一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明涉及动物细菌学领域，提供了一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备方法，该方法以A型产气荚膜梭菌为原始菌种，经过一级和二级培养后最终获得菌液，将该菌液与白油佐剂混合即制得A型产气荚膜梭菌灭活疫苗；本发明所述方法制备的疫苗免疫家兔，攻毒后其保护率达到100％，起到了良好的免疫保护作用。

说明书

技术领域

本发明涉及动物细菌学领域，本发明提供了一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭 活疫苗的制备方法。

背景技术

魏氏梭菌病本病又称产气荚膜梭菌病。魏氏梭菌性肠炎主要由A型产气荚膜梭菌产生的 α毒素所致。它广泛存在于土壤、饲料、蔬菜、污水、粪便中。本病的发生无明显季节性， 除哺乳仔兔外，各种年龄、品种、性别的兔子均有易感性。本病的主要传染原是病兔和带菌 兔及排泄物。病原菌自消化道或伤口侵入机体，在小肠和盲肠绒毛膜上大量繁殖并产生强烈 的α毒素，改变毛细血管的通透性，使毒素大量进入血液，引起全身性毒血症。

近几年来，全国各地仔猪红痢和反刍动物坏死性肠炎及肠毒血症的发病率还有明显上升 趋势，尤其是家兔、新生羔羊和犊牛的肠毒血症及羔羊痢疾则成了困扰我国畜牧业发展的一 大难题，严重地影响了畜牧业的发展。对于上述疾病的治疗，理论上讲可以用一些抗生素及 磺胺类药物等进行对症治疗，但由于患畜发病一般都发病急，死亡快，有时症状不太明显并 且根本来不及治疗；病势较缓的，即使用这些药物进行治疗，效果也很不理想要从根本上控 制本病的传播，减少或避免给畜牧业生产带来的巨大经济损失，必须采取切实有效的预防措 施。

对产气荚膜梭菌灭活疫苗的研究已经有很多。陈锡全等进行了“兔病毒性出血症”和A 型魏氏梭菌联苗的研究；佟承刚等研制过兔的魏氏梭菌单苗，攻毒后可产生82.01％的保护率； 鲁承等对兔病毒性出血症和A型魏氏梭菌二联苗进行了研究，A型魏氏梭菌21天产生免疫 力，保护率为82.14％；杨瑛对A型魏氏梭菌氢氧化铝灭活苗进行研究，疫苗0.6ml、2ml、 4ml可以保护小鼠、兔、和猪抵抗标准A型1MLD毒素的攻击。但这些菌苗对动物的免疫 保护率以及安全性等并不是理想，因此我们亟需免疫效果好，安全可靠的新生物制剂，然后 应用于该疫病的控制。

发明内容

基于上述原因，本发明提供了一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备 方法，该方法以A型产气荚膜梭菌为原始菌种，经过一级和二级培养后最终获得菌液，将该 菌液与白油佐剂混合即制得A型产气荚膜梭菌灭活疫苗；本发明所述方法制备的疫苗免疫家 兔，攻毒后其保护率达到100％，起到了良好的免疫保护作用。

发明人在本发明中所采用的A型产气荚膜梭菌采用现有菌种，特别选自标准菌种A型 NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英国微生物菌种保藏中心)，可通 过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材料，不需进行单独的 生物保藏。

本发明的具体技术方案如下：具体步骤如下：

(1).生产用菌种的制备

将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528接种于血琼脂平板，37℃在厌氧箱中培养36h复 苏；挑取典型菌落分别接种于7ml营养肉汤培养基上39℃厌氧培养12h作为一级种子培养液； 之后将2ml的一级种子培养液接种于100ml营养肉汤培养基中39℃厌氧培养12h作为二级种 子培养液；

(2).制苗用菌液的制备

将70ml上述获得的二级种子培养液接入1L产毒培养基中，45℃厌氧环境下200r/min 搅拌培养4h；

(3).制苗用菌液的灭活

将上述培养后获得的菌液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛最终质量分 数达到0.3％进行灭活，充分搅拌混匀，37℃灭活3天；

(4).疫苗的制备

灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1：2的比例充分乳化，并按照每100毫 升体积的疫苗加入0.01克硫柳汞的比例加入的硫柳汞即可获得目标灭活疫苗；

所制备的灭活疫苗4℃保存待检；

其中所述的产毒培养基通过如下方法获得：将0.29g Na₂HPO₄·12H₂O，6.02gKH₂PO₄， 8.0gNaCl，20g蛋白胨，10g糊精，20g酵母提取物，12gL-精氨酸按顺序加入到1000ml去离 子水即得。

所述的酵母提取为是试剂YEAST EXTRACT，市场直接购得。

上述产毒培养基为本发明的发明人经过长期摸索实践后获得的一种全新培养基，该培养 基完全符合产气荚膜梭菌分泌毒素对营养成分的需要，通过调节磷酸盐缓冲液成分，使pH达 到7.4，在生产中简化培养基调节pH。并且比传统的肉肝胃膜消化汤及庖肉培养基配制工艺 简便、节约生产成本且稳定性好，能够满足工业化生产之要求。

所述厌氧培养时厌氧环境气体组成按体积分数如下：88％N₂，7％H₂，5％CO₂。

所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后，加入5ml绵羊血 获得。

本发明中采用的产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528，含有针对家兔魏氏梭菌病的α毒 素基因，可产α毒素抗原。制备的疫苗可刺激机体产生针对A型产气荚膜梭菌菌体和其产生 的α毒素的两种抗体。

本发明从培养基营养成分、温度、pH方面对发酵条件进行了探索，从成本和产毒素以及 菌数三个因素研究发现，在细菌生长适宜温度范围内提高温度更加有利于细菌产生毒素，但 是温度过高或过低都会影响细菌的生长，降低产毒素量。且在发酵过程中发酵罐中的厌氧环 境气体组成对细菌生长以及产毒素的提高起着举足轻重的作用。同时保证发酵液pH值在7.4 左右，这是由于pH值高于7.8会降低产毒素量，维持7.0-7.4产毒素量最高，因此满足上述 条件后即可达到产气荚膜梭菌生长产毒的最佳条件。

为了验证上述疫苗的效果，发明人对其进行了效力检测，具体方法如下：

1.5-2.0kg健康家兔10只，其中5只皮下注射疫苗2ml，另5只作对照，21日后全部静 脉注射致死量的A型产气荚膜梭菌毒素，观察10日，对照组全部死亡，免疫组全部存活，证 明该灭活疫苗对家兔的保护率达到100％。

综上所述，本发明所获得的疫苗与现有疫苗相比，具有如下有益效果：(1)机体产生抗 体高，动物保护率高。由于使用产毒素培养基培养菌液制得的疫苗中含有细菌和毒素两种抗 原成分，在机体内可主动免疫产生针对菌体抗原和毒素抗原的两种抗体，达到良好的预防效 果。(2)本发明所涉及产气荚膜梭菌灭活疫苗便于大规模生产，成本低廉，操作工艺简单。

具体实施方式

实施例1

一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

(1).生产用菌种的制备

将产气荚膜梭菌标准菌种A型NCTC528接种于血琼脂平板，37℃在厌氧箱中培养36h复 苏；挑取典型菌落分别接种于7ml营养肉汤培养基上39℃厌氧培养12h作为一级种子培养液； 之后将2ml的一级种子培养液接种于100ml营养肉汤培养基中39℃厌氧培养12h作为二级种 子培养液；

(2).制苗用菌液的制备

将70ml上述获得的二级种子培养液接入1L产毒培养基中，45℃厌氧环境下200r/min 搅拌培养4h；

(3).制苗用菌液的灭活

将上述培养后获得的菌液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛溶液使甲醛最终质量分 数达到0.3％进行灭活，充分搅拌混匀，37℃灭活3天；

(4).疫苗的制备

灭活检验合格的菌液与灭菌的白油佐剂按体积比1：2的比例充分乳化，并按照每100毫 升体积的疫苗加入0.01克硫柳汞的比例加入的硫柳汞即可获得目标灭活疫苗；

所制备的灭活疫苗4℃保存待检；

其中所述的产毒培养基通过如下方法获得：将0.29g Na₂HPO₄·12H₂O，6.02gKH₂PO₄， 8.0gNaCl，20g蛋白胨，10g糊精，20g酵母提取物，12gL-精氨酸按顺序加入到1000ml去离 子水即得；其中所述的酵母提取为是试剂YEAST EXTRACT，市场直接购得；

所述厌氧培养时厌氧环境气体组成按体积分数如下：88％N₂，7％H₂，5％CO₂；

所述的血琼脂为1g葡萄糖和3.8g豆琼脂粉溶于100ml蒸馏水灭菌后，加入5ml绵羊血 获得。

实施例2

疫苗效力检验，具体方法如下：

1.5-2.0kg健康家兔10只，其中5只皮下注射实施例1中的疫苗2ml，另5只作对照， 21日后全部静脉注射致死量的A型产气荚膜梭菌毒素，观察10日，对照组全部死亡，免疫 组全部存活，证明该灭活疫苗对家兔的保护率达到100％。