnCRP1。该基因是一个新型的富含半胱氨酸类抗菌肽，因此命名 为CRP(cystin rich protein)。它具有9个保守的半胱氨酸，氨基酸长度超过30。实验表明 它既有抗细菌活性也具有抗真菌活性。结合基因工程方法和利用一个新型具有自剪切功能的 抗菌肽体外表达载体pET30a/His-EDDIE-GFP(Tao Ke,Su Liang,Jin Huang,Han Mao,J ibao Chen,Caihua Dong,Junyan Huang,Shengyi Liu,Jianxiong Kang,Dongqi Liu,Xiangd ong Ma,A novel PCR-based method for high throughput prokaryotic expression of antimi crobial peptide genes.BMC Biotechnol 2012,12:10.)，本研究实现了BnCRP1在大肠杆菌 中的融合表达、复性、自剪切和纯化，获得了具有生物活性的BnCRP1蛋白产物。用管碟 法(蒋惠岚.管碟法测定抗生素效价的影响因素及控制方法.中国兽药杂志.2011,(08)23-36)， 以大肠杆菌、藤黄八叠球菌为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的标准菌株，以酵母菌作为真菌 的指示菌对纯化的BnCRP1蛋白开展抑菌活性检测，发现BnCRP1基因能有效抑制细菌(大 肠杆菌和藤黄八叠球菌)和真菌(酵母、核盘菌)的生长。本研究为利用生物信息手段和基 因工程技术大规模鉴定新植物来源抗菌肽奠定了基础，提供了一种新的途径。此外BnCRP 1可作为生物试剂喷施于植物表面提高植物对真菌病害的抗性，同时，还可以作为一个新分 子标记用于辅助抗病育种，还可以作为一个新基因源用于植物基因工程，以培育抗病转基因 植物。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一个具有对真菌和细菌抑菌活性的油菜抗菌肽BnCRP1， 其序列为SEQ ID NO.2所示。该抗菌肽长度为33个氨基酸，其中半胱氨酸为9个，该抗 菌肽可以增强植物对腐生营养型真菌核盘菌的抗性。

本发明的另一个目的在于提供了油菜抗菌肽BnCRP1对应的核苷酸序列，优选序列为 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还有一个目的在于提供了油菜抗菌肽BnCRP1基因的合成方法，方法简单。利 用DNAWorks软件工具，通过密码子优化设计引物序列，采用Overlap-PCR技术合成BnCR  P1基因序列。

本发明的再一个目的是在于提供了油菜抗菌肽BnCRP1的制备方法，采用猪瘟病毒蛋 白突变体EDDIE为融合蛋白；在包涵体蛋白纯化、复性后，EDDIE重新正确折叠，恢复其 自剪切能力，在特异位点Cys168和169处把C端融合的抗菌肽剪切下来，从而获得不增加 任何多余氨基酸的抗菌肽产物。

本发明的最后一个目的在于提供了油菜抗菌肽BnCRP1在制备抗菌药物中的应用，该 抗菌肽可以增强植物对腐生营养型真菌核盘菌的抗性，可同时对藤黄八叠球菌，大肠杆菌， 酵母菌，核盘菌产生抑菌效果，还可以应用于生物防治和抗病育种。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

为了获得本发明，申请人对油菜(甘蓝型油菜Brassica napus)基因组中抗菌核病的相 关基因以及现有的抗菌肽数据库进行了深入全面的分析比对和预测，结果发现了一个新的富 含半胱氨酸类抗菌肽基因，通过对该基因的体外合成和诱导表达、蛋白纯化后进行了活性分 析，发现该基因不仅具有抗细菌活性还具有抗真菌活性。本发明开发了一个增强植物对真菌 抗性的BnCRP1基因，BnCRP1基因表达的抗菌肽在抑菌活性试验中不仅具有抗细菌活性还有 抗真菌活性(包括酵母、核盘菌)，预示着该基因在油菜抗菌核病育种中具有相当的应用前 景。

油菜抗菌肽基因BnCRP1的获得：

目前申请人实验室已开展了油菜叶片，角果的表达谱测序，获得大量ESTs数据信息。 同时通过白菜、甘蓝和油菜和全基因组测序项目，构建了它们的基因组序列信息库(http://www.ocri-genomicls.org/bolbase)。利用这些序列信息与专门的抗菌肽数据库，如ANTIMIC (Brahmachary M,Krishnan SPT,Koh JLY,et al.ANTIMIC:a database of antimicrobial  sequences.Nucleic Acids Research,2004,32:D586-D589，以下相同)，APD(Wang Z, Wang GS.APD:the Antimicrobial Peptide Database.Nucleic Acids Research,2004,32:D 590-D592，以下相同)APPDB(http://ercbinfo1.ucd.ie/APPDb/，以下相同)，PhytAMP(H ammami R,Hamida JB,Vergoten G,et al.Phytamp:a database dedicated to plant antimic  robial peptides.Nucleic Acids Res.2009,37:D963-D968，以下相同)等进行BLAST比对 (核苷酸相似度>90％即Identity>90％)，获得大批量的与已知抗菌肽序列有类似结构特征的 预选基因。随后对这些预选基因的蛋白序列(Vector NTI10)和二级结构结构(nnpredict:ht tp://www.cmpharm.ucsf.edu/nomi/nnpredict predictionprotein，以下相同)进行预测和分析， 从而建立蛋白质三维结构图，利用二级结构和功能对所筛选出的抗菌肽进行蛋白质家族的分 类建库，从而最终获得潜在的新抗菌肽基因。编号为Bn52760D，命名为BnCRP1。基因Bn CRP1核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，抗菌肽BnCRP1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。 一种体外合成油菜BnCRP1基因的制备方法，步骤如下：

油菜BnCRP1基因的密码子优化与体外合成

根据BnCRP1基因的DNA序列，设计引物序列，共合成引物6条覆盖BnCRP1全长的 引物，分别为BnPEV52760D_1，BnPEV52760D_2，BnPEV52760D_3，BnPEV52760D_4，b ackboneF和backboneR。引物序列如表1所示，

表1 overlap PCR引物序列

采用Overlap-PCR技术获得BnCRP1基因全长。PCR反应体系如下：总的反应体系为5 0μL，内含:10×Taq buffer(含MgCl ₂)10μl，1.5mmol/L dNTP(10 mmol/L)4μl，引物b ackboneF1和backboneR各加入1μl(浓度为10 mmol/L)，引物BnPEV52760D_1，BnPE V52760D_2，BnPEV52760D_3和BnPEV52760D_4各加入1μl(浓度为2mmol/L)，Taq (5 U/μl)1μl，ddH₂O 33μl。反应条件为94℃5分钟，94℃1分钟，58℃1分钟，72℃ 2分钟30秒，25个循环，72℃后延伸10分钟，扩增大小为122 bp(包括102bp的SEQ I D NO.1所示的目的基因序列及和载体上匹配的各10个碱基)。

PCR产物经鉴定测序，测序正确的即为优化后的抗菌肽BnCRP1基因，其序列为SEQ  ID NO.1所示。

抗菌肽BnCRP1的制备方法，包括以下步骤：

1)融合表达载体EDDIE-BnCRP1的构建

采用反向PCR技术，将BnCRP1基因连接到表达载体pET30a/His-EDDIE-GFP上。具体为 利用30abackbone-F:TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和30abackbone-R:GCAGCT GGTCACCCACAGCG引物，通过反向PCR扩增，将pET30a/His-EDDIE-GFP载体线性化。 将回收到的pET30a/His-EDDIE-GFP线性化载体片段与通过Overlap-PCR扩增回收得到的Bn CRP1全长DNA片段，同时转化大肠杆菌XL10-Gold菌株，通过体内定点同源重组，将BnCR P1基因连接到表达载体pET30a/His-EDDIE-GFP上，获得目的基因融合表达载体EDDIE-BnC RP1。

2)抗菌肽BnCRP1体外诱导表达与分离纯化

将测序正确融合表达载体EDDIE-BnCRP1质粒，用热激法转化到BL21(DE3)感受态细胞 中，获得EDDIE-BnCRP1融合表达工程菌BL21(DE3)/pETNB。利用常规方式在LB液体培养 基中培养并诱导蛋白表达，获得的菌体破碎离心，上清纯化后，即得目的蛋白抗菌肽BnCR P1，其序列为SEQ ID NO.2所示。

油菜抗菌肽BnCRP1在制备抗菌药物中的应用，包括将该抗菌肽直接制备成抗菌药物， 对细菌和真菌都具有较强的抑菌活性；将其喷施在植物叶片表面，可增强植物的抗菌性，特 别是提高植物对核盘菌这种真菌病害的抗性，将BnCRP1基因利用分子生物学的手段在油菜 或其他植物中过表达，制备可抗真菌和细菌的转基因植物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明利用白菜、甘蓝和油菜和全基因组测序和转录组测序数据的序列信息与专门 的抗菌肽数据库进行比对和预测分类分析，成功获得一个新的富含半胱氨酸类抗菌肽BnCR P1。为利用生物信息学手段和基因工程技术大规模鉴定新植物源抗菌肽奠定了基础，提供 了一种新的途径。

2.利用Overlap-PCR技术在体外人工合成该基因，大大降低了获得BnCRP1的技术难 度和成本。

3.为解决抗菌肽异源表达的诸多问题，本发明采用了一种新的融合表达抗菌肽的方法， 采用猪瘟病毒蛋白突变体EDDIE为融合蛋白，以包涵体形式在大肠杆菌BL21中高效表达 抗菌肽，以减少抗菌肽对宿主的毒性作用。在包涵体蛋白纯化、复性后，EDDIE重新正确 折叠，恢复其自剪切能力，在特异位点Cys168和169处把C端融合的抗菌肽剪切下来，从 而获得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽产物。该方法不需要添加任何化学物质和酶来去掉融 合标签，对宿主无毒性，纯化过程简单，剪切后可直接用来检测对病原菌的抗菌活性，最高 目标产量可以达到12g/L。

4.管碟法和叶片表面喷施接种试验结果均表明原核表达纯化的抗菌肽BnCRP1可以有 效抑制细菌和真菌以及植物病原真菌核盘菌的生长，可有效提高植物对它们的抗性。

5.由于BnCRP1基因来源于油菜，它还可以作为抗性标记用于油菜抗病品种的选育， 或者作为基因工程的候选基因用于转基因育种。

附图说明

图1为表达载体pET30a/His-EDDIE-GFP模式图。

图2油菜抗菌肽BnCRP1三维结构模拟图。

图3为EDDIE-BnCRP1载体构建琼脂糖凝胶电泳检测图。

图3中A:overlap PCR合成BnCRP1基因的琼脂糖凝胶检测；M:100 bp DNA Marker；1- 2:Overlap PCR合成BnCRP1基因；

图3中B：表达载体EDDIE-BnCRP1电泳检测；M：1 kb DNA Marker；1：重组载体pET 30a-EDDIE-BnP；2：空载体pET30a/His-EDDIE-GFP；

图3中C:BnCRP1基因PCR检测；M:DL2000 DNA Marker；1：阳性对照；2：阴性对 照；3-4：BnCRP1重组子。

图4 BnCRP1蛋白的表达纯化SDS-PAGE电泳检测。

图4中A:融合蛋白EDDIE-BnCRP1诱导表达的SDS-PAGE分析；M:小分子量蛋白Mar ker；0：对照菌沉淀，1-6:EDDIE-BnLTP1沉淀。

图4中B：EDDIE-BnCRP1复性后SDS-PAGE电泳分析；M：小分子量蛋白Marker；1,2： EDDIE-BnCRP1复性后8小时SDS-PAGE分析。

图5:BnCRP1抗菌肽对细菌和真菌的抑菌活性分析；

A：酵母菌:毕赤酵母GS115；B：藤黄八叠球菌；C：大肠杆菌；D:核盘菌。

图6 BnCRP1抗菌肽拟南芥离体叶涂抹后接种核盘菌抑菌作用图。

第一排：经过抗菌肽BnCRP1涂抹的拟南芥叶片；

第二排：未经处理的正常拟南芥叶片作为对照。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明， 而不是对本发明的限制。本发明所用试剂如未特别说明，均来源于商业渠道，所述技术方案， 如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

油菜抗菌肽基因BnCRP1的预测和结构分析

利用发明人实验室构建的白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的基因组和转录组序列信息数据库(http://www.ocri-genomicls.org/bolbase)与专门的抗菌肽数据库，如ANTIMIC(前面已述)， APD(前面已述)，APPDB(前面已述)，PhytAMP(前面已述)等进行BLAST比对(核 苷酸相似度>90％即Identity>90％)，获得大批量的与已知抗菌肽序列有类似结构特征的预选 基因。随后对这些预选基因的蛋白序列(Vector NTI10)和二级结构结构(前面已述)进行 预测和分析，从而建立蛋白质三维结构图，利用二级结构和功能对所筛选出的抗菌肽进行蛋 白质家族的分类建库，从而最终获得编号为EV52760D.1的新抗菌肽基因。命名为BnCRP1。 BnCRP1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，抗菌肽BnCRP1的氨基酸序列为SEQ ID  NO.2所示。

BnCRP1抗菌肽含有33个氨基酸，其中半胱氨酸含量超过27％，是一种新型的半胱氨酸 富集类抗菌肽(Cystin rich protein CRPs)。与同样富含半胱氨酸的蜕皮素不同，这是一种 少有报道的新类型的抗菌肽，在蜕皮素中具有12个半胱氨酸保守序列且氨基酸长度大于60。 (Padovan L,Scocchi M,Tossi A.Structural aspects of plant antimicrobial peptides,Curr  Protein Pept Sci.2010,11(3):210-9；Bindschedler LV1,Whitelegge JP,Millar DJ,Bolwel l GP，A two component chitin-binding protein from French bean--association of a prolin e-rich protein with a cysteine-rich polypeptide.FEBS Lett.2006，6；580(6):1541-6.Epub 20 06 Feb 2)。蛋白结构预测(前面已述)显示BnCRP1的二级结构中有大量的二硫键存在， 主要形成螺旋结构，整个多肽由50％的α螺旋和50％的无规卷曲组成。这种蛋白结构决定了 它所发生的抗细菌和抗真菌的作用模式为通过破坏细胞膜的机制来达到抑菌的作用(Balaji  Ramanathan EGD,Christopher R.Ross,Frank Blecha:Cathelicidins:microbicidal activity, mechanisms of action,and roles in innate immunity.Microbes and Infection 2002,4:361-3 72.)。蛋白三维结构预测的结果也支持了上述结果，从N端形成一个大的α螺旋，其余部分 形成无规卷曲的结构(图2)。

实施例2：

油菜BnCRP1基因的密码子优化与体外合成

由于抗菌肽在生物体内存在时间短，难以捕捉，用常规的PCR技术很难从油菜cDNA 中扩增，而将整个抗菌肽全部人工合成则价格昂贵。为了降低获得抗菌肽的成本，本发明根 据根据BnCRP1基因的DNA序列，利用DNAWorks软件工具(http://mcl1.ncifcrf.gov/dnawo rks/，Hu F,Ke T,Li X,Mao PH,Jin X,Hui FL,Ma XD,Ma LX.Expression and Purif ication of an Antimicrobial Peptide by fusion with elastin-like polypeptides in Escherichia coli.Appl Biochem Biotechnol.2010,160(8):2377-87)，通过密码子优化(Ke T,Liang S, Huang J,Mao H,Chen J,Dong C,Liu S,Kang J,Liu D,Ma X:A novel PCR-based m ethod for high throughput prokaryotic expression of antimicrobial peptide genes.BMC Biot echnol 2012,12:10.)设计引物序列，共合成引物6条覆盖BnCRP1全长的引物(上海英俊 公司合成引物)，分别为BnPEV52760D_1，BnPEV52760D_2，BnPEV52760D_3，BnPEV52 760D_4，backboneF和backboneR。引物序列如表1所示，黑体部分表示与载体pET30a/Hi s-EDDIE-GFP(载体为本实验室参照柯涛文献构建而成，Ke T,Liang S,Huang J,Mao H, Chen J,Dong C,Liu S,Kang J,Liu D,Ma X:A novel PCR-based method for high thr oughput prokaryotic expression of antimicrobial peptide genes.BMC Biotechnol 2012,12:1 0.)同源的部分，其余为基因特异性引物。采用Overlap-PCR技术(Zhu D,Zhong X,Ta n R,Chen L,Huang G,Li J,Sun X,Xu L,Chen J,Ou Y,Zhang T,Yuan D,Zhang Z, Shu W,Ma L:High-throughput cloning ofhuman liver complete open reading frames usin g homologousrecombination in Escherichia coli.Anal Biochem 2010,397(2):162-167)获得 BnCRP1基因全长。

PCR反应体系如下：总的反应体系为50μL，内含:10×Taq buffer(含MgCl ₂)10μl，1. 5mmol/L dNTP(10 mmol/L)4μl，引物backboneF1和backboneR各加入1μl(浓度为1 0mmol/L)，引物BnPEV52760D_1，BnPEV52760D_2，BnPEV52760D_3和BnPEV52760 D_4各加入1μl(浓度为2mmol/L)，Taq(5U/μl)1μl，ddH₂O 33μl。反应条件为94℃ 5分钟，94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2分钟30秒，25个循环，72℃后延伸10分钟， 扩增大小为122bp(图3)。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒纯化回 收后，连接到pMD18-T载体，热激法转化XL10-Gold菌株的感受态细胞，涂布于含有氨苄 青霉素50μg/mL的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑6个，采用M13引 物：5‘TGTAAAACGACGGCCAGT3’和5‘CAGGAAACAGCTATGACC3’，做菌落PCR检测。 扩增产物大小为200bp，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测大小正确后。将PCR检测大小正确的菌 斑接种到含氨苄青霉素50μg/mL的液体LB培养基，37℃下200r/min振荡培养过夜，小 量碱法提取质粒，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA大小正确后(为400bp)，采用Kpn Ⅰ/BamH I酶切对质粒进行双酶切，37℃过夜，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。将检测正确的 阳性重组克隆命名为pMD18-BnCRP1，将pMD18-BnCRP1送上海英骏公司进行测序，分 析结果，得到优化后的抗菌肽BnCRP1基因全长序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例3：融合表达载体EDDIE-BnCRP1的构建

根据柯涛报道的方法，采用反向PCR技术，将BnCRP1基因连接到表达载体pET30a/His- EDDIE-GFP上。利用30abackbone-F:TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和30abackbon e-R:GCAGCTGGTCACCCACAGCG引物，通过反向PCR扩增，将pET30a/His-EDDIE-GF P载体线性化。具体反应体系如下：采用50μL体系，其中pET30a/His-EDDIE-GFP质粒1μl(5 0ng/μl)为模板模板，10×Taq buffer(含MgCl₂)5μl，1.5mmol/L dNTP(10mmol/L)4μ l，5’引物30abackbone-R 2μl(10μmol/L)，3’引物30abackbone-F 2μl(10μmol/L)，Taq酶(5 U/μl)1μl，ddH₂O 31μl。反应条件为94℃下5分钟，94℃30分钟，60℃30秒，72℃6分 钟，25个循环，72℃后延伸10分钟，PCR产物大小为6kb。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测大小 正确后，用凝胶回收试剂盒回收6kb大片段。将回收到的pET30a/His-EDDIE-GFP线性化载体 片段与实施方案二中通过Overlap-PCR扩增回收得到的BnCRP1全长DNA片段，同时转化大 肠杆菌XL10-Gold菌株(购于Strategene公司)，通过体内定点同源重组，将BnCRP1基因连接 到表达载体pET30a/His-EDDIE-GFP上。具体方法如下：按照pET30a/His-EDDIE-GFP线性化 载体片段：50ng的BnCRP1全长DNA片段＝3:1的比例混合样品，用热激法转化XL10-Gold菌 株的感受态细胞后，在含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基平板上筛选，利用载体 上(图1)的GFP绿色荧光蛋白标签在紫外光照射下筛选不发光的阳性克隆，提取质粒，经1. 0％琼脂糖凝胶电泳检测大小正确(图3中B)，送上海英骏生物公司测序。测序后序列正确的 为目的基因融合表达载体EDDIE-BnCRP1。

实施例4：

抗菌肽BnCRP1体外诱导表达与分离纯化

将测序正确的融合表达载体EDDIE-BnCRP1质粒，用热激法转化到BL21(DE3)感受态细 胞中，获得EDDIE-BnCRP1融合表达工程菌BL21(DE3)/pETNB。将转化后菌液吸取5μl在在 含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基平板上划线，37度培养24小时后从卡那霉素抗 性平板上挑取挑单菌落。将挑取的单菌落接种于10毫升终浓度为(50ug/mL卡那霉素)的LB 培养液中，在37℃振荡培养过夜，以1:100的比例转接至1000毫升LB液体培养基中，37℃振 荡培养3小时左右，用分光光度计检测LB液体培养基在600nm下光吸收值为0.6左右时，在上 述LB液体培养基中加入终浓度为1mM的IPTG。在37℃下震荡继续培养6h进行诱导表达， 用台式离心机(前面已述)室温下以5000r/min的速度离心15min，倒掉上清，收集菌体沉 淀。

将上步收集的菌体用破菌缓冲液，在冰浴下用超声波细胞粉碎机超声破菌5min，接着 在4℃条件下用离心机以5000r/min的转速离心15min，收集包涵体沉淀。将包涵体沉淀用1 0毫升洗涤缓冲液在4℃条件下清洗两次，每次2分钟。在4℃条件下用离心机以12000r/min 转速离心20min，再次收集沉淀。用SDS-PAGE电泳检测包涵体中目的蛋白的表达水平(图 4)。图4中(A)的结果表明在IPTG的诱导作用8小时后，BnCRP1在包涵体沉淀中大量表达。

以体积比1：10的比例将上面收集的包涵体沉淀溶于尿素变性缓冲液中，在室温下用振 荡器震荡2小时，于4℃用离心机以12000r/min转速离心20min，取上清。取1ml Ni-NTA琼 脂糖凝胶预装柱，加入10ml平衡缓冲液平衡将预装柱在室温下平衡30分钟，以5000r/min的 速度于4℃用离心机离心5min，去除离下的溶液，收集预装柱。然后取包涵体蛋白上清10ml 样品以0.5ml/min的速度上样至Ni-NTA琼脂糖凝胶预装柱中，下方用2毫升离心管分管收集预 装柱中流下的溶液，每管收集2毫升。随后用15ml洗涤缓冲液以1-2ml/min的流速洗去未吸 附的样品。下方用2毫升离心管分管收集预装柱中流下的溶液，每管收集2毫升。然后用5ml 洗脱缓冲液以1-2ml/min的流速洗脱与Ni-NTA特异性结合的EDDIE-BnCRP1融合蛋白，下方 用2毫升离心管分管收集预装柱中流下的溶液，每管收集2毫升。最后用5ml平衡缓冲液平衡 柱子，加入1毫升20％乙醇以备下次使用。将收集的所有溶液用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白 的含量和纯度，取纯度最好，浓度最高的一管做复性实验(图4A中泳道5的样本)。

取上步电泳检测后最好的图4A中泳道5的蛋白溶液2毫升，快速加入100毫升复性缓冲液， 在室温放置6小时，Tricine-SDS-PAGE电泳检测融合蛋白EDDIE-BnCRP1的自剪切效果，结 果如图4中B所示：获得了融合蛋白发生自剪切之后剩余的不含任何多余氨基酸的BnCRP1抗 菌肽。利用Nanodrop-2000测定复性后抗菌肽的蛋白含量，浓度为12mg/ml。

实施例5：BnCRP1抗菌肽抑菌活性测定

分别以藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus)为革兰氏阳性菌代表，大肠杆菌(Escherichia coli)为革兰氏阴性菌代表，酵母菌(Pichia pastoris GS115)作为真菌的指示菌，以管碟法 作为检测抗菌肽BnCRP1抑菌活性的标准方法。

具体方法如下：在每一个牛津杯中加入200微升浓度约为3毫克每毫升的人工纯化好的抗 菌肽BnCRP1溶液或者化学合成的抗菌肽BnCRP1溶液(两种溶液的抑菌效果相同)，在37度 环境下培养12-16个小时后，通过测定抑菌圈大小来计算BnCRP1抗菌肽的抗菌活性。共进行 3次实验，每次实验进行3次技术重复。

结果如图5和表2所示，加有表达纯化抗菌肽的牛津杯和人工合成抗菌肽的牛津杯周围都 出现大的抑菌圈，而对照部分没有明显的抑菌圈出现。体外表达纯化抗菌肽BnCRP1对大肠 杆菌、藤黄八叠球菌和毕赤酵母的平均抑菌圈直径都在1.3厘米以上，表现出高效的抑菌能 力。

发明人还对BnCRP1抗菌肽对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、这种植物病原真菌的 抑菌活性进行了鉴定。选择完好的核盘菌菌核，先用10毫升75％酒精浸泡1分钟，再用1 0毫升0.1％HgCl₂中浸泡消毒8-10分钟，随后用无菌水10毫升冲洗3-5次。把灭菌菌核切 去两端，中间部分切成绿豆大小，切面朝下，接种于PDA平板。通常每粒菌核接一板，一 次接种8-9板。于22℃静置培养3-4天，当菌丝即将铺满平板时，用打孔器沿菌丝外 缘打孔，取菌丝块，用于再次接种。将用打孔器取出的菌丝块置于一个新的PDA平板上正 中间位置，使含有菌丝的一面接触PDA平面。待菌丝扩展至约1cm时，在菌丝块的上下左 右各放置一个牛津杯，分别加入人工纯化好的抗菌肽或化学合成的抗菌肽(两种方法得到的 抗菌肽的效果相同)，复性液作为对照。继续培养48小时，观察抑菌活性情况。结果如图5 所示，与对照相比，加有抗菌肽的牛津杯周围真菌菌丝生长受到阻止，无法越过牛津杯，而 对照部分菌丝则能够顺利越过牛津杯到达培养皿的边缘。抗菌肽BnCRP1的抑菌直径结果 见表2。结果显示体外表达纯化的抗菌肽BnCRP1对核盘菌的具有显著的抑菌效果，抑菌直 径达到2.83厘米。

表2体外表达纯化抗菌肽BnCRP1抑菌活性

实施例6：

BnCRP1抗菌肽在植物抗病中的应用

为了检测抗菌肽BnCRP1作为生防制剂用于提高植物对真菌病害的抗性的潜力，发明 人在植物(拟南芥、油菜)叶片表面喷施一定浓度的人工表达纯化抗菌肽溶液，随后接种上 述病原真菌，36小时后测定病斑大小。具体方式如下：

取生长5周的拟南芥叶片以及5叶期油菜叶片，在叶片表面均匀涂抹一层浓度为5ng/ μl人工表达纯化后的抗菌肽BnCRP1。按照实施例5中所述方法，在PDA平板上培养核盘 菌当菌丝即将铺满平板时，用打孔器沿菌丝外缘打孔，取菌丝块，用于油菜叶片接 种，用打孔器沿菌丝外缘打孔，取菌丝块，用于拟南芥叶片接种。用注射器针头将 打孔器取出的菌丝块置于拟南芥和油菜叶片正中间，使含有菌丝的一面接触叶片表面。同时 在未涂抹抗菌肽的拟南芥和油菜叶片上也按照上述方法同样接种核盘菌菌丝块作为对照，在 22℃、湿度90％条件下培养36小时观察感病情况，并测定各个叶片上的病斑大小。结果 如图6和表3所示，涂抹抗菌肽的拟南芥叶片和油菜叶片与未涂抹的拟南芥和油菜叶片相比， 接种核盘菌36小时后的病斑面积显著减小。如没有涂抹抗菌肽BnCRP1拟南芥叶片接种核 盘菌36小时后菌斑面积扩展到3.04cm²，而涂抹抗菌肽BnCRP1拟南芥叶片的平均菌斑面 积为0.76cm²，只有对照叶片菌斑面积的25％。同样在油菜叶片表面涂抹抗菌肽BnCRP1后 接菌36小时后的菌斑面积也只有对照的27％左右，具有显著差异。这说明在植物叶片喷施 抗菌肽BnCRP1有显著抑制核盘菌侵染扩散的作用，有效的提高了植物对这种病原真菌的 抗性。

表3拟南芥和油菜叶片接种36小时后病斑面积(单位：cm²)

编号 对照 1 2 3 4 5 6 7 8 拟南芥 3.04 0.76 0.98 0.68 0.81 0.84 0.75 0.69 0.57 油菜 6.21 1.74 1.87 1.68 1.52 1.41 1.6 1.82 1.69

本发明的抑菌活性检测结果表明BnCRP1对细菌(大肠杆菌、藤黄八叠球菌)真菌(酵母 菌、核盘菌)都具有较强的抑菌活性。离体叶片涂抹接菌实验证实BnCRP1能够增强植物对 腐生营养型真菌核盘菌的抗性。BnCRP1能够作为生防制剂用于菌核病防治中。可通过基因 工程技术提高BnCRP1的表达水平能够增强植物对核盘菌的抗性，也可以作为抗性标记用于 油菜抗病品种的选育。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

 

<120>  一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用

 

<130>  一种油菜抗菌肽BnCRP1及其应用

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  102

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgaattggt gcggtgggaa atgcgaagtg cgttgcaaag atgtgggcat gaatgatcgt     60

 

tgcctgaaat attgcggcat ttgttgtaaa gaatgtaaat gc                       102

 

 

<210>  2

<211>  33

<212>  PRT

<213>  油菜

 

<400>  2

 

Asn Trp Cys Gly Gly Lys Cys Glu Val Arg Cys Lys Asp Val Gly Met

1               5                   10                  15     

 

 

Asn Asp Arg Cys Leu Lys Tyr Cys Gly Ile Cys Cys Lys Glu Cys Lys

            20                  25                  30         

 

 

Cys

   

 

 

<210>  3

<211>  99

<212>  DNA

<213>  油菜

 

<400>  3

aaatggtgtg gagggaagtg tgaagtgaga tgcgaagaag cagggatgaa ggatagatgt     60

 

ttgaagtatt gtgggatatg ctgcaaagag tgtaagtgt                            99

 

 

<210>  4

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cgctgtgggt gaccagctgc gaattggtgc ggtgggaaat gcgaagt                   47

 

 

<210>  5

<211>  53

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggcaacgatc attcatgccc acatctttgc aacgcacttc gcatttccca ccg            53

 

 

<210>  6

<211>  53

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ggcatgaatg atcgttgcct gaaatattgc ggcatttgtt gtaaagaatg taa            53

 

 

<210>  7

<211>  53

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gggctttgtt agcagccgga tctcagcatt tacattcttt acaacaaatg ccg            53

 

 

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

tgagatccgg ctgctaacaa agccc                                           25

 

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

gcagctggtc acccacagcg                                                 20