一种鸡传染性脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定方法

摘要

本发明的目的是提供一种新型的用于检测禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定方法，可以更灵敏、更特异的检测到禽脑脊髓炎活疫苗中的病毒，并且对活病毒进行定量。本发明通过构建AEV的荧光免疫试剂盒，将禽脑脊髓炎活疫苗接种CEN细胞，采用间接免疫荧光检测技术进行禽脑脊髓炎病毒活疫苗病毒含量检测。该方法通过利用活的AEV粒子在CEN细胞上能够繁殖复制这一特性，能够检测到有复制能力的活病毒粒子出现特异性绿色荧光，而死亡的病毒粒子接种CEN后不能繁殖复制，从而不能出现特异性绿色荧光。本发明方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。

说明书

技术领域

本发明属于家禽病毒检测技术领域，具体涉及一种鸡传染性脑脊髓炎活疫 苗中病毒含量测定方法。

背景技术

禽脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis，AE)是由禽传染性脑脊髓炎病毒 (AEV)引起的以侵害雏禽中枢神经系统为主特征的传染病，鸡、火鸡、野鸡、 鹌鹑均可感染本病，其临床特征为病禽共济失调，震颤和非化脓性脑脊髓炎。 该病于1930年首次发现于美国罗德岛，后传至美国新英格兰地区，故又称为新 英格兰病；1932年又根据发病雏鸡特征性头颈震颤，称为禽流行性震颤。1938 年Van Roekel将其定名为禽脑脊髓炎。

AEV属于小RNA病毒科肠道病毒属。报道的所有分离株和疫苗株血清学上与 Van Roekel株相同。AEV容易在易感鸡胚上复制，并且鸡胚适应毒株能引起各种 症状，尤其是肢体畸形，可以当作病毒感染分析的基础模型。在用禽类细胞培 养繁殖该病毒方面已经做了很多尝试，并且已经证实通过接种鸡胚尿囊液繁殖 增加了病毒的滴度，并且无细胞病变。

到目前为止，对于禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定还没有一种稳定性、 重复性好的定量方法，还不能进行病毒含量测定。过去禽脑脊髓炎病毒含量的 检测方法一直采用将病毒进行梯度稀释接种12日龄SPF鸡胚，通过观察鸡胚出现 病变的数量来确定病毒含量。但是该方法周期长，鸡胚的存活质量会影响结果 的稳定性。因此，有必要提供一种操作更方便，检测更精确的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的用于检测禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测 定方法，可以更灵敏、更特异的检测到禽脑脊髓炎活疫苗中的病毒，并且对活 病毒进行定量。

本发明首先提供一种用于检测禽传染性脑脊髓炎病毒的荧光免疫检测试剂 盒，该试剂盒包含有如下的组分：

1)用于检测禽脑脊髓炎病毒的鸡单因子血清抗体(一抗，工作浓度为1： 40倍稀释)；

2)二抗：FITC标记的兔抗鸡IgG(工作浓度1：200倍稀释)；

3)阳性对照样品：AEV Van Roekel株；

4)固定液：按丙酮与无水醇体积比3：2配置的固定液；

5)PBS洗液：磷酸盐缓冲液，按Nacl 8.0g；Kcl 0.2g；Na2HPO4 3.58g； KH2PO40.24g定容至1L，调至PH7.2。

作为试剂盒主要成分的鸡单因子血清抗体(一抗)，其制备方法如下：是将 禽脑脊髓炎活疫苗弱毒株按每羽份病毒滴度≥10^4.0EID₅₀口服免疫3～4周龄的雏 鸡，免疫28天后用禽脑脊髓炎强毒株进行脑内接种攻毒，采集攻毒后21天的 无禽脑脊髓炎症状的雏鸡血清，制备出用于检测禽脑脊髓炎病毒的鸡单因子血 清抗体，能够与禽脑脊髓炎病毒发生特异性反应。

本发明提供的试剂盒用于检测禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量，其一种具体 操作如下：

将禽脑脊髓炎活疫进行连续10倍梯度稀释，共稀释5个梯度(10^-2～10^-6)， 每个梯度接种4个孔(24孔细胞培养板)，每孔取100μl稀释的疫苗液接种于 长成70％～80％的单层CEN细胞，剩余4个培养孔作为阴性对照，连续培养72 小时后，利用构建的检测AEV的荧光免疫检测试剂盒进行IFA，计算显微镜下视 野中阳性细胞(出现特异性绿色荧光)的个数，此梯度视野中至少有5个阳性 细胞，随机选择至少5个区域计数。按照疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(平均阳性 细胞数/区域)×(稀释比例)/(0.1ml)的公式计算疫苗中病毒含量。

所述的鸡胚脑神经胶质细胞(CEN)制备方法：是将12日龄SPF鸡胚的大脑 组用PBS洗涤后，用0.25％的胰酶溶液消化15min，1000r/min离心5min，沉淀 用M199培养液洗涤1次，然后用胰酶继续处理5min，直到细胞完全消化开。然 后用1000r/min离心10min收集细胞，并用M199生长液(10％胎牛血清，2％NaHCO₃， 青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml)重悬，然后进行培养并连续1～2次传代则 制备成功。

本发明通过构建AEV的荧光免疫试剂盒，将禽脑脊髓炎活疫苗接种从12日 龄鸡胚脑中分离的鸡胚脑神经胶质细胞(CEN)，采用间接免疫荧光检测技术 (IFA)进行禽脑脊髓炎病毒活疫苗病毒含量检测。该方法通过利用活的AEV粒 子在CEN细胞上能够繁殖复制这一特性，能够检测到有复制能力的活病毒粒子 出现特异性绿色荧光，而死亡的病毒粒子接种CEN后不能繁殖复制，从而不能 出现特异性绿色荧光。本方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。

具体实施方式

本发明选用对禽脑脊髓炎病毒(AEV)易感的细胞，且能够对禽脑脊髓炎病 毒进行传代培养；通过将禽脑脊髓炎活疫苗进行连续10倍的梯度稀释(10^-2～ 10^-6)接种于长成单层的鸡胚脑神经胶质细胞(CEN)24孔细胞培养板，继续培 养72小时后，利用构建的检测禽脑脊髓炎病毒的荧光免疫试剂盒进行进行IFA， 通过计算显微镜下视野中阳性(出现特异性绿色荧光)细胞的平均个数计算疫 苗中的病毒滴度。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：用于检测禽脑脊髓炎活疫苗中AEV的荧光免疫试剂盒的构建

1.1针对AEV鸡单因子血清抗体的制备方法

本发明所制备的用于检测AEV的荧光免疫试剂盒主要成分为抗禽脑脊髓炎 病毒的鸡单因子血清抗体，选用传代致弱的禽脑脊髓炎活疫苗(YB02株CGMCC  No.8505)按每羽份病毒滴度≥10^4.0EID₅₀口服免疫3～4周龄的易感雏鸡，免后 28天用禽脑脊髓炎强毒(Van Roekel株)进行脑内接种攻毒，采集攻毒后21 天无禽脑脊髓炎症状(获得保护)鸡的血清制备的，制备出的血清中抗体能够 与禽脑脊髓炎病毒发生特异性反应，析出的血清-20℃保存。

1.2间接免疫荧光(IFA)鉴定鸡单因子血清

(1)选取状态良好的CEN细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×10⁵个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5％二氧化碳培养过夜 (至细胞75％贴壁)。

(2)准备好10倍梯度稀释的病毒样品，每孔逐滴加入100微升病毒样品。 37℃、5％二氧化碳感染3天。

(3)轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁加入-20℃预冷的固定液0.5ml(枪 头不能触到细胞)，-20℃固定30分钟。

(4)使用1×PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟(切忌将细胞冲起)。 使用含1％BSA的PBS于37℃恒温培养箱封闭1小时。

(5)加入0.2ml的鸡单因子血清工作液至每个孔中，37℃孵育45分钟。

(6)使用1×PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。

(7)加入0.2ml 1×FITC标记二抗工作液至每孔，37℃避光孵育1小时。

(8)使用1×PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5分钟。

(9)加入0.2ml 50％甘油至每孔。

(10)每孔随机选择5个视野，在倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm) 放大100×～200×观察计算阳性细胞个数。

(11)结果判定标准当待检孔中出现特异性绿色荧光，阴性对照空未出现 特异性绿色荧光时，试验成立。待检孔被判为阳性。

(12)结果该鸡单因子血清可与AEV发生特异性反应，并且因子血清在1： 40倍稀释效果较好。

1.3以单因子血清为基础构建的AEV荧光免疫检测试剂盒主要成分包括：

1)用于抗禽脑脊髓炎病毒(Anti-AEV)的鸡单因子血清抗体(工作浓度1:40 倍稀释)；

2)二抗：FITC标记的兔抗鸡IgG(工作浓度1:200倍稀释)；

3)阳性对照样品：AEV Van Roekel株；

4)固定液：按丙酮与无水乙醇体积比3：2配置固定液；

5)PBS洗液：磷酸盐缓冲液，按Nacl 8.0g；Kcl 0.2g；Na2HPO4 3.58g； KH2PO4 0.24g定容至1L配制，调至PH7.2。

6)封闭液：1％BSA/PBS溶液。

鸡胚脑神经胶质细胞(CEN)制备方法

将12日龄SPF鸡胚的大脑组织取出、剪碎，并用PBS洗涤。用0.25％的胰酶 溶液消化15min，1000r/min离心5min，沉淀用M199培养液洗涤1次，然后用胰酶 继续处理5min，直到细胞完全消化开。然后用1000r/min离心10min收集细胞， 并用M199生长液(10％胎牛血清，2％NaHCO₃，青霉素100U/ml和链霉素100ug/ml) 重悬，加入含10％胎牛血清M199生长液重悬细胞。然后用台酚蓝进行活细胞计数， 按照1×10⁶个细胞/瓶接种到25cm²细胞瓶中，培养24小时，弃掉上清及未贴壁的 死细胞，加入新鲜含10％胎牛血清M199生长液，继续培养细胞长成单层，用含有 0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液消化，加入含10％胎牛血清M199生长液重 悬细胞铺到24孔板中，继续培养至单层细胞贴壁70％～80％。

实施例2：禽脑脊髓炎活疫苗中病毒含量测定方法及结果

1.1病毒滴度测定

将同一批次的2瓶禽脑脊髓炎活疫苗(青岛易邦生物工程有限公司生产) 进行连续10倍梯度稀释，共稀释5个梯度(10^-2～10^-6)，每个梯度接种4个孔 (24孔细胞培养板)，每孔取100μl稀释的疫苗液接种于长成70％～80％的单层 CEN细胞，剩余4个培养孔作为阴性对照，连续培养72小时后，利用构建的检 测AEV的荧光免疫检测试剂盒进行IFA，计算显微镜下视野中阳性细胞(出现特 异性绿色荧光)的个数。

1.2病毒滴度计算方法

1.2.1选择10^-4稀释梯度，此梯度视野中至少有5个阳性细胞，随机选择 至少5个区域计数。

1.2.2每孔视野数计算标准10×目镜与10×物镜所观察到的视野直径 为1.8mm，因此：每个视野的面积＝3.14×(D/2)²＝3.14×0.9²＝2.54mm²对于一 个标准24孔板，培养面积为2.0cm²，因此：每孔视野数＝2.0cm²/2.54mm²＝2.0 cm²/2.54×10^-2cm²＝79。

1.2.3疫苗病毒滴度疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(阳性细胞数/区域)× (稀释比例)/(0.1ml)，疫苗1在显微镜下5个视野中计算的平均阳性细胞平 均数为7，此孔活疫苗稀释了10⁴倍，则疫苗病毒滴度＝7×79×10⁴/0.1＝5.53× 10⁶TCID₅₀/ml，详见下表1；疫苗2在显微镜下5个视野中计算的阳性细胞平均 数为6，此孔疫苗稀释了10⁴倍，则疫苗病毒滴度＝6×79×10⁴/0.1＝4.74× 10⁶TCID₅₀/ml，结果见下表1。

表2

上述的结果表明本发明的方法能够高效的检测禽脑脊髓炎活疫苗中病毒的 含量，且本发明的方法具有灵敏性强和重复性好的特点。