定量多重甲基化特异性PCR方法-cMethDNA、试剂及其用途

摘要

本发明的cMethDNA方法是QM-MSP方法(美国专利号8,062,849)的新颖的改进，特别地旨在以已经报道的最低拷贝数定量检测流体诸如血清或血浆中的肿瘤DNA(或其他循环DNA)。与任何其他基于PCR的测定相比特有的是，将少量拷贝的合成的多核苷酸标准品(STD基因)添加至等分的患者血清。在标准过程中，将用于多个感兴趣的基因(TARGET基因)的标准品的混合物添加至血清样品。纯化并处理总DNA后，进行PCR(多重步骤)，其中用相同的外部引物组共扩增STD基因和TARGET基因。在第二巢式PCR步骤中，存在于第一PCR反应的稀释物中的扩增子经受实时PCR，并通过双色实时PCR对一个孔中的各基因进行定量。产物通过用对甲基化的TARGET基因和相关的STD基因特异性的内部引物组的绝对定量来计算。公开了制备STD基因标准品的方法及cMethDNA方法的用途以及包含其的试剂盒。

说明书

相关申请的引用

本申请要求2012年5月22日提交的美国临时专利申请号61/650,083 的权益，该美国临时专利申请在此通过引用并入本文用于所有目的，如同 在本文中充分阐明。

通过引用并入的电子提交的材料

本申请包含经EFS-Web以ASCII格式提交并在此通过引用以其整体并 入的序列表。所述ASCII文本，创建日期为2013年5月13日，名称为 P12014-02_SL.txt且大小为58,416字节。

发明背景

现在清楚的是，包括基因启动子和基因内部一些区域的过度甲基化的 表观遗传改变与肿瘤进展一致且是其中的早期事件。认为此类改变通过转 录沉默肿瘤抑制基因表达并通过增加基因突变的比率有助于肿瘤过程。由 于DNA甲基化不改变DNA序列，其是可逆的；然而，其是从细胞至细胞 可遗传的。如此，甲基化的基因可用作生物标志物诸如用于癌症的早期检 测、风险评估、预测并监测对治疗的反应、以及复发的早期检测。

肿瘤DNA可见于各种体液，并且这些体液可潜在地用作诊断材料。 肿瘤DNA在这些液体中的评价需要特异以及敏感的方法。已知称为甲基 化特异性PCR(MSP)的基于PCR的技术在一千个未甲基化的基因组DNA 拷贝中检测一个拷贝的甲基化的基因组DNA。定量实时PCR(Q-PCR)允许 用最少处理的样品在几小时内高度灵敏的定量感兴趣的基因的转录水平 或DNA水平。感兴趣的基因的cDNA或基因组拷贝使用光学可检测的多 核苷酸探针当PCR产物积累时通过检测PCR产物来定量。定量MSP (Q-MSP)允许通过实时PCR用甲基化特异性引物探针高度灵敏的检测基因 启动子甲基化水平。

定量和多重MSP技术已被改进以在巢式或多重MSP测定中同时共扩 增(co-amplify)数个基因来开发定量多重甲基化特异性PCR(QM-MSP)。 QM-MSP方法基于实时PCR，其使用一个或更多个可区别的光学可检测探 针以增加测定特异性和灵敏度使得可在100,000个未甲基化的基因拷贝中 检测出一至十个拷贝的期望的甲基化基因。

来自本发明人的研究已表明一组(a panel of)甲基化标志物可在来自导 管液(ductal fluid)的细胞中和在自发乳头溢液中检测100％的所有乳腺癌和 95％的DCIS、和癌症。然而，来自血清/血浆的甲基化的DNA的可重复检 测证明是更困难的。在过去15年中，许多研究已报道了在血清/血浆中使 用单一或一组标志物检测乳腺癌。然而，还没有临床验证研究遵循这些初 步结果，表明这一分析中还存在待解决的技术困难：1)首先，血清中脱落 的甲基化的肿瘤DNA的量是由正常细胞脱落的总的未甲基化的DNA(匹 配基因特异性DNA或参考DNA诸如肌动蛋白)的非常小的部分。体液中 未甲基化的或参考DNA与稀有的靶甲基化的DNA的相对丰度之间存在不 均衡性。由于甲基化信号被更为丰富的种类掩蔽，这导致缺少稳固性测定； 2)正常未甲基化的DNA脱落的程度每日波动并伴随各种临床状态，诸如 外科手术或感染；如果参考波动，则误差存在于感兴趣的靶基因的％甲基 化的解释中；3)可用的最灵敏的测定利用巢式PCR(进行或不进行多重)以 使用在感兴趣的区域外侧的外部引物预扩增靶DNA和参考DNA的扩增 子，随后进行两轮定量PCR。但存在技术限制使得靶DNA和参考DNA区 域需要理想地使用同一对外部引物以相同效率在预扩增PCR反应中被共 扩增，以维持靶DNA与参考DNA的准确起始比。在巢式PCR中，由于 非同一基因之间引物杂交的效率差异，肌动蛋白或其他基因不能准确用作 感兴趣的基因的参考。因此，取决于DNA特异性引物与靶和参考DNA的 杂交的效率的相对差异，靶与参考的比随每个循环的预扩增而改变；4)现 有血清MSP测定通常需要10-20ng基因组DNA/测定以一次测试一个基 因。由于癌症患者的血清中总DNA的水平是低的[中值65.4ng/ml；范围 6.3–268.6ng/ml；Holdenrieder等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1137:162-170 (2008)]，数个基因的测定需要大量血清，因为来自现有临床研究的档案血 清仅以小体积可用，使重复研究成问题且难以临床验证。

发明概述

为了克服这些问题，本发明人现已开发出新颖的定量多重甲基化特异 性PCR方法，其称为“cMethDNA”。这种方法克服了以上讨论的全部限制： 1)对于每个基因标志物，开发了重组工程化的基因特异性标准品(STD基因 (STDgene))作为参考DNA。为了避免遮蔽靶DNA(TARGET基因 (TARGETgene))，仅使用每300μl血清50个拷贝(150pg的基因组等价物) 的参考；2)不测定未甲基化或不相关的DNA，因此未甲基化的DNA中的 波动将不会影响靶基因的甲基化的定量；3)各STD基因DNA被设计具有 与甲基化的感兴趣的TARGET基因同源的5’和3’末端(每个末端～20-22个 碱基)，并在末端之间具有相似数目的间隔核苷酸，因此在预扩增PCR(第 一轮)期间，TARGET基因和STD基因DNA两者可用单一外部引物组共 扩增，独立于TARGET基因的甲基化状态；以及4)使用从300μl的血清 分离的输入基因组DNA(低至1.9ng)[中值65.4ng/ml；范围6.3–268.6 ng/ml；Holdenrieder等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1137:162-170(2008)]，在预 扩增步骤期间进行多重PCR以促进具有直至12或更多个TARGET基因 DNA(以及其各自的STD基因DNA)的数以亿计的扩增子的合成。综合考 虑，将累积的和单个TARGET基因甲基化表示为针对标志物的组(marker  panel)的累积甲基化指数(CMI)，和针对单个基因的甲基化指数(MI)。CMI 通过确定针对组中单个基因的MI的和来计算。MI＝[#拷贝TARGET基因 /#拷贝(TARGET基因+STD基因)](100)。

根据一个或更多个实施方案，本发明人开发了使用一组选择的 TARGET基因的cMethDNA测定，发现通过全基因组甲基化阵列分析，以 灵敏度>90％和特异性>96％检测4期患者(57名癌症；55名正常)血清的训 练组和测试组中甲基化的TARGET基因DNA。在来自诊断时三个不同的 4期群体中的相同患者的原发性、远端转移和血清、在尸检时收集的复发 性转移性乳腺癌、和样品之间观察到DNA甲基化模式的显著一致性，表 明核心甲基化标签随时间推移被保留。甲基化水平显示与治疗后化疗反应 相关。在29例患者的初步研究中，显示cMethDNA能够监测对治疗的反 应。总之，下文实施例中的数据显示了本发明的cMethDNA方法：1)可检 测脱落进入血液的肿瘤DNA，2)反映原发性肿瘤及其转移病灶的典型的甲 基化改变，以及3)显示评价化疗干预后对治疗的反应的潜力。

本发明的cMethDNA方法是QM-MSP方法(美国专利号8,062,849，并 通过引用以其整体并入本文)的新颖的改进，特别地旨在以已经报道的最低 浓度(300μl血清中50拷贝)定量检测流体诸如血清或血浆中的肿瘤DNA (或其他循环DNA)。与任何其他基于PCR的测定相比特有的是，将少量拷 贝的合成的多核苷酸标准品(STD基因)添加至等分的患者血清。在标准过 程中，将用于多个感兴趣的基因(TARGET基因)的标准品的混合物添加至 血清样品。纯化并处理总DNA后，进行PCR(预扩增，多重步骤)，其中 STD基因和TARGET基因以独立于TARGET基因的甲基化状态的方式用 相同外部引物组共扩增。在巢式PCR的第二步中，存在于第一PCR反应 的稀释物中的扩增子经受实时PCR，并通过双色实时PCR对一个或两个 孔中的各基因进行定量。产物通过用对甲基化的TARGET基因和相关的 STD基因特异性的内部引物组的绝对定量来计算。然后，基于拷贝数确定 各基因的甲基化指数(MI)，以及基因的组(gene panel)的累积甲基化(CMI)。

根据实施方案，本发明提供了定量来自受试者的样品中一个或更多个 感兴趣的基因的甲基化的方法，该方法包括：a)向来自受试者的包含DNA 的样品中添加对待检测的各感兴趣的TARGET基因特异性的STD基因的 多个拷贝；b)分离并处理样品中的DNA；c)制备(a)中的DNA用于甲基化 特异性PCR；d)使用PCR在足以产生第一扩增产物的条件下用一对或更多 对外部甲基化独立的PCR引物(external methylation-independent PCR  primers)扩增(b)中的DNA，其中各单一引物对能够仅与一个待检测的 TARGET基因以及对该TARGET基因特异性的STD基因选择性地杂交； e)获得(d)的第一扩增产物的稀释的样品；f)向(e)中添加一对对各TARGET 基因特异性的内部甲基化依赖的PCR引物(internal methylation-dependent  PCR primer)、和一对对感兴趣的基因的各STD基因特异性的内部PCR引 物、与各TARGET基因的靶序列特异性杂交的一个或更多个光学可检测的 标记的DNA探针、和与各STD基因特异性杂交的一个或更多个光学可检 测的标记的DNA探针；以及g)使用定量RT-PCR在足以产生第二扩增产 物的条件下扩增(f)中的DNA，所述第二扩增产物提供各甲基化的TARGET 基因的拷贝的量和各STD基因的拷贝的量的定量。

根据另一个实施方案，本发明提供了诊断来自受试者的样品中与异常 DNA甲基化相关的疾病的发展的方法，该方法包括：a)向来自受试者的包 含DNA的样品中添加针对待检测的各感兴趣的TARGET基因的STD基因 的多个拷贝；b)分离并处理(a)的样品中的DNA以制备用于甲基化特异性 PCR的DNA；c)使用PCR在足以产生第一扩增产物的条件下用一对或更 多对外部甲基化独立的PCR引物扩增(b)中的DNA，其中各单一引物对能 够仅与一个待检测的感兴趣的TARGET基因和对该相同基因特异性的 STD基因选择性地杂交；d)获得(c)的第一扩增产物的稀释的样品；e)向(d) 添加对各TARGET基因特异性的一对内部甲基化依赖的PCR引物、和对 TARGET基因的各STD基因特异性的一对内部PCR引物、与感兴趣的基 因的各TARGET基因特异性杂交的一个或更多个光学可检测的标记的 DNA探针、和与感兴趣的基因的各STD基因特异性杂交的一个或更多个 光学可检测的标记的DNA探针；以及f)使用定量RT-PCR在足以产生第二 扩增产物的条件下扩增(e)中的DNA，所述第二扩增产物提供各甲基化的 TARGET基因的拷贝的量和感兴趣的基因的各STD基因的拷贝的量的定 量，其中与对照相比，从样品获得的一个或更多个TARGET基因的甲基化 拷贝的量的增加指示疾病的增加的风险和/或存在；以及b)诊断受试者为具 有疾病的增加的风险和/或存在。

根据另外的实施方案，本发明提供了用于在RT-PCR中使用的STD基 因，包括具有与内源性感兴趣的TARGET基因的5’和3’末端核苷酸序列 相同的5’和3’末端核苷酸序列的寡核苷酸，其中在5’和3’末端核苷酸序列 之间的间隔寡核苷酸序列包括原核的、或非哺乳动物的、或不相关哺乳动 物的DNA序列，并且STD基因的整体大小(碱基对的数目)与感兴趣的 TARGET基因区域的扩增子大小约相同。

根据实施方案，本发明提供了用于确定DNA样品中多个TARGET基 因DNA序列的甲基化状态的一个或更多个试剂盒。本发明试剂盒包括对 待检测的各感兴趣的TARGET基因特异性的STD基因的多个拷贝、和在 允许产生包含第一扩增子的第一扩增产物的条件下能够与待检测的一个 或更多个TARGET基因的每一个选择性杂交以及能够与STD基因的每一 个选择性杂交的一对或更多对外部甲基化独立的PCR引物、对感兴趣的基 因特异性的一对或更多对内部甲基化依赖的PCR引物、对各感兴趣的 TARGET基因的SPS特异性的一对或更多对内部PCR引物、与感兴趣的 TARGET基因特异性杂交的一个或更多个光学可检测的标记的DNA探针、 和与感兴趣的基因的STD基因特异性杂交的一个或更多个光学可检测的 标记的DNA探针。

附图简述

图1描绘了乳腺癌中全基因组血清DNA甲基化阵列。从患有乳腺癌 的个体和正常对照获得的血清样品使用Infinium人甲基化27珠芯片阵列 (Infinium HumanMethylaion27BeadChip Array)来询问。1A)对针对在个体样 品内良好技术再现性选择的个体患者样品(X-轴)和探针(Y-轴)进行非监督 二维层序聚类分析[探针检测p-值<0.00001；26789/27578阵列探针]。显示 了根据癌症或正常样品起源分开的两个不同的簇，指示阵列中基因组甲基 化谱的差异。1B)用于癌症特异性阵列探针的监督选择的标准方案。1C)在 癌症(Y-轴)和正常(X-轴)的样品组中针对血清(左图)和组织(右图)的172个 癌症特异性探针(正方形)的每个的平均甲基化水平被显示在散点图中。实 线显示针对单个CpG基因座探针，组间的平均甲基化(AVE_β甲基化)水平 中的±1.5倍差异的区域。

图2描绘了本发明的cMethDNA测定的实施方案的示意图。2A)使用 一对引物/基因(正向和反向)进行多重第一PCR反应(步骤1)以共扩增10个 独特的基因。各独特的引物对扩增感兴趣的基因(TARGET基因)和在DNA 纯化前向患者的血清掺加入50个拷贝的匹配克隆的基因特异性标准品 (STD基因)。在第二PCR反应(步骤2)中，各独特的TARGET基因和STD 基因的组的扩增子使用实时PCR用基因特异性的引物(正向和反向)和水解 探针(以双色，识别TARGET基因或STD基因)的组在同一孔中测定。2B) 验证阵列生物标志物组(array biomarker panel)。通过cMethDNA测试52个 血清的训练组(training set)。2C)(2B)中数据的箱线图显示，癌症血清表现 比正常对照显著更高的中值累积甲基化(p<0.0001)。

图3描绘了测定验证的步骤。3A)cMethDNA测定在掺加有0至3200 个拷贝甲基化的基因组MDA-MB-453DNA的正常血清样品的六个重复组 中的再现性。盒须图显示了各样品的重复(X-轴)的CMI的中值和范围(Y- 轴)。显示了统计显著性(Mann-Whitney检验)和p值，且表格提供了各测试 的详细内容和％变异系数(CV，频率分布的标准化测量)。3B)cMethDNA 和QM-MSP测定的比较。cMethDNA在各拷贝数下在重复中具有显著更高 的累积甲基化水平(p＝0.0022–0.005)。3C)将QM-MSP和cMethDNA方 法针对来自十二个独立的转移性乳腺癌患者血清样品的每个的等分的多 个血清DNA直接彼此比较。与使用基因特异性未甲基化的DNA作为参考 的QM-MSP方法相比，通过使用基因特异性标准品作为qPCR参考， cMethDNA产生显著更高的RASSF1A甲基化值(p＝0.0233，配对t-检验)。 3D)通过在相同实验室的两个独立的研究者针对一组十三名患者血清样品 评价用户间(inter-user)再现性。使用组内相关系数评价10个基因的组的用 户表现显示高的再现性(0.99；95％CI 0.96-1.00)。

图4示出了通过cMethDNA检测转移性乳腺癌DNA。将来自患有复 发转移性IV期疾病的患者的血清样品分配到训练组和测试组(test set)(X- 轴；分别来自J0425/J0214和J0524试验，图4A-4B)。将来自正常女性的 血清样品随机分配到各组。对各组进行cMethDNA。使用训练组通过接受 者操作者特征(Receiver Operator Characteristic)定义实验室阈值(CMI＝7个 单位；Y-轴)。针对整个组计算CMI(Y-轴；由条高指示)。4C)显示了这些 数据的统计分析。4D)组中的单个标志物的甲基化频率(甲基化定义为MI> 1个单位)。

图5描绘了治疗反应的监测。5A)对在转移性疾病复发时(前)以及在治 疗8-21天后(后)、反应的临床评价前6-10周从乳腺癌患者(n＝28)获得的血 清样品进行cMethDNA。根据个体患者中的CMI绘制数据，所述患者在 8-12周后根据RECIST标准判断为具有或不具有进展性疾病。5B)根据CMI 中变化的百分比绘制相同数据。5C)(a-d)：在治疗过程中的不同的时间点 由cMethDNA评价的患者(ST#)血清的CMI的代表性图。a-b：28天化疗周 期，c-d：21天化疗周期。C：治疗的周期；PD，SD：分别为成像和RECIST 标准评价的进展性或稳定性疾病。

发明详述

本发明的方法采用改进的两步定量多重甲基化特异性PCR(QM-MSP) 方法，其中许多基因从先前仅用于一个基因的量的样品中共扩增，且组合 的甲基化评分可针对基因的组生成。由于本发明的方法中加入STD基因序 列、STD基因引物、和STD基因探针，本发明的cMethDNA方法将多重 灵敏性QM-MSP与增加的定量信号噪声比组合。这些新颖的cMethDNA 方法允许多个基因的组例如从源自待测试的受试者的样品来源的有限量 的DNA共扩增，所述基因的过度甲基化与疾病或生物学状态诸如一种类 型的癌相关。cMethDNA克服了导致缺乏测定稳固性的其他血清MSP方法 的已知限制，如背景中所述的。

本发明方法还可广泛应用于评价来自源自但不限于人或非人哺乳动 物、植物、和昆虫的基因组DNA的过度甲基化的区域的任何数以百计的 基因。例如，在哺乳动物诸如人中，样品可源自体液，包括，例如，选自 以下的一种或更多种：来自待测试的受试者的血液、血清、血浆、导管灌 洗液、乳头抽吸液、淋巴液、脑脊液(CSF)、和/或羊水。在哺乳动物中， 可被检测或监测的与基因的异常甲基化相关的状况，包括，但不限于，全 部种类的癌和肉瘤，包括一种或更多种特定类型的癌症，例如，乳腺癌、 消化道或胃肠道癌诸如结肠癌、食道癌和胰腺癌、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、 子宫内膜癌、前列腺癌、淋巴瘤、造血肿瘤诸如白血病、肾癌、肺癌、支 气管癌、肌肉癌(muscle cancer)、骨癌、膀胱癌或脑癌诸如星形细胞瘤、间 变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、以及神经母细胞瘤、及它 们的转移。本发明的方法可用于测定任何哺乳动物受试者包括例如人、宠 物(例如，狗、猫、白鼬(ferret))、家畜(肉用和产乳用)、和竞赛马的DNA。

从其他的多细胞生物体诸如昆虫和植物的液体获得的样品也可使用 本发明的方法进行基因甲基化状态评价。例如，基因的甲基化状态可用作 在此类受试者中表观遗传状态的可遗传性和灵活性的指示物。因此，基因 甲基化与生物体中不同特征的获得相关联。

本发明的方法将定量多重甲基化特异性PCR(QM-MSP)的原理与针对 感兴趣的TARGET基因特异性工程化的STD基因标准品的添加组合。本 文描述的研究已显示QM-MSP灵敏度是1:100,000且程序的这种组合 (cMethDNA)可检测少至50个甲基化的DNA拷贝。这一结果与具有 1:10,000灵敏度的Q-MSP和具有1:1000灵敏度的常规MSP相比是有利的。 此外，由于在TARGET基因和STD基因引物之间甚至在由多于10⁵倍过量 的一种或另一种DNA组成的混合物中未观察到交叉反应性，反应是特异 性的。

cMethDNA的引物和探针设计。在本发明的方法的实践中，QM-MSP 方法被调整以作为通过以下进行的cMethDNA：在第一轮(预扩增)PCR中 以独立于TARGET基因的甲基化状态的方式利用与单个感兴趣的靶基因 (TARGET基因)以及与TARGET基因的各自的STD基因杂交的外部引物 对的单个组，且在第二轮PCR(实时MSP)中利用与TARGET基因杂交的 内部引物/探针的甲基化状态特异性的组，以及与STD基因DNA杂交的内 部引物/探针的TARGET基因特异性标准品(即STD基因)的组。因此，各 感兴趣的TARGET基因具有一对外部引物和两组内部引物/探针，各内部 组被特别地设计以检测并定量感兴趣的TARGET基因区域或针对各感兴 趣的TARGET基因的匹配的STD基因(图2A)。

多个基因特异性外部引物对可用于在被称为多重PCR中共扩增多个 TARGET基因。在本发明的方法中使用的多个外部引物对在一个反应中可 共扩增TARGET基因和它们各自的STD基因的混合物，使用本发明的方 法，每一对都与待研究的TARGET基因的组的成员及它们各自的STD基 因选择性杂交。外部引物对被设计使DNA扩增独立于DNA序列的甲基化 状态。因此，对于任何给定的基因，通过对TARGET基因特异性的外部引 物的单一组共扩增在外部引物的结合位点内部的该甲基化的TARGET基 因和STD基因DNA序列(并随后使用内部引物通过实时PCR进行定量)。 例如，以下表1和所附序列表中列出的与本发明的方法一起使用的引物的 序列，是与原发性乳腺癌相关的TARGET基因。

表1：用于cMethDNA测定的实施方案的引物序列

将用于甲基化的感兴趣的TARGET基因DNA序列的定量实时PCR和 用于感兴趣的靶内源基因的各自的STD基因的内部PCR引物(cMethDNA 第二轮)设计为与通过第一轮PCR产生的待研究的TARGET基因DNA序 列的组的一个或更多个成员的扩增子选择性杂交，以使用本发明的方法检 测甲基化状态，即，甲基化的(M)CpG残基是否存在于扩增的CpG岛的区 域内。因此，对于在本发明测定中使用的DNA序列的起始组的各成员， 使用各自甲基化特异性内部引物对并使用各自STD基因特异性内部引物 对进行单独的第二轮cMethDNA反应以扩增第一轮PCR中产生的扩增子。 第二轮cMethDNA方法定量来自第一轮中合成的TARGET基因和STD基 因的区域的扩增子。在第二轮实时PCR期间，TARGET基因和各自的STD 基因可在单独孔中被分别测定，或如果内部引物/探针组存在于同一孔中且 针对各自的探针使用两种可区分的可检测的标记物，诸如明显不同的荧光 标记物和猝灭剂(例如6FAM/TAMRA和VIC/TAMRA)，则在一个孔中一起 测定。

本领域技术人员将理解，本发明的方法可用于定量甲基化和未甲基化 的DNA。然而，注意到以下是重要的：因为各种原因，患者中未甲基化的 DNA的量可每日波动，并如此，将甲基化的DNA的量与波动的参考点相 比是少于最佳的。

如本文所用的，术语“STD基因”意指被重组插入载体DNA序列以 匹配感兴趣的靶内源基因(TARGET基因)的寡核苷酸。STD基因的5’和3’ 末端的核苷酸(约20-22bp，与正向和反向外部引物杂交)与感兴趣的内源 性基因组DNA(TARGET基因)序列相同；且STD基因寡核苷酸中5’和3’ 区域之间的间隔碱基的数目与TARGET基因内的感兴趣的区域基本相同。 在实施方案中，为了防止与人DNA交叉杂交，在5’和3’末端之间的间隔 碱基由标准的λ噬菌体DNA组成。在实施方案中，为防止标准品之间的 交叉杂交(例如，在第一轮多重反应期间)，各STD基因型具有特有的λ噬 菌体DNA序列。根据一个或更多个可选的实施方案，间隔碱基包括缺乏 与感兴趣的基因的区域的同源性的任何无关的DNA。这种特征的组合允许 TARGET基因和STD基因在多重反应中使用外部正向和反向引物的单一 组共扩增，并随后在第二轮中通过实时PCR使用特异性引物/探针定量这 些扩增子。

在第一轮多重PCR中，因为如果TARGET基因存在，各外部正向和 反向引物具有与靶杂交的机会与其具有与STD基因(克隆为具有与 TARGET基因相同的5’和3’末端)杂交的机会相等，在扩增的TARGET基 因和STD基因DNA的拷贝的数目之间存在直接关系。因此，对于各 TARGET基因，cMethDNA的设置包括：1)外部引物，正向和反向；2) TARGET基因甲基化状态特异性内部引物，正向和反向；3)STD基因特异 性内部引物，正向和反向；4)匹配#2和#3的各自呈不同的颜色的探针(例 如，6FAM/TAMRA或VIC/TAMRA，或其他组合)。

在cMethDNA的第二轮中，当扩增单一基因或标准品时，用可区别的 荧光标记的探针检测事件，且信号强度随每一轮PCR加倍(以100％效率)。 将在本发明的方法的第二轮cMethDNA中使用的探针设计为与位于各自内 部PCR引物对的结合位点之间的扩增子的区段选择性杂交。适合于在实时 PCR中使用的多核苷酸探针包括，但不限于，生物标记的寡核苷酸探针， 诸如分子信标或TaqMan^TM探针，其包括荧光部分和猝灭剂部分。在分子 信标中，由于探针的杂交产生荧光，所述探针由于生物标记的寡核苷酸的 茎环结构的破坏，使得猝灭剂部分从临近荧光部分处移开。分子信标，诸 如Amplifluor^TM或TriStar^TM试剂和方法是商购可得的(Stratagene；Intergen)。 在TaqMan^TM探针中，由于探针在扩增的轮期间通过Taq DNA聚合酶逐步 降解，逐步产生荧光，所述探针的逐步降解使得猝灭剂部分从荧光部分移 开。扩增发生后，探针被Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性降解， 且可例如通过序列检测器中集成的激光检测荧光。因此，荧光强度与产生 的扩增产物的量成正比。可与本发明的方法一起使用的荧光染料的实例包 括6-FAM、JOE、TET、Cal FLUOR Gold、Cal FLUOR Orange、Cal FLUOR  Red、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、Quasar 570、Quasar 670、ROX、 和德克萨斯红(Texas Red)。可与本发明的方法一起使用的猝灭剂的实例包 括BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、和TAMRA。

在实施方案中，来自探针的荧光可在线性扩增反应期间被检测并测 量，并因此，可用于检测扩增产物的拷贝数。

在一些实施方案中，由于在75-150碱基对范围内的扩增子促进使待进 行的绝对定量成为可能的高效率测定，其通常有利于内部PCR测定。用于 特定基因的STD基因和甲基化的TARGET基因扩增子的拷贝数的定量， 相对于如背景中所述的需要使用相同基因或肌动蛋白的未甲基化的(U) DNA作为参考以评价DNA输入是一种改进。每个各自的STD基因已设计 为具有与特定TARGET基因中感兴趣的区域(源自cMethDNA的多重PCR 的第一轮)类似的结构特征(相同扩增子长度、和在5’和3’末端的同源碱基)。

只要可能，感兴趣的靶基因区域的引物和探针可在具有20％-80％的 G/C含量的区域中选择。具有超过这一含量的G/C含量的区域在热循环期 间可能未良好变性，导致较不有效的反应。此外，富含G/C的序列易受非 特异性相互作用的影响，其可降低反应效率。出于这个原因，通常避免包 含四个或更多个G碱基的串的引物和探针序列。富含A/T的序列需要更长 的引物和探针序列以获得推荐的解链温度(TM)。这对于定量测定而言几乎 不是问题；然而，接近40个碱基对的TaqMan^TM探针可表现较不有效的猝 灭并产生更低的合成产量。

用于测定与原发性乳腺癌相关的TARGET基因的甲基化状态的外部 引物对、内部引物对和基因特异性探针及各自的STD基因的实例列于表1 中。

用于本发明的方法的感兴趣的基因(TARGET基因)的实例包括，但不 限于，AKR1B1、ARHGEF7、COL6A2、GPX7、HIST1H3C、HOXB4、 MAL、RASGRF2、RASSF1A、TM6SF1、TMEFF2、TWIST1、ALX1、 DAB1、DAB2IP、GAS7C、GSTP1、HIN1、HIC1、和RARB2。

用于本文实施例的TaqMan^TM探针包含5’末端的荧光报告物染料，诸 如6-羧基荧光素(6-FAM：发射光λ_max＝518nm)和3’末端的猝灭剂染料， 诸如6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA；发射光λ_max＝582nm)两者。当两种染 料彼此接近时，猝灭剂可猝灭报告物荧光，其发生在完整的探针中。其他 报告物染料包括但不限于VIC^TM和TET^TM，且这些可与6-FAM结合使用 以通过定量实时PCR共扩增基因。还可使用具有或不具有猝灭剂部分的其 他报告物构建体。

本发明的方法可用于使用非常少量的DNA评价多个基因的甲基化状 态。在多个基因中的过度甲基化的累积评分与单个基因甲基化标志物的值 相比更好地区分体液样品中的正常或良性肿瘤与恶性肿瘤。使用本发明的 cMethDNA方法，以可转移到更大的临床环境的方式客观地限定正常/异常 DNA序列过度甲基化的范围是可能的(图4)。本发明的方法还可用于检查 良性状况中的累积的过度甲基化，并作为状况诸如与DNA过度甲基化相 关的各种癌症及其转移的预测物。本发明的方法还可预测与癌症不相关的 状况，诸如先兆子痫或子痫、病毒性疾病(例如，疱疹病毒、乙型肝炎病毒)、 神经退行性紊乱和精神紊乱。

根据实施方案，引物延伸反应是线性扩增反应，其中经过一些循环进 行引物延伸反应，并检测生成的线性扩增产物。

由于本发明的方法的灵敏度，将第一扩增产物任选地从约1:5至约 1:10⁵稀释，并且任选地单独的等分的第一扩增产物进一步经受如本文描述 的cMethDNA。

在如本发明的方法中使用的实时PCR中，在内部扩增引物对的第二引 物的存在且荧光探针允许第二扩增产物生成的条件下，用内部扩增引物对 的至少第一引物来扩增一个或更多个等分(通常稀释)的第一扩增产物，所 述内部扩增引物对可与第一扩增产物中的一个或更多个扩增子选择性地 杂交。同时，对感兴趣的TARGET基因的STD基因特异性的至少一个或 更多个内部引物对还可在对STD基因特异性的第二荧光探针的存在下选 择性地杂交STD基因。来自第二扩增产物的荧光的检测提供了用于实时检 测第二扩增产物的生成及用于计算甲基化的TARGET基因和相关的STD 基因的量的工具。

应该认识到，作为术语在本文使用的扩增“引物对”要求通常被称为 正向引物和反向引物的物质，其使用熟知的且常规的以及如本文所述的方 法来选择使得可从其生成扩增产物。

如本文使用，短语“允许扩增产物生成的条件”或“允许线性扩增产 物生成的条件”意指其中待进行扩增反应的样品包含用于发生扩增反应的 必需组分。此类条件的实例提供于实施例1中并包括，例如，适当的缓冲 能力和pH、盐浓度、如果对特定聚合酶是必需的情况下金属离子浓度、允 许引物或引物对与模板核酸分子的选择性杂交的适当的温度、以及允许聚 合酶活性、和引物的解链或引物延伸或从模板或在相关的情况下(where  relevant)从形成二级结构诸如茎环结构产生的扩增的温度的适当的循环。 此类条件及用于选择此类条件的方法是本领域常规并熟知的(参见，例如， Innis等人，"PCR Strategies"(Academic Press 1995)；Ausubel等人，"Short  Protocols in Molecular Biology"第4版(John Wiley和Sons,1999)；“A novel  method for real time quantitative RT-PCR”Gibson U.E.等人Genome Res(1996) 6:995-1001；“Real time quantitative PCR”Heid C.A.等人Genome Res(1996) 6:986-994)。

如本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”、和“核酸分 子”并通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链的或双链的、合成 的、或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化)，其可包含天然、非天 然或改变的核苷酸，以及其可包含天然、非天然或改变的核苷酸间连键， 诸如氨基磷酸盐连键或硫代磷酸酯连键、而不是未修饰的寡核苷酸的核苷 酸之间发现的磷酸二酯。通常优选的是核酸不包括任何插入、缺失、倒位、 和/或取代。然而，在一些情况下，如本文所讨论的，核酸包含一个或更多 个插入、缺失、倒位、和/或取代可以是适合的。

在实施方案中，本发明的核酸是重组体。如本文所用的，术语“重组 体”是指(i)通过将天然的或合成的核酸区段与核酸分子连接的活细胞外构 建的可在活细胞中复制的分子，或(ii)由以上(i)中描述的那些分子的复制产 生的分子。对于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。

在本发明的实施方案中用作引物的核酸可使用本领域已知的程序基 于化学合成和/或酶促连接反应来构建。参见，例如，Sambrook等人(编著), Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,New York(2001)以及Ausubel等人，Current Protocols in  Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY (1994)。例如，核酸可使用天然存在的核苷酸或旨在增加分子的生物稳定 性或在杂交后增加双链体的物理稳定性的不同修饰的核苷酸(例如，硫代磷 酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成。可用于生成核酸的修饰的核苷 酸的实例包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿 嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲 基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖 基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基 鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、 3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基 氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷 (beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2- 甲基硫代-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿 嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、 4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧 丙基)尿嘧啶、和2,6-二氨基嘌呤。可选地，一个或更多个本发明的核酸可 购自公司，诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen (Houston,TX)。

如本文所用的术语“分离并纯化的”意指基本上不与其他蛋白或多肽 缔合的蛋白，例如，作为已通过使用抗体或其他方法从细胞及其他污染物 分离的天然存在的蛋白，或作为重组宿主细胞培养物的纯化产物。

如本文所用的术语“生物活性”意指具有天然存在的分子的结构、调 控或生物化学功能的酶或蛋白。

如本文所用的，术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括，但不限于， 啮齿目(order Rodentia)的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目(order  Logomorpha)的哺乳动物，诸如兔。优选的是，哺乳动物来自食肉目(order  Carnivora)，包括猫科(Felines)(猫(cats))和犬科(Canines)(狗(dogs))。更优选 的是，哺乳动物来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛(Bovines)(牛(cows)) 和猪(Swines)(猪(pigs))，或是奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马 (Equines)(马(horses))。最优选的是，哺乳动物是灵长目(order Primates)、新 世界猴(Ceboids)、或Simoids(猴)，或是类人猿目(order Anthropoids)(人和 猿)。特别优选的哺乳动物是人。

本领域普通技术人员将理解，本发明的方法可用于诊断、预测、及监 测任何疾病或生物状态的治疗，其中基因的甲基化与受试者中的此类疾病 或生物状态相关。在一些实施方案中，疾病状态是癌症。

根据本发明的一个或更多个实施方案，将理解，可使用本文提供的方 法进行诊断的癌症类型不必然被限制。对于本文的目的，癌症可以是任何 癌症。如本文所用的，术语“癌症”意指，由可通过淋巴系统或血流扩散 至身体其他部分的异常和不受控制的细胞分裂引起的任何恶性生长或肿 瘤。

癌症可以是转移性癌症或非转移性(例如，局部的)癌症、侵袭癌症 (invasive cancer)或原位癌症。如本文所用的，术语“转移性癌症”是指其 中癌症的细胞已转移的癌症，例如，癌症被表征为癌细胞转移。转移可以 是局部转移或远端转移，如本文所述的。

如本文所用的术语“治疗”和“预防”以及由此产生的词，不必然意 指100％或完全治疗或预防。相反，存在本领域普通技术人员认识到作为 具有潜在的益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明 的方法可提供诊断、分期、筛选、或其他患者管理，包括治疗或预防哺乳 动物中的癌症的任何水平的任何量。此外，由本发明的方法提供的治疗或 预防可包括待治疗或预防的疾病例如癌症的一种或更多种状况或症状的 治疗或预防。另外，对于本文的目的，“预防”可包括延迟疾病、或其症 状或状况的发作。

如本文使用的涉及核酸的“互补”或“互补的”可意指在核酸分子的 核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦 碱基配对。

如本文所用的，术语“选择性杂交”或“选择性地杂交”是指在中度 严格或高度严格条件下杂交使得核苷酸序列与选择的核苷酸序列但不与 无关的核苷酸序列缔合。通常，作为与选择的核苷酸序列选择性杂交的探 针或引物有用的寡核苷酸长度至少约15个核苷酸，通常长度至少约18个 核苷酸、且特别地约20个核苷酸或长度更长。允许选择性杂交的条件可 凭经验确定，或可例如基于以下判断：杂交寡核苷酸和其与之杂交的序列 的相对GC:AT含量，杂交寡核苷酸的长度以及，如果有的话，在寡核苷酸 和其与之杂交的序列之间的错配的数目(参见，例如，Sambrook等人， "Molecular Cloning:A laboratory manual”(Cold Spring Harbor Laboratory  Press 1989))。

如本文所用的短语“可比较的正常DNA样品”意指待测试甲基化状 态的诸如在植物或昆虫中的多个基因组DNA序列与来自同一种、科等的 “正常”生物体的相同基因的基因组DNA序列的组匹配，用于比较的目 的。例如，与正常样品相比，测试样品中的甲基化水平的大量累积增加或 减少(例如，测试DNA的组中的肿瘤标志物的累积发生率与可比较的明显 正常的样品中累积发现的累积发生率相比)是待测定状况的存在的可靠的 指示物。

如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下使用的“相同 (identical)”或“同一性(identity)”可意指序列具有跨指定区域相同的残基 的指定的百分比。百分比可通过以下计算：最佳比对两个序列、跨指定的 区域比较两个序列、确定相同残基在两个序列中出现的位置的数目以产生 匹配位置的数目、将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数目、并将 结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在其中两个序列是不同的长度 或比对产生一个或更多个交错末端以及比较的指定区域仅包括单一序列 的情况下，单一序列的残基包括在分母中，而非计算的分子中。当比较DNA 和RNA时，可认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等价的。同一性可手动或通 过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST 2.0来进行。

如本文所用的“探针”可意指能够通过一种或更多种类型的化学键， 通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成与互补序列的靶核酸结合的寡 核苷酸。取决于杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺乏完全互补 性的靶序列。可存在任何数目的碱基对错配，其将干扰本文描述的靶序列 和单链核酸之间的杂交。然而，如果突变的数目是如此之大，使得杂交甚 至在最不严格的杂交条件下也不能发生，则该序列不是互补的靶序列。探 针可以是单链的或部分单链的和部分双链的。探针的链型(strandedness)受 靶序列的结构、组成和性质影响。探针可诸如用链霉亲和素复合物可随后 与其结合的生物素直接标记或间接标记。

如本文所用的术语“光学可检测的DNA探针”意指可作为分子信标 或寡核苷酸探针的包含荧光部分或其他可检测标记物、具有或不具有猝灭 剂部分的寡核苷酸探针。

如本文所用的“基本上互补”可意指第一序列与第二序列的互补序列 在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、 18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、 40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、 90个、95个、100个或更多个核苷酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或意指两个序列在严格 杂交条件下杂交。

如本文所用的“基本上相同”可意指如果第一序列与第二序列的互补 序列基本上互补，则第一序列与第二序列在8个、9个、10个、11个、12 个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22 个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60 个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个 核苷酸或氨基酸，或关于核酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。

根据本发明的另一个实施方案，将理解术语“生物样品”或“生物流 体”包括，但不限于，来自活的或以前活的患者或哺乳动物的任何量的物 质。此类物质包括，但不限于，血液、血清、血浆、尿液、细胞、器官、 组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑膜组织、软骨细胞、滑膜巨噬细胞、 内皮细胞、及皮肤。在一个优选的实施方案中，流体是血液或血清。

在实施方案中，本发明的方法使用原发性乳腺癌作为实例进行说明。 在乳腺癌中，样品可从如下的此类组织来源收集：导管灌洗液和乳头抽吸 液，其中DNA量是有限的，例如低至约50至约100个细胞，以及在较大 样品诸如核心活组织检查(core biopsies)的福尔马林固定石蜡包埋的切片中 收集。最大输入DNA约为600ng。使用本发明的cMethDNA方法，其中 DNA是有限的或当需要极度灵敏度时的样品中AKR1B1、ARHGEF7、 COL6A2、GPX7、HIST1H3C、HOXB4、MAL、RASGRF2、RASSF1A、 TM6SF1、TMEFF2、TWIST1、ALX1、DAB1、DAB2IP、GAS7C、GSTP1、 HIN1、HIC1、和RARB2基因中的过度甲基化CpG岛的水平和发生率， 可被共扩增用于检测受试者中原发性乳腺癌的进展的目的。对样品中这些 基因区域的累积甲基化的评分给出检测原发性乳腺癌的高灵敏度和特异 性以及相对于正常组织在肿瘤中的启动子过度甲基化的总体指示。本发明 的方法被设计以评价包含极度有限量的DNA样品，诸如来自导管灌洗或 乳头抽吸的那些样品。在该过程中，已评价了原发性乳腺癌中基因过度甲 基化的程度，且该方法容易适合于临床测试。尽管该技术参考乳腺组织来 说明，但该技术可用于评价宽范围组织内的基因(例如，基因启动子)过度 甲基化。

cMethDNA可在单独的微管、96孔平台以及384孔平台或更大平台中 进行，且可用于高通量如果cMethDNA被设置用于更大环境，诸如数字 PCR。cMethDNA技术适用于新鲜或冷冻导管灌洗材料、血浆、血液、血 清、乳头抽吸液、CSF、和细针抽吸物。样品DNA的其他来源也适合于 cMethDNA监测，包括但不限于支气管洗液、口腔洗液、前列腺液、和尿 液。与适合于通过本发明监测的癌症无关的状况包括但不限于子痫和先兆 子痫。

比评价单个基因的甲基化状态提供更多信息的是，累积的多基因启动 子过度甲基化的研究指示正常和恶性组织之间的显著差异(图2-4)。

本发明还提供了用于筛选基因的甲基化或治疗应用的试剂盒。对于筛 选应用，此类试剂盒可包括以下的任一种或全部：测定试剂、缓冲液，且 对于每个TARGET基因，cMethDNA试剂盒包括：1)外部引物，正向和反 向；2)TARGET基因甲基化状态特异性内部引物，正向和反向；3)STD基 因特异性内部引物，正向和反向；4)匹配#2和#3的各自呈不同的颜色的探 针(例如，6FAM/TAMRA或VIC/TAMRA，或其他组合)等。

此外，试剂盒可包括包含用于实践本发明的方法的说明(即，方案)的 说明性材料。而说明性材料通常包括书面或印刷的材料，它们不限于此。 能够存储此类说明并将其传递至最终用户的任何介质都被本发明所包含。 此类介质包括，但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯 片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可包括提供此类说明性材料 的互联网网站的地址。

实施例

用于测定发展的患者和血液收集。在Johns Hopkins，Baltimore MD在 疾病复发的诊断的时间从患有转移性乳腺癌的女性，以及从健康对照收集 全血。收集全部样品，具有来自机构审查委员会的适当的批准。

用于处理无细胞血清DNA用于甲基化阵列的方法。全血被收集在SST  Vacutainer管(BD Diagnostics,Franklin Lakes,NJ；#367988)中，允许凝结并 根据制造商的说明在2小时内分离。在48℃下通过用12ml包含以下的缓 冲液连续颠倒将血清(6ml)消化过夜：1％SDS、100mM Tris pH 8.5、2.5mM  EDTA、和120μl 2％w/v蛋白酶K(Roche Applied Sciences,Indianapolis, IN)。此后，每日三次添加120μl 2％蛋白酶K持续消化总的72小时。将 样品离心10分钟，并以等体积的温(50℃)的Tris缓冲液饱和的苯酚/氯仿 pH 8.0抽提上清液。使用相位锁定重凝胶(Phase Lock Heavy Gel)(5Prime, Gaithersburg,MD)分离水层。在糖原和NaCl的存在下，DNA用乙醇沉淀， 在70％乙醇中洗涤，并重悬于1mM Tris，pH 8。依照制造商的说明，使 用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research,Orange,CA,USA)进行亚硫酸氢 钠转换。将洗脱的DNA在JHU DNA Microarray Core中用Illumina Infinium 人甲基化27珠芯片(Illumina,Inc.San Diego,CA；WG-311-1202)来处理。 GenomeStudio软件(Illumina)用于分析阵列结果。根据制造商，将甲基化水 平定义为从0-1(分别地低至高)范围的β-值(与％甲基化相似)。在对错误发 现进行Benjamini和Hochberg校正后计算Diff评分(p＝0.05)。Diff评分是 p-值的转换，其基于参考组对比较组的平均信号之间的差异提供p-值的定 向性(directionality)。公式是：Diff评分＝10*sgn(μcond-μref)*log10p；对于 0.05的p-值，Diff评分＝±13；对于0.01的p-值，Diff评分＝±22；对于 0.001的p-值，Diff评分＝±33；p＝10'(Diff评分*sgn(μcond-μref)/10)。

甲基化阵列分析。将来自患有转移性乳腺癌的女性或健康志愿者的6 ml血清用蛋白酶K消化，提取DNA，并如说明的用亚硫酸氢盐处理(EZ  DNA甲基化试剂盒，Zymo Research,Orange,CA)。处理亚硫酸氢盐转换的 DNA用于Infinium人甲基化27珠芯片(Illumina,Inc.San Diego,CA； WG-311-1202)。将甲基化测量为从0-1(分别地低至高)范围的β-值。使用 GenomeStudio(Illumina)完成差异性甲基分析。数据已存放在基因表达综合 (Gene Expression Omnibus，GEO)库中。

无细胞循环DNA的纯化。将外部基因特异性标准品(50个拷贝 TARGET基因/感兴趣的基因。在该实施例中，使用12个感兴趣的基因) 和载体DNA/RNA(1μg鲑鱼精和3μg tRNA)添加至各血清样品(300μl)， 并提取无细胞DNA。评价三种血清DNA纯化试剂盒：QiaAmp MiniElute  Virus Spin Kit(ME；Qiagen,Valencia,CA)、QiaAmp UltraSens Virus Kit(US； Qiagen)、和Quick-gDNA MiniPrep(ZR；Zymo Research,Orange,CA)。根据 制造商的方案将提取的DNA用亚硫酸氢钠修饰、柱纯化并洗脱在15μl 水中。

处理血清DNA用于cMethDNA测定。尽管被修饰用于cMethDNA， 基本上根据制造商的方案使用MiniElute Virus Spin Kit(Qiagen目录号 57704)纯化血清。对于每一个新的试剂盒，制备蛋白酶的原液(1.4ml AVE 至蛋白酶小瓶、混合、等分并储存于-20℃)，和载体RNA的原液(在310μg 载体RNA中的310μl AVE、溶解、以等分@1μg/ml冷冻在-20℃；使用 5.6μg/样品)。在室温下进行全部步骤，包括离心；将缓冲液AVE平衡至 室温用于洗脱步骤；将恒温烘箱预热至56℃；制备载体RNA的工作稀释 液(每个样品＝294μl缓冲液AL+5.6μl在缓冲液AVE中的载体RNA)。然 后进行以下方案：将约37μl Qiagen蛋白酶(在AVE中制备并存储于-20℃ 冰箱中)转移进2ml微量离心管中，并添加约300μl血清并混合。然后添 加约300μl包含5.6μg载体RNA(5.6μl)的缓冲液AL并混合。临使用前 将冷冻的STD基因混合液原液解冻并将约2μl的STD基因原液10³/μl与 198μl稀释缓冲液(1X MSP缓冲液、50μg/ml tRNA、50μg/ml鲑鱼精DNA) 混合。然后将约5μl稀释的STD基因混合物添加至血清稀释液中。在本 实施例中，12个独特的STD基因，各STD基因总计50个拷贝数存在于 最终的血清混合物中。然后将其混合并在预热的架子上在56℃下温育约 15分钟，且然后短暂离心。添加约375μl无水乙醇并通过脉冲涡旋混合 15秒。将裂解物与乙醇在室温(不超过25℃)下温育5分钟，并然后短暂离 心。然后将全部裂解物转移至QIAamp MinElute柱上并以8000rpm离心约 1分钟并然后转移至新的收集管中，丢弃滤液。将柱用500μl缓冲液AW1 洗涤，以8000rpm离心1分钟并转移至新的收集管中。将柱用500μl缓冲 液AW2洗涤，并以8000rpm离心约1分钟并随后转移至新的收集管中。 将柱用500μl无水乙醇洗涤，以8000rpm离心1分钟并转移至新的收集管 中。空柱以全速(13,000rpm)离心约3分钟并转移至新收集管中。将约22μl 缓冲液AVE直接添加至膜的中央，并在室温下温育约5分钟，并然后以全 速离心1分钟，并重复且汇集。将内容物转移至500μl微量离心管中用于 亚硫酸氢钠处理并保持在冰上。

亚硫酸氢钠介导的血清DNA的转换。将约7.5μl M-稀释缓冲液(Zymo  Research)添加至DNA样品(体积是～50μl)，并在42℃下温育20-30分钟， 然后短暂离心。在制备CT转换试剂后(对于各样品：水＝71.4μl、M-稀释 缓冲液＝17.6μl、CT颗粒转化试剂(Zymo Research)＝54mg；添加约750μl  ddH₂O和185μl M-稀释缓冲液至1.7ml包含567mg CT试剂的棕色小瓶 中，其足够用于11个血清DNA样品。溶液在黑暗中在室温下旋转10分 钟以溶解。将约97.5μl的CT转换试剂与样品彻底混合，并短暂涡旋，具 有约150μl的最终体积。将DNA溶液在PCR机器中温育，以热盖循环(95℃ 30秒，50℃1小时)的16个循环。将溶液保持在4℃下并短暂离心。使用 Zymo Spin Clumn(IC)将DNA用600μl M-结合缓冲液(Zymo Research)清洗 在收集管中，并以13000rpm离心30秒，并更换为新的收集管，用M-洗 涤缓冲液(Zymo Research)洗涤，并以13000rpm离心30秒。将200μl M- 脱磺酸基缓冲液(Zymo Research)添加至柱并让混合物置于室温30分钟，然 后以13000rpm离心30秒并重复。将柱转移至新收集管中，将15μl的70℃ 水添加至柱，并允许在室温下放置5-10分钟，随后离心以回收DNA。将 样品放置在冰上，并然后用于使用整个样品进行多重PCR。

cMethDNA测定。cMethDNA测定引物/探针被设计紧邻(100bp)由阵 列分析鉴定的甲基化的阵列位点。取决于引物/探针的期望的解链温度和该 区域中CG二核苷酸的密度，cMethDNA测定引物(两个)和探针(一个)共同 包含约9-11个CpG二核苷酸(范围从7-12个)；还存在独立的C残基(约8 个；范围从6-10个)以确保仅与亚硫酸氢钠转换的DNA选择性杂交。 cMethDNA测定设置包括：1)与感兴趣的基因大小相同的一组基因特异性 参考DNA(STD基因)，其具有与感兴趣的各内源性DNA靶基因(TARGET 基因)相同的5’和3’末端和内部λ噬菌体序列(对于各标准品类型是特有 的)；2)一对外部引物(正向和反向)，其可独立于DNA甲基化与TARGET 基因和STD基因DNA两者杂交；3)一对用于感兴趣的TARGET基因的甲 基化特异性基因特异性内部引物，正向和反向；4)一对STD基因内部引物， 正向和反向；以及5)可与TARGET基因和STD基因DNA分别地杂交并 呈可区别的颜色的探针(例如，6FAM/TAMRA或VIC/TAMRA)。

进行两个顺序的PCR反应。cMethDNA PCR反应#1(多重反应)：在多 重反应中，使用对感兴趣的甲基化区域侧翼的序列特异性的“内部”引物 扩增DNA。在本实施例中，从≥150pg DNA模板(50个拷贝的基因组DNA) 中共扩增直至12个基因/50μl反应。从300μl包含50个拷贝的标准DNA 的血清中产生的DNA在亚硫酸氢盐转换后进行处理。

最终50μl反应在16.6mM NH₄SO₄、67mM Tris pH 8.8、6.7mM  MgCl₂、1.25mM dNTP(每一个；Denville Scientific,Metuchen,NJ)、10mM β-巯基乙醇、0.1％DMSO、2ng/ul的各引物和10U/50μl Platinum Taq聚合 酶(Invitrogen)中进行。热循环仪设置为95℃进行5分钟，随后是95℃进行 30秒、56℃进行45秒、以及72℃进行45秒的26个循环，然后在72℃下 最终延伸7分钟。完成PCR后，在进行定量实时PCR测定之前，通过添 加200μl 1X多重稀释缓冲液[包含1X MSP缓冲液、50μg/ml鲑鱼精DNA (Invitrogen)、50μg/ml tRNA(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)]以1:5 稀释反应混合物。将反应混合物冷冻贮存在-20℃。

表2：用于PCR反应#1的反应条件

cMethDNA PCR反应#2(实时反应)：对于实时PCR反应，使用双色实 时PCR根据绝对定量方法定量来自反应#1的扩增子。各TARGET基因及 其配对的参考STD基因被独立地但在相同孔中测定。在每一个反应中使用 对照以确保针对靶或参考的特异性杂交，以及不存在污染。对于 cMethDNA，使用以下公式计算每一个基因的甲基化指数(MI)： 累积甲基化指数(CMI)被计算为全部基 因的MI的和。

实时PCR反应在包含以下的20μl中进行：16.6mM NH₄SO₄、67mM  Tris pH 8.8、6.7mM MgCl₂、10mMβ-巯基乙醇、0.1％DMSO、300nM ROX (Invitrogen/Life Technologies,Grand Island,MY)、200μM dNTP(Denville  Scientific)、10μg/ml tRNA(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)、1.0U  RAMP Taq聚合酶(Denville Scientific；#CB4080-9)、800mM各正向引物和 反向引物(Life Technologies/Foster City,CA)、和200nM的各水解探针(标记 有6FAM/TAMRA或VIC/TAMRA；Applied Biosystems/Life Technologies)。

对于每一个样品或多重反应对照，以最终1:500或1:50,000稀释(以1X  MSP稀释缓冲液来稀释：16.6mM NH₄SO₄、67mM Tris pH 8.8、6.7mM  MgCl₂、10mMβ-巯基乙醇、0.1％DMSO、50μg/ml鲑鱼精、50μg/ml tRNA) 测试4μl。

为了制备各基因的标准曲线，制备包含相等拷贝数的TARGET基因和 STD基因(如通过实时PCR中重叠扩增曲线确定的)的等分原液。对于每一 个测定，曲线DNA以1:10在鲑鱼精DNA(50μg/ml)中连续稀释7个log， 然后使用后丢弃。通过实时在一式两份的孔中测定4微升。为了制备曲线 DNA的原液，使用多重PCR反应方案、10ng模板DNA(通过SssI处理细 胞系DNA制备的普遍甲基化的DNA，或包含标准品的质粒DNA)、使用 4ng正向及反向引物独立地扩增每一个基因的TARGET基因和STD基因 模板。将这些原液存储于-80℃并是无限期稳定的。

多重扩增子的绝对定量使用ABI 7500软件根据来自制造商的具有若 干修改的说明进行。当使用自动基线设置时，手动设置阈值至相同设置用 于全部样品、TARGET基因或STD基因(例如通常ΔRn在0.02和0.04之 间)，然后从对于最集中的点(the most concentrated point)200,000,000拷贝/ 孔开始，将标准曲线连续稀释液分配拷贝数值。从靶和参考DNA的曲线 外推样品值，且只有样品值落入标准曲线的范围内才被接受。如以上描述 的计算每一个基因的甲基化指数(MI)。

如果没获得TARGET基因和STD基因DNA曲线的理想的重叠，且如 果平均ΔCt是<1.0个循环，则接受该曲线并然后以以下方法反计算 (back-calculated)拷贝数：1)基于曲线的全部点(7个log)的平均ΔCt计算倍 数差异(Δ1个循环＝2-倍)。2)将最集中的样品的值除以该差异。实例：如 果ΔC_t STD基因-TARGET基因＝1.5个循环，则2^1.5＝2.828，且200,000,000 个拷贝/2.828倍＝70,700,000个拷贝。分配STD基因＝70,700,000个拷贝且 TARGET基因＝200,000,000个拷贝/孔。

表3：用于PCR反应#2的反应条件

使用Applied Biosystems(ABI)MicroAmp Fast Optical 96Well Plate (#4346906)与ABI Fast 7500实时PCR系统。通常将标准曲线样品置于A 行第1-12个孔，和B行第1-2个孔中。B行第3个孔包含来自多重反应的 NTC(无模板对照)，第4个孔包含来自实时反应混合物的NTC，第5个孔 包含来自多重的STD混合物(无靶DNA)，以及第6个孔包含普遍甲基化的 基因组DNA(无STD参考DNA)。剩余孔被样品占用。

统计分析。甲基化阵列分析在GenomeStudio软件(Illumina)内进行。 使用GenomeStudio计算探针检测p-值。

在对错误发现进行Benjamini和Hochberg校正后通过GenomeStudio 计算Diff评分。cMethDNA数据分析使用GraphPad Prism版本5.0 (GraphPad Software,San Diego,CA)来进行。盒须图(Box and Whiskers plot) 通过曼-惠特尼检验来分析。使用接收者操作特征(ROC)曲线(receiver  operating characteristic curve)分析以确定训练组中的实验室阈值最大灵敏 度和特异性。使用Wilcoxon符号秩检验分析处理前和处理后甲基化水平的 显著性。

实施例1

最近，原发性乳腺肿瘤的全基因组DNA甲基化阵列和亚硫酸氢盐处 理的DNA测序已导致了从由基因表达谱鉴定的“固有亚型(intrinsic  subtypes)”中鉴定出新颖的亚组(Breast Cancer Res.2007；9:R20； Pathobiology.2008；75:149-52；Anal Cell Pathol(Amst).2010；33:133-41； Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2007；16:1812-21；J Epidemiol.2012； 22:384-94)。作为综合分析乳腺癌患者中循环DNA的甲基化谱的第一步， 使用Infinium人甲基化27珠芯片阵列(Illumina,Inc.)对六个复发性转移性 乳腺癌血清、五个正常血清、和二十个正常白细胞(四个集合(pool)，每个 集合5个个体)的发现组进行甲基化阵列分析(表1)。使用26759个探针(97％ 的阵列；探针检测p-值<0.0001)进行的非监督聚类分析发现，癌症与正常 血清聚类为两个单独的组，指示基因组甲基化的独特谱的存在(图1A)。为 了鉴定基因座展示频率、癌症特异性甲基化变化，根据图1B概述的方案 将癌症血清与正常血清进行比较。以以下选择探针：1)所有个体样品中的 最可再现的表现(癌症和正常血清；探针检测p-值<0.00001；97％， 26759/27578个探针)；2)在来自癌症对比正常对照的血清中≥2-倍更多的 甲基化(902/26759个探针)；3)在来自乳腺癌(n＝89)的组织对比正常对照 (n＝21)的组织中≥1.5-倍更多的甲基化，数据来自我们以前的研究(11)，以 及白细胞DNA(n＝4个集合)(232/902个探针)；4)个体正常血清样品(n＝5) 和个体正常乳腺组织样品(n＝15)中低甲基化(≤0.15β-值甲基化)(172个 探针)；以及最后，为了优化乳腺癌的全部甲基化亚型之间的灵敏度，我们 选择13个基因启动子定位的标志物，所述标志物在我们的数据库中在30％ 或更多的乳腺癌中被甲基化。172个癌症特异性CpG探针经受监督分层分 析；这将癌症与正常血清和白细胞DNA样品区分开(数据未显示)。图1C 中的散点图(左图)显示在正常血清对比癌症血清中172个探针的平均β甲 基化值，且在图1C(右图)上，癌组织对比正常组织；粉红色点指示选择用 于验证的13基因的位置，如表1中描述的。在散点图中，由红色线指示 ±1.5倍水平，中心线指示相同甲基化水平。

选择的13个探针中的七个也是存在于我们先前鉴定的候选复发性标 志物中的那些(AKR1B1、ALX1、COL6A2、GPX7、HOXB4、RASGRF2、 TM6SF1)，与乳腺癌中的差的结果相关，提供增强这些标志物对转移进程 提供生物输入的可能性。然后在用于阵列分析的患者(n＝5)和正常血清(n＝6) DNA样品中分别验证13个探针的甲基化β值和频率(数据未显示)。与正 常血清相比，观察到转移患者血清中这些探针以不同的频率被不同地过度 甲基化，并作为组，可能提供用于乳腺癌的泛甲基化标志物组。

实施例2

循环肿瘤DNA中的标志物检测频率。在本实施例中，与正常血清相 比，在癌症血清中过度甲基化的十四个基因被测试—十三个是由阵列分析 鉴定的新颖的基因(HOXB4miRNA、RASGRF2、ARHGEF7、AKR1B1、 TMEFF2、TM6SF1、COL6A2、GPX7、HIST1H3C、ALX1、DAB1、DABIP2、 和GAS7)以及基于我们先前的经验确定的RASSF1A。然后以cMethDNA 测定验证了用于阵列分析的患者和正常血清DNA样品中14个基因的甲基 化频率。基因的组通过以下来精制：从组中去除具有高背景或低频率的基 因(图2B)，特别地消除显示超过7个单位(设置用于正常对照血清中“正常” 的阈值)的甲基化水平的ALX1、DABIP2、和DAB1，并基于其在癌症血 清中的低甲基化频率(小于20％)消除GAS7。然后，在训练组样品中评价 最终的十个基因的组(n＝52，表S5)。如图2C中所示，统计学评价显示了 累积甲基化水平在患有转移性乳腺癌患者中一致性地高，且在未患有癌症 的女性中是可忽略的(中值CMI分别＝117.3和0.04；p<0.0001，曼惠特尼)。

实施例3

cMethDNA测定、分析的线性度和灵敏度的技术评价。为建立测定线 性度和灵敏度，进行一系列实验。通过测试三种不同的血清DNA提取方 法(UltraSens Virus Kit，Qiagen；MiniElute Virus Kit，Qiagen；和Quick-gDNA  Prep Zymo Research)建立分离微量循环DNA的最佳方法。将来自单个正常 供体的血清的主混合物(master mix)(300μl血清/测定点)掺加有从 MDA-MB-453乳腺癌细胞系提取的生理范围(0个、50个、200个、800个 或3200个拷贝)的完全甲基化的DNA。针对每一种方法计算每一个重复 (5-6个重复)的变异系数(图3A)。通过全部三种方法的掺加的基因组DNA 的50个拷贝的最低水平是可检测的，且在正常血清中观察到甲基化的 DNA的可忽略水平。然而，测试的三种试剂盒(图3A)中，MiniElute Virus  Spin Kit方法显示最高的再现性，如根据最小测定间(inter-assay)变异系数 (对于50个、200个、800个或3200个甲基化的DNA拷贝，CV分别＝29％、 12％、4.6％、2.5％)和在六个测定的每一个中针对每个基因扩增的掺加的 DNA的全部水平判断的。本领域普通技术人员将理解，本领域中已知的任 何DNA提取方法都可与本发明的方法一起使用。

实施例4

测定间测试(Intra-Assay Testing)。cMethDNA测定是在我们实验室发明 的并被我们实验室及其他实验室广泛使用的QM-MSP方法的优化。与添加 至血清用作cMethDNA测定中的内部标准对照的参加的标准品相比， QM-MSP使用各基因的游离循环的未甲基化的DNA作为内部参考。为了 证明在cMethDNA测定对比QM-MSP方法中癌症检测的灵敏度的改进， 通过两种方法平行测试等分的源自50-3200个拷贝的掺加的DNA(图4A 中所示)的多重反应(图4B)。在掺加的甲基化的DNA的全部水平下， cMethDNA的累积甲基化水平显著更高(50个拷贝，p＝0.0047；200个拷 贝，p＝0.0048；800个拷贝，p＝0.005；3200个拷贝，p＝0.0022，曼惠特 尼)。为了证实患者样品中的这些发现结果，通过MethDNA和QM-MSP 针对甲基化的RASSF1A基因平行测试来自复发性转移乳腺癌患者的血清。 与QM-MSP相比，用cMethDNA检测的过度甲基化的RASSF1A的信号幅 度和频率两者更高(p＝0.0233，配对t-检验)(图4C)。

实施例5

评分者间再现性。通过两个用户获得的cMethDNA测定值在测试由每 一个用户独立地纯化并测定的癌症血清(n＝13)后进行比较。使用组内相关 系数评价的评分者间再现性(0.99；95％CI 0.96-1.00)显示了用户之间的高 水平的再现性(图4D)。

实施例6

转移性乳腺癌患者的血清中甲基化的DNA的检测—测定特异性。为 了建立正常血清中的甲基化阈值以设置用于转移性乳腺癌的最佳测定灵 敏度和特异性标准，使用由患有转移性乳腺癌的患者(n＝24)和未患有癌症 的女性(n＝28，平均年龄)组成的52个血清样品的训练组。接收者操作特征 (ROC)分析鉴定了患者训练组中具有最大灵敏度和特异性两者的6.9个单 位的阈值；测定特异性是96.4％(95％CI＝81.7-99.9％)，灵敏度是91.7％ (95％CI＝73.0-99.0％)，AUC＝0.950(95％CI＝0.873-1.023；p<0.0001)， 分类精度是94％(49/52)，及似然比＝25.7(图5)。在这些实例中，存在关 于任何单一基因的甲基化的高平均频率(42％，范围从8％-78％；图5)。使 用非配对t检验并对不等方差进行校正(p＝0.643)或通过在全部四个组之 间的单因素ANOVA(p＝0.8988)，将正常女性中的最年轻的四分位数与最年 老的四分位数进行比较，在正常女性(n＝55)的循环游离DNA中未观察到标 志物基因的组的甲基化中的年龄依赖性变化(数据未示出)。

然后，复发性转移性乳腺癌患者血清(n＝33)和正常血清(n＝27)的独立的 测试组使用训练组定义的参数(例如阈值)来测定。将阈值锁定在7个单位 后，观察到的测定特异性是100％(95％CI＝87.2-100％)，灵敏度是90.9％ (95％CI＝75.7-98.1％p<0.0001)，AUC＝0.994(95％CI＝0.984-1.01％；p< 0.0001)，分类精度是95％(57/60)及似然比＝24.6(图5)。与训练组类似， 单个基因的甲基化的平均频率是高的(38.3％，范围从18％-67％)；具有甲 基化的最高发生率的基因是RASSF1A。因此，本发明的cMethDNA测定 使用通过检查甲基化阵列中呈现的27K CpG位点在血清中发现的新颖标 志物，以高水平精确度(90％以上)检测患有转移性乳腺癌的患者的血清中 的异常过度甲基化。

实施例7

cMethDNA监测对治疗的反应的效用。以前的研究已揭示了循环肿瘤 细胞(CTC)测定的临床意义，不仅在于监测对新的化学疗法方案的反应还 在于预测疾病的长期结果。类似地，已测试了用于检测循环肿瘤抗原、肿 瘤特异性DNA、mRNA和蛋白的基于血浆或血清的测定(J Natl Cancer  InstMonogr.2011；2011(43):75-8)。为了确定如由cMethDNA测定所评价的 我们的甲基化的基因标志物的组的CMI中的改变是否可用于反映对化学 疗法的反应，对患有复发性转移性乳腺癌患者的血清进行初步研究。在治 疗之前和治疗之后的6-12周将患者(n＝29)分期。在治疗之前及治疗期间以 一定的时间间隔收集血液。在全部29名患者中，在开始治疗之前及新的 化学疗法方案的开始之后的三周收集的血清通过cMethDNA测定来测试。

在两个时间点，治疗的第1天和第8-12天时收集的总计58个测试的 血清中，结果显示，在患有稳定疾病或具有治疗反应的患者中的血清DNA 甲基化水平的统计上显著减少(p＝0.001)，但在那些进行性疾病中则未减少 (p＝0.728；Wilcoxon符号秩检验)。使用ROC以选择最佳灵敏度和特异性， -0.46％变化的截止值以89％灵敏度和91％特异性区分进展的和非进展的患 者(AUC＝0.945，95％CI 0.875-1.025，似然比1.73)。尽管针对小样品组， 该数据显示了本发明的cMethDNA测定显示反映在治疗时间表的早期时间 点确定的反应的改变的能力。基于这些发现结果，我们进行探索性研究以 确定甲基化水平的变化是否反映治疗期间的肿瘤负荷。对来自16名患者 的亚组的血清进行cMethDNA测定，对于这些患者，血清从不同的治疗周 期期间的三个或更多个时间点收集可得(总计76个血清)。

实施例8

在原发性肿瘤和转移之间保留甲基化模式。在来自尸检(死亡4小时进 行的)时收集的原发性肿瘤和远端转移的DNA的以前研究中，我们观察到 原发位点处的肿瘤和远端转移的甲基化谱中的相似性。假设，1)该多基因 甲基化模式将同样地在血清中反映，以及2)可用于在通过成像和/或临床检 查发现之前预测转移的再现。为了测试该假设的第一条，我们使用 cMethDNA测定以测试从10名患者收集的在死亡后不久收集的原发性肿 瘤、和远端转移和血清的组。患者的年龄范围从33至79岁，且患者在其 乳腺癌的诊断后存活2-11年。结果显示，在来自相同患者的样品中的甲基 化的基因之间存在显著视觉一致性(数据未示出)。在血清和组织间观察到 统计学上高水平的一致性，50％的血清/组织对对于≥9个标志物是一致 的，且没有一个具有少于6个匹配。在血清和组织样品之间观察到的一致 性与组织对组织的比较类似。偶然(By chance alone)，基于评价的基因的整 体频率，预测的匹配的中值数目是7(范围＝3-9)；无效分布显示约70％匹 配率。为了强化这些发现结果，对复发诊断后从训练组的十名患者和4期 乳腺癌的18名患者的群体收集的原发性肿瘤和血液进行类似的分析，对 于这些患者，原发性肿瘤和并发的远端转移组织以及血液的活组织检查是 可用的。此处通过cMethDNA测定再次观察到测试的10个基因的组的甲 基化模式的惊人的相似性(数据未示出)。此外，该分析显示，在患有4期 乳腺癌的患者中，在18/25(72％)的患者中甲基化的循环DNA是可检测的。 这些研究提供了以下原理的证据：在相同患者的远端转移和血清中保留甲 基化的核心模式。该数据还表明，使用本发明的方法的每一名患者在诊断 时的原发性肿瘤的全面甲基化分析，可能会为该患者的癌症，和在相同患 者中出现的其他癌症提供独特的条码或标签。

在本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通 过引用并入，其程度如同分别和具体指出将每个参考文献通过引用并入并 以其整体列于本文中一样。

描述本发明的上下文(尤其在以下权利要求书的上下文)中术语“一个 (a)”和“一个(an)”和“该(the)”以及类似指代物的使用应被解释为既覆 盖单数形式又覆盖复数形式，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。除非 另有注释，否则术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)” 和“包含(containing)”应被解释为开放式术语(即，意为“包括，但不限于”)。 除非本文另外指明，本文数值范围的列举仅仅意图用作具体地提及落入所 述范围的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入到说明书中，如 同其在本文被单独列举。可按任何合适顺序进行本文中描述的所有方法， 除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和全部实 例，或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图更好地说明本发明而不是 对本发明的范围施加限制，除非另有要求。说明书中的语言不应解释为表 明任何未要求保护的要素对实施本发明必不可少。

本文描述了本发明的优选的实施方案，包括本发明人用于进行本发明 的已知最好的模式。本领域的普通技术人员在阅读了上述说明书后，那些 优选的实施方案的变化可变得明显。本发明人预期技术人员视情况而定采 用此类变化，并且本发明人预期本发明另外被以不同于本文具体描述的方 式实施。因此，本发明包括如适用法律许可的此处所附权利要求书中描述 的主题的所有修改和等同物。而且，上述要素以其所有可能的变化的任何 组合都被本发明所涵盖，除非本文另有说明或另外与上下文明显矛盾。