一种检测生物柴油中甘油酯和游离脂肪酸含量的方法

摘要

本发明公开了一种测定生物柴油中甘油酯和游离脂肪酸含量的方法，所述方法为：将生物柴油样品稀释，以铝箔片基层析硅胶板作薄层色谱分离，以体积比90:10:2的正己烷、乙酸乙酯、甲酸混合溶剂为展开剂，用碘蒸汽显色，分离后，将显色的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的斑点裁下，裁下的斑点与三甲基氢氧化硫的甲醇溶液装入样品杯，装入裂解器中，将裂解器置于GC进样口处，当裂解器温度达到300～450℃时进样，气相色谱检测，获得待测样品的气相色谱图，与甘油一酯、二酯、三酯和游离脂肪酸的标准曲线对照计算得到待测样品中甘油酯和游离脂肪酸的含量。本方法操作简单，定量准确，信息全面，对生物柴油的质量控制具有十分深远的意义。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测生物柴油中甘油酯和游离脂肪酸含量的方法，通过薄层色谱结合热辅助水解甲基化气相色谱的方法快速准确地测定生物柴油中残留的甘油酯和游离脂肪酸的含量。

(二)技术背景

生物柴油是目前新兴起来的一种无毒，可再生和降解的绿色能源，主要是利用未加工过的或者使用过的植物油以及动物脂肪通过不同的化学反应制备而来，现已成为一种优质的石油柴油替代品。然而由于反应不完全，常常残留少量的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯以及游离脂肪酸等副产物，严重影响生物柴油的品质，从而影响发动机的性能。欧盟标准(EN 14214:2008)规定生物柴油中的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的含量分别不高于0.8％，0.2％，0.2％(m/m)和0.5mg KOH/g，根据生物柴油的密度(0.86-0.90g/mL,取0.87g/mL)转换成质量体积浓度，约为7010g/mL,1740g/mL,1740g/mL和2194g/mL。

目前最常用于检测生物柴油中残留甘油酯和脂肪酸的技术有TLC-FID，HPLC-ELSD和高温GC等。上述方法往往存在定量不准确，信息不全面、灵敏度不高或者仪器损伤大等缺点，从而限制了其广泛应用。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种新颖的薄层色谱结合热辅助水解甲基化的方法同时检测生物柴油中的残留甘油酯和游离脂肪酸的含量，并对多个生物柴油样品的甘油酯和游离脂肪酸进行定性定量分析，评价其质量控制情况。

本发明采用的技术方案是：

一种检测生物柴油中甘油酯和游离脂肪酸含量的方法，所述甘油酯包括甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，所述方法包括以下步骤：

(1)制作甘油一酯标准曲线：以硬脂酸甘油一酯作为甘油一酯的标准品，硬脂酸甘油一酯用乙酸乙酯溶解，配成不同浓度的硬脂酸甘油一酯标准溶液，各取1μL点样，在铝箔片基层析硅胶板上进行薄层色谱分离，以体积比90:10:2的正己烷、乙酸乙酯、甲酸混合溶剂为展开剂，当溶剂前沿扩展到铝箔片基层析硅胶板的另一端后，将铝箔片基层析硅胶板拿出，待溶剂挥干后，用碘蒸汽显色，显色后，将显色的甘油一酯斑点裁下，裁下的斑点装入样品杯，并加入3μL的0.2mol/L三甲基氢氧化硫的甲醇溶液，将上述样品杯固定于进样杆后，装入裂解器中，将裂解器置于气相色谱仪进样口处，当裂解器温度达到300～450℃时进样，气相色谱检测，获得硬脂酸甘油一酯在线甲基化反应所得的硬脂酸甲酯的气相色谱图；以气相色谱图中的峰面积为纵坐标，硬脂酸甘油一酯的标准溶液浓度为横坐标，绘制硬脂酸甘油一酯的标准曲线，即为甘油一酯标准曲线；

(2)以硬脂酸甘油二酯作为甘油二酯的标准品，硬脂酸甘油三酯作为甘油三酯的标准品，油酸作为游离脂肪酸的标准品，按照上述步骤(1)操作，分别获得甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的标准曲线；

(3)待测生物柴油样品用乙酸乙酯稀释2～6倍，取1μL点样，在铝箔片基层析硅胶板上进行薄层色谱分离，以体积比90:10:2的正己烷、乙酸乙酯、甲酸混合溶剂为展开剂，当溶剂前沿扩展到铝箔片基层析硅胶板的另一端后，将铝箔片基层析硅胶板拿出，待溶剂挥干后，用碘蒸汽显色，对比步骤(1)、(2)中各标准品的斑点显色位置，将显色的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的斑点分别裁下，裁下的斑点各自装入样品杯，并加入3μL的0.2mol/L三甲基氢氧化硫的甲醇溶液，将各样品杯分别固定于进样杆后，装入裂解器中，将裂解器置于气相色谱仪进样口处，按照步骤(1)的条件进样并进行气相色谱检测，分别获得甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸在线甲基化反应所得的脂肪酸甲酯混合物的气相色谱图；将待测样品的甘油一酯的气相色谱图中所有脂肪酸甲酯峰的总峰面积与甘油一酯标准曲线对照，计算获得待测样品中甘油一酯的含量；将待测样品的甘油二酯的气相色谱图中所有脂肪酸甲酯峰的总峰面积与甘油二酯标准曲线对照，计算获得待测样品中甘油二酯的含量；将待测样品的甘油三酯的气相色谱图中所有脂肪酸甲酯峰的总峰面积与甘油三酯标准曲线对照，计算获得待测样品中甘油三酯的含量；将待测样品的游离脂肪酸的气相色谱图中所有脂肪酸甲酯峰的总峰面积与游离脂肪酸标准曲线对照，计算获得待测样品中游离脂肪酸的含量。

本发明方法中，将样品杯固定于进样杆后，装入裂解器中，将裂解器置于气相色谱仪进样口处，当裂解器温度达到300～450℃时进样，此时样品杯掉入炉心，斑点上的物质瞬间热脱附，并与三甲基氢氧化硫发生在线甲基化作用生成相应的脂肪酸甲酯产物，经载气带入气相色谱进样口，进行气相色谱检测。因此得到的气相色谱图实际均为脂肪酸甲酯的色谱图。

本发明中所述在线甲基化主要有两大作用，一是实现在线样品提取，在高温作用下，吸附于硅胶上的待测物瞬间热脱附；二是脱附后的样品与三甲基氢氧化硫衍生化试剂在高温条件下发生甲基化反应生成相应的甲酯类产物，便于直接带入气相色谱分析。该技术无需复杂前处理，与繁琐的传统离线提取及衍生化方法相比大大缩短了检测时间。

另外，为了检测的简单化，以硬脂酸甘油一酯作为甘油一酯的标准品、硬脂酸甘油二酯作为甘油二酯的标准品，硬脂酸甘油三酯作为甘油三酯的标准品，油酸作为游离脂肪酸的标准品。实际生物柴油样品中甘油一酯为混合物，包括棕榈酸甘油一酯、硬脂酸甘油一酯、油酸甘油一酯、亚油酸甘油一酯、亚麻酸甘油一酯中的一种或两种以上，经薄层色谱分离、在线甲基化气相色谱检测后，气相色谱图中有多个脂肪酸甲酯的峰，包括棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯等。为了简便起见，将所有脂肪酸甲酯峰均作为硬脂酸甲酯，取所有脂肪酸甲酯峰的总峰面积与硬脂酸甘油一酯的标准曲线对照，计算甘油一酯混合物的总含量。这样的简化主要基于各脂肪酸在气相色谱分析中的矫正因子是相似的原则，该处硬脂酸一酯也可看作内标物。甘油二酯、甘油三酯做同样简化处理。游离脂肪酸也为化合物，包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸中的一种或两种以上，本发明以油酸作为游离脂肪酸的标准品，检测得到的数据为所有游离脂肪酸的总含量。

本发明运用薄层色谱技术对生物柴油中的脂肪酸甲酯、游离脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯进行分离和定性，显色后将相应的斑点剪下，在裂解器中进行热脱附同时在有机碱的作用下衍生为相应的脂肪酸甲酯，直接带入气相色谱检测，获得相应的气相色谱图。根据色谱软件获得相应的脂肪酸甲酯峰的总面积，并且运用归一化法确定其中各类脂肪酸类型的相对含量。再分别对甘油一酯，二酯、三酯和游离脂肪酸的标准品进行同样的薄层色谱-热辅助水解甲基化气相色谱分析，以各自峰面积为纵坐标，以各自标准品浓度为横坐标分别制作各甘油酯标准曲线和游离脂肪酸标准曲线，根据样品的气相色谱谱图及甘油酯标准曲线和/或游离脂肪酸标准曲线计算待测样品中甘油酯和/或游离脂肪酸的含量。

本发明薄层色谱中使用的铝箔片基层析硅胶板，采用铝箔片基是为了便于分离后裁下斑点，进行后续检测。

本发明步骤(3)中，待测生物柴油样品用乙酸乙酯稀释2～6倍，根据实际样品情况适当选择以满足标准曲线的线性范围；所述点样一般用平头点样针，采用20μL液相注射器，点样量为1μL,。

进一步，本发明步骤(1)、(2)、(3)中，气相色谱条件为：色谱柱为强极性柱，柱箱：初温50℃，以5～10℃/min(优选10℃)速率升到230℃，保持5～15mim(优选10min)；进样口温度为230℃～300℃(优选250℃)，检测器温度为230℃～300℃(优选250℃)，分流比30:1；载气为氮气，流速1.0mL/min；

裂解器条件为：裂解炉温度:300～450℃(优选350℃)；裂解器与气相色谱仪接口温度300℃；

进一步，优选气相色谱条件为：色谱柱为强极性柱，柱箱：初温50℃，以10℃/min速率升到230℃，保持10min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，分流比30:1；载气为氮气，流速1.0mL/min；

裂解器条件优选为：裂解炉温度:350℃；裂解器与气相色谱仪接口温度300℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明应用薄层色谱-热辅助水解甲基化气相色谱法，可以同时测定食品中残留甘油酯和游离脂肪酸含量，准确，方便，没有繁琐的前处理过程，不仅能测定生物柴油中各甘油酯和游离脂肪酸的含量，同时可以有效地检测各甘油酯和游离脂肪酸中的脂肪酸组成。

本发明充分结合薄层色谱和热辅助水解甲基化气相色谱两种方法，生物柴油经铝箔片基层析硅胶板分离后，将相应的甘油酯和游离脂肪酸的斑点剪下，分别与衍生化试剂一起置于裂解器中进行热脱附同时衍生为相应的脂肪酸甲酯，供气相色谱分析。该技术具有操作简单、定量准确、溶剂消耗少等优点，能同时对生物柴油中的甘油酯和游离脂肪酸进行检测，并且得到相应的脂肪酸组分分布情况。

(四)附图说明

图1为实施例1中各标准品和待测生物柴油样品1中的薄层色谱分离图。

图2为实施例1中待测生物柴油样品1中甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

硬脂酸甘油一酯、硬脂酸甘油二酯、硬脂酸甘油三酯、硬脂酸甲酯、油酸标准品和三甲基氢氧化硫(TMSH，0.2mol/L甲醇溶液)均购自于百灵威公司；正己烷、乙酸乙酯、甲酸为分析纯均购自国药集团试剂有限公司。

GF254铝箔片基层析硅胶板购自默克公司(德国)。液相进样针购自上海高鸽工贸有限公司。

5个生物柴油样品均由浙江工业大学化学工程学院提供。样品1、3、4、5分别由菜籽油、棕榈油、地沟油和大豆油制备而成，样品2原料信息不详。

美国Thermo Finnigan Trace DSQ的气相色谱/质谱联用仪(GC-MS)；美国Varian CP-3800气相色谱仪，配氢火焰检测器(FID)；日本Frontier PY-2020iD双击式纵型微型炉裂解器。

实施例1：薄层色谱结合热辅助水解甲基化气相色谱法对待测生物柴油(样品1)中各脂肪酸和甘油酯的检测

(1)薄层色谱的分离过程：先将100μL的待测生物柴油样品(样品1)溶于500μL的乙酸乙酯中，稀释6倍。混合均匀后，用液相平头针抽取1μL，点在10cm的铝箔片基层析硅胶板的一端，在展开剂正己烷/乙酸乙酯/甲酸(90/10/2)中展开。当溶剂前沿扩展到薄层板的另一端后，将薄层板拿出，待溶剂挥干后，用碘蒸汽显色。此时，薄层上的待测分析物呈褐色或黄色斑点，薄层色谱图见图1最右侧，图1左侧为脂肪酸甲酯、甘油一酯、二酯、三酯和游离脂肪酸的标准品的薄层色谱图，即硬脂酸甲酯、硬脂酸甘油一酯、硬脂酸甘油二酯、硬脂酸甘油三酯、油酸的薄层色谱图，分离展开条件同样品1。根据各标准品的斑点显色位置，判定样品1的薄层色谱图中分离的各斑点分别为甘油一酯、二酯、三酯和游离脂肪酸。

(2)在线水解甲基化气相色谱分析过程：将上述显色的甘油一酯、甘油二酯、游离脂肪酸和甘油三酯的斑点分别剪下。分别将待测斑点和3μL的TMSH装入样品杯，固定于进样杆后，装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到350℃时，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，待测分析物瞬间热脱附，同时在TMSH作用下发生甲基化反应生成相应的脂肪酸甲酯混合物，由载气带入GC进样口，进行GC分析，分别获得待测样品甘油一酯、甘油二酯、游离脂肪酸和甘油三酯的气相色谱图。见图2。在谱图中可以观察到每张图中都有C16:0，C18:0，C18:1，C18:2四种脂肪酸甲酯的峰，未检测到C18:3或C14:0等其他脂肪酸甲酯。分别计算甘油一酯、甘油二酯、游离脂肪酸和甘油三酯的气相色谱谱图中四个脂肪酸甲酯峰面积的总和，代入步骤(3)的标准曲线即得该生物柴油中甘油一酯、甘油二酯、游离脂肪酸和甘油三酯的含量。标准曲线制作详见步骤(3)

气相色谱仪为Varian CP-3800气相色谱仪，色谱柱为强极性柱，DB-23石英毛细管柱(30m×0.25mm i.d.×0.25μm膜厚，50％氰丙基-50％甲基聚硅氧烷，美国)，柱箱：初温50℃，以10℃/min速率升到230℃，保持10min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，分流比30:1；载气为氮气，流速1.0mL/min；

裂解器条件为：裂解炉温度:350℃；裂解器与气相色谱仪接口温度300℃。

(3)制作标准曲线：

甘油一酯标准曲线的制作：准确称取硬脂酸甘油一酯0.01g置于2mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成浓度为5000mg/L的标准溶液，再用乙酸乙酯稀释成300、1000、2000、3000、4000mg/L标准溶液，储存于4℃的冰箱内。分别对浓度为300、1000、2000、3000、4000、5000mg/L硬脂酸甘油一酯标准溶液进行上述薄层色谱分离结合热辅助水解甲基化气相色谱分析，操作同步骤(1)、(2)，获得硬脂酸甲酯的气相色谱图，然后以气相色谱图中的峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制硬脂酸甘油一酯的标准曲线。见表1。

甘油二酯标准曲线的制作：准确称取硬脂酸甘油二酯0.01g置于2mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成浓度为5000mg/L的标准溶液，再用乙酸乙酯稀释成300、1000、2000、3000、4000mg/L的标准溶液，储存于4℃的冰箱内。分别对浓度为300、1000、2000、3000、4000、5000mg/L硬脂酸甘油二酯标准溶液进行所述的薄层色谱分离结合热辅助水解甲基化气相色谱分析，操作同步骤(1)、(2)，获得硬脂酸甲酯的的气相色谱图，然后以气相色谱图的峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制硬脂酸甘油二酯的标准曲线。见表1。

甘油三酯标准曲线的制作：准确称取硬脂酸甘油三酯0.01g置于2mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成浓度为5000mg/L的标准溶液，再用乙酸乙酯稀释成300、1000、2000、3000、4000mg/L标准溶液，储存于4℃的冰箱内。分别对浓度为300、1000、2000、3000、4000、5000mg/L硬脂酸甘油三酯标准溶液进行所述的薄层色谱分离结合热辅助水解甲基化气相色谱分析，操作同步骤(1)、(2)，获得硬脂酸甲酯的气相色谱图，然后以气相色谱图的峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制硬脂酸甘油三酯的标准曲线。见表1。

游离脂肪酸标准曲线的制作：准确称取油酸0.01g置于2mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成浓度为5000mg/L的标准溶液，再用乙酸乙酯稀释成300、1000、2000、3000、4000mg/L标准溶液，储存于4℃的冰箱内。分别对浓度为300、1000、2000、3000、4000、5000mg/L油酸标准溶液进行所述的薄层色谱分离结合热辅助水解甲基化气相色谱分析，操作同步骤(1)、(2)，获得气相色谱图，然后以气相色谱图中油酸甲酯的峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制油酸的标准曲线。见表1。

通过色谱软件得待测生物柴油样品(样品1)中甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的峰面积分别为4097，14624,7691，22615，代入线性方程后求得含量再乘以稀释倍数6，计算出待测生物柴油样品(样品1)中甘油一酯的含量为10161mg/L，甘油二酯的含量为12293mg/L，甘油三酯的含量为6774mg/L，游离脂肪酸的含量为28409mg/L。均超出欧盟标准。

考察了本法的线性关系、检出限：分别配制浓度为300-5000mg/L的硬脂酸甘油一酯、二酯、三酯和油酸，其他操作同实例1，表明在300-5000mg/L的浓度范围内各甘油酯和游离脂肪酸具有良好的线性关系，相关系数在0.9766-0.9950之间。按照信噪比(S/N)大于3来确定被分析物检出限，得到的各检出限在100-200mg/L之间，足以满足欧盟标准中各限量要求的检测。见表1。

表1

线性关系、检出限

实施例2：薄层色谱结合热辅助水解甲基化气相色谱法对5种待测生物柴油中各脂肪酸和甘油酯的检测

样品1的检测过程和数据见实施例1。样品2、3、4分别稀释3倍，样品5稀释2倍，其他操作同样品1。

根据待测样品的气相色谱的峰面积、标准曲线，获得待测样品中甘油一酯、二酯、三酯和游离脂肪酸的浓度，以及分子中的脂肪酸组分的分布，见表2。

表2

5个生物柴油样品中的残留甘油酯和游离脂肪酸的含量，以及其脂肪酸组成分布

*脂肪酸组成是指各甲酯峰面积占总的甲酯峰面积的百分比。并不代表实际百分含量。

实施例3

在样品4中分别加入标准品硬脂酸甘油一酯2380mg/L，硬脂酸甘油二酯1230mg/L，硬脂酸甘油三酯2240mg/L，油酸2460mg/L，得到加标样品4，混合均匀后进行薄层色谱-热辅助水解甲基化气相色谱分析。操作条件同样品4。根据标准曲线分别计算出该加标样品4中甘油一酯、甘油二酯，甘油三酯和游离脂肪酸的含量，减去表2中样品4中原有的各甘油酯和游离脂肪酸的含量，可得其回收率。甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的加标回收率分别为110.8％，116.7％，87.5％，97.2％。重复操作3次，所得RSD值分别为9.7％，10.3％，5.8％，7.5％。