少棘蜈蚣中喹啉类生物碱作为治疗肿瘤药品的制备及应用

摘要

一种少棘蜈蚣中喹啉类生物碱，其分子式为C

说明书

技术领域

本发明涉及制药行业中中药有效成分的制备方法，特别是一种少棘蜈蚣中喹啉类生物碱作为治疗肿瘤药品的制备及应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为仅次于心血管疾病的第二大人类致死病因,尽管近几年来肿瘤的化疗取得了显著进步,白血病和恶性淋巴瘤患者的寿命明显延长,但是对危害生命健康最严重的实体瘤的治疗未能够得到有效的解决。全世界每年癌症的死亡人数为630万人左右,估计到2020年,数字可能增长1倍左右。因此,全球每年投入大量的人力物力用于研究开发防治癌症的新药物。

中药是我国人民数千年来与疾病斗争的结晶,是中华民族文化遗产的重要组成部分,我国地域辽阔,地理和气候带类型丰富多样,药用植物资源十分丰富,对保障人民身体健康和推动世界药学的发展都做出巨大贡献。随着中药日趋国际化,抗肿瘤中草药的活性成分研究越来越受到人们的重视,已经成为当今抗肿瘤药物研发的热点之一。

少棘蜈蚣( Scolopendra> L. Koch) 为节肢动物门唇足纲大蜈蚣科动物, 性味辛、温、有毒, 归肝经。始载于《神农本草经》, 具有辛温走窜、通经逐邪、调达肝经之功效，为祛风镇痛、攻毒散结之要药, 临床应用已有2000多年的历史。蜈蚣是一味疗效显著的有毒之品，对肝癌、肺癌、结肠癌、子宫癌和乳腺癌均有治疗作用。用其治疗肿瘤有“以毒攻毒”之意，也使其成为治疗肿瘤最常用的中药之一。丰富的天然资源加上人工养殖技术的成熟，使蜈蚣成为具有重大研究开发价值的药用资源。加强少棘蜈蚣有效成分的分离鉴定和生物活性测定研究，对开发新的抗肿瘤药物则显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术分析，提供了一种少棘蜈蚣中喹啉类生物碱作为治疗肿瘤药品的制备及应用，该制备方法为从少棘蜈蚣中分离出3,5 - 二羟基喹啉，同时也可通过化学合成的方法对其进行制备，经过药效学筛选发现喹啉类化合物3,5 - 二羟基喹啉具有良好的抗肿瘤作用。

本发明的技术方案：

一种少棘蜈蚣中喹啉类生物碱，其分子式为C₉H₇NO₂，化学名为3,5>

。

一种所述少棘蜈蚣中喹啉类生物碱的制备方法，步骤如下：

1）将粉碎后的少棘蜈蚣, 用甲醇回流提取两次，合并两次提取液，然后减压浓缩，得到甲醇浸膏；

2）将上述甲醇浸膏与硅胶拌样后以正相硅胶柱梯度柱层析分离，具体作法是依次以体积比为20:1的石油醚-乙酸乙酯混合液、体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯混合液、体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为5:1的二氯甲烷-甲醇混合液、体积比为2:1的二氯甲烷-甲醇混合液、纯甲醇、体积比为5:1的甲醇水溶液为洗脱剂进行梯度柱层析；

3）将上述体积比为2:1的二氯甲烷-甲醇混合液洗脱的流分合并浓缩，将所得物质继续以体积比为7:1的二氯甲烷-甲醇混合液为洗脱液为洗脱剂进行正相硅胶柱层析，再以体积比为6:1的甲醇水溶液为洗脱剂的反相硅胶柱纯化，制得目标物。

所述甲醇浸膏与拌样硅胶的重量比为1:1-5；所述甲醇浸膏与正相硅胶柱中分离硅胶的重量比为1:1-500。

一种所述少棘蜈蚣中喹啉类生物碱的制备方法，步骤如下：

1）将间氨基苯酚溶解在30wt%的氢氧化钠水溶液中,加入醋酐进行酰化反应，间氨基苯酚、氢氧化钠和醋酐的摩尔比为1:1-2:1-10，反应得到间酰氧基苯胺；

2）将上述间酰氧基苯胺在间硝基苯酚存在下与甘油和98wt%浓硫酸进行Skraup反应，间酰氧基苯胺、间硝基苯酚、甘油和浓硫酸的摩尔比为1:0.5-1:2-5:2-5，反应得到6-酰氧基喹啉；

3）将上述6-酰氧基喹啉溶解在乙腈中, 加入pH为6.8-7.0的磷酸盐缓冲液和25wt%的硝酸铜溶液后与30wt%的H₂O₂进行氧化反应，6-酰氧基喹啉、硝酸铜与H₂O₂的摩尔比为1：0.1-0.5:1-20,反应得到3-羟基6-酰氧基喹啉；

4）将上述3-羟基6-酰氧基喹啉与50wt%的NaOH水溶液回流，3-羟基6-酰氧基喹啉与NaOH的摩尔比为1:1-100，进行水解反应，制得目标物。

化学合成路线如下所示：

。

一种所述用于治疗肿瘤药品的少棘蜈蚣中喹啉类生物碱的应用，用于制备治疗肿瘤药品。

本发明的优点是：本发明通过从少棘蜈蚣中分离纯化或化学合成的方法成功制得3,5 - 二羟基喹啉，且以本发明提供的3,5 - 二羟基喹啉经过MTT法抗肿瘤活性筛选，发现具有明显的抗肝癌、肺癌和结肠癌活性（IC₅₀值小于30μM），制成治疗药物后可用于肝癌、肺癌和结肠癌患者的治疗，经检索，3,5>

具体实施方式

实施例1：

一种所述少棘蜈蚣中喹啉类生物碱的制备方法，所述少棘蜈蚣中喹啉类生物碱分子式为C₉H₇NO₂，化学名为3,5>

，

其制备步骤如下：

1）将粉碎后的少棘蜈蚣1.9 kg, 用甲醇回流提取两次，每次3 h，合并提取液，减压浓缩，得甲醇浸膏645g。

2）将上述所得的部分甲醇浸膏（589g）拌样后以正相硅胶柱分离，先后以石油醚：乙酸乙酯 （20:1, v:v） → 石油醚：乙酸乙酯 （10:1, v:v） → 二氯甲烷：甲醇（10:1, v:v）→ 二氯甲烷：甲醇（5:1, v:v） → 二氯甲烷：甲醇（2:1, v:v） → 纯甲醇 → 甲醇：水（5:1, v:v）为洗脱剂进行梯度柱层析，每份接收500mL，共收集141份流分。

3）将上述二氯甲烷：甲醇（2:1, v:v）洗脱时所得的111至113流分合并后，继续以二氯甲烷：甲醇（7:1, v:v）为洗脱剂进行正相硅胶柱层析，每份接收75ml，共收集47份流分，其中17至28份合并再经以甲醇：水（6:1, v:v）为洗脱剂的反相硅胶柱纯化，得到目标化合物（8.8 mg）。

将所得目标化合物进行谱图测定，其数据如下：

HR-ESI-MS (negative mode) m/z>->9H₆NO₂).>m/z>+>9H₈NO₂).¹H>3OD,>δ8.54>J =>J =>J = 7.6, 1.2 Hz, H-8), 7.52>J =>J =>13C>3OD,>δ153.2>

由上述数据确定此化合物为一种喹啉生物碱类物质，即3,5 - 二羟基喹啉。将该物质按照现有制药技术，将其制作成为药品，可以用于临床治疗肿瘤。

实施例2：

一种所述少棘蜈蚣中喹啉类生物碱的制备方法，所述少棘蜈蚣中喹啉类生物碱分子式为C₉H₇NO₂，化学名为3,5>

，

其制备步骤如下：

1）取3.00 g (75.0 mmol) NaOH放于100 mL的烧杯中，加入10.0 mL水配成溶液，然后加入5.45 g (50.0 mmol) 间氨基苯酚至上述溶液中，搅拌使其溶解，再加入25 g 碎冰，于搅拌下分三次将6.5 mL (7.0 g, 68.6 mmol) 醋酐加入其中，随即有油状物悬浮于溶液中，将此溶液转移到分液漏斗中，用20.0 mL三氯化碳分两次萃取，合并萃取液，用3wt%的氢氧化钠溶液10.0 mL分两次洗涤，再用10.0mL水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥。蒸除三氯化碳溶剂后得白色固体，即间酰氧基苯胺5.73 g, 得率为75.30%。

2）将无水甘油 9.20 g, (100 mmol)、间硝基苯酚 1.81 g(13.00 mmol) 和上述间酰氧基苯胺 3.78 g(25.00 mmol) 分别加入到100 mL圆底烧瓶中，使混合均匀，然后缓缓加入5毫升98wt%的浓硫酸，在石棉网上小火加热回流3 h，反应完毕后加入12毫升50wt%的氢氧化钠水溶液，再滴加饱和碳酸钠水溶液至中性，将得到的粗产物用体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇混合液作洗脱剂进行柱层析，分离得到灰白色固体6-酰氧基喹啉2.69 g, 得率为57.50%。

3）将所述6-酰氧基喹啉 1.87 g(10.0 mmol) 溶于10毫升乙腈中，加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液10毫升，其中含3.6mmol的Na₂HPO₄和3.6mmol的NaH₂PO₄，再加入2毫升硝酸铜水溶液，其中含三水硝酸铜0.5>2O₂，在60˚C温度下反应5>

4）将上述3-羟基6-酰氧基喹啉1.02 g（5.0 mmol）加入50wt%的氢氧化钠溶液20.0 mL，加热回流4 h，冷却至室温，用37%浓盐酸调节PH值至4.5-5.5，随后用25毫升二氯甲烷萃取两次，二氯甲烷萃取液用水和饱和氯化钠洗涤2次，用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色固体，即3,5 - 二羟基喹啉0.75 g，得率为93.2%。将该产品按照现有制药技术，将其制作成为药品，可以用于临床治疗肿瘤。

以上实施例制备的3,5 - 二羟基喹啉具有明显的抗肿瘤活性，该活性通过以下实验结果得到证实：

实验材料与方法：

1）体外人肿瘤细胞模型：HepG2、A549、HT29；

2）MTT法检测样品对细胞增殖的抑制作用；

3）阳性药物对照为紫杉醇。

实验结果：

制备的3,5 - 二羟基喹啉对人肝癌细胞株HepG2、人肺腺癌细胞株A549和人结肠癌细胞株HT-29的增殖有明显的抑制作用，所测得的IC₅₀>

表1

实验结果表明：制备的3,5 - 二羟基喹啉经过MTT法抗肿瘤活性筛选，其IC₅₀值都小于30μM，说明其具有明显的抗肝癌、肺癌和结肠癌活性。