一种筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法

摘要

本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。本筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术，对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，方法包括以下步骤：步骤1)建立咪唑立宾于免疫T细胞作用样品组群、步骤2)制备免疫T细胞二维电泳蛋白质样品、步骤3)双向凝胶电泳、步骤4)图像采集分析得出结果。本发明筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作 用靶位进行筛选的方法。

背景技术

咪唑立宾(Mizoribine,MZ,bredinin)咪唑立宾是日本旭化成从土壤霉菌的 培养滤液中获得的咪唑类抗生素。作为免疫抑制剂，1991年12月起在日本临床 肾移植中应用。日本许多临床移植中心已将咪唑立宾作为肾移植后的常规免疫 抑制药物。我国近年也将其作为肾移植抗排斥药用于临床。咪唑立宾与同类药 物硫唑嘌呤相比，肝毒性和骨髓抑制作用要小，它的主要不良反应是胃肠道反 应、血液系统障碍和过敏症状，偶见骨髓功能抑制和急性肾功能衰竭。。目前， 临床上针对个体病患，咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位一直无法确定，且 常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率 低，难以在临床用药时提供具有药理意义和指导作用的检测结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种利用 蛋白质组学技术对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。

为解决上述技术问题，本筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方 法利用蛋白质组学技术，对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选， 其具体方法包括以下步骤：

步骤1)：将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验 组，向试验组中分别加入不同浓度的咪唑立宾，整体形成咪唑立宾对免疫T 细胞模型的药物作用样品组群；

步骤2)：将步骤1)所述的咪唑立宾对免疫T细胞模型的药物作用样品组 群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管； 收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓 冲液，然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)- 二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融 细胞5～8次；放入冰盐浴中静置30min；然后升温至10℃的条件下离心2h；离 心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转 移至70℃的保温箱中储存存储备用；

步骤3)：将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量 10mol/L尿素、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L二硫苏糖醇 0.5％的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条 的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置 于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在 平衡液中平衡30min；平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以 琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝 前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；

步骤4)：将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得 到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点 的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分 了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细 胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与咪唑立宾作用下培养的免疫T细胞蛋白 质的双向电泳图谱进行配比，获得咪唑立宾作用于免疫T细胞的差异表达蛋白 质；

步骤5)：将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱， 测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白 后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得咪唑立宾于免疫T细胞中药 物作用靶位。

本发明筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、 结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选 结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用 的检测结果。

具体实施方式

本将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试 验组中分别加入不同浓度的咪唑立宾，整体形成咪唑立宾对免疫T细胞模型的 药物作用样品组群；

步骤2)：将步骤1)所述的咪唑立宾对免疫T细胞模型的药物作用样品组群 培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收 集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液， 然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺 1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5～8 次；放入冰盐浴中静置30min；然后升温至10℃的条件下离心2h；离心完成后 取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70℃的 保温箱中储存存储备用；

步骤3)：将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量 10mol/L尿素、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L二硫苏糖醇 0.5％的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条 的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置 于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在 平衡液中平衡30min；平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以 琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝 前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；

步骤4)：将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得 到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点 的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分 了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细 胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与咪唑立宾作用下培养的免疫T细胞蛋白 质的双向电泳图谱进行配比，获得咪唑立宾作用于免疫T细胞的差异表达蛋白 质；

步骤5)：将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱， 测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白 后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得咪唑立宾于免疫T细胞中药 物作用靶位。

本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书描述的产品， 均落入本发明的保护范围之内。