一种提高紫杉醇口服生物利用度的紫杉烷类组合物及其应用

摘要

本发明公开了一种提高紫杉醇口服生物利用度的紫杉烷类组合物以及包含该紫杉烷类组合物和紫杉醇的复方药物组合物。本发明所述紫杉烷类组合物可以用于提高紫杉醇的口服生物利用度，用于制备含紫杉醇的抗癌口服药物，可以提高紫杉醇的抗癌效果。本发明复方药物组合物中，紫杉烷类单体化合物通过抑制紫杉醇的肠道外排作用，从而提高紫杉醇的口服生物利用度，与紫杉醇合用制备成口服药，可以明显提高SD大鼠口服后紫杉醇的血药浓度，对于进一步提升推广紫杉醇的抗癌应用具有重要的意义。

说明书

技术领域

 本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种提高紫杉醇口服生物利用度的紫杉烷类组合物及其应用。

背景技术

紫杉醇（分子式：C47H51NO14）是从红豆杉树皮或针叶中提取的新型抗肿瘤药物，作用于细胞微管，可稳定微管并抑制微管解聚抑制细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。自1992年美国FDA批准上市以来，目前已广泛应用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的治疗。由于其难溶于水，目前临床常用的紫杉醇注射液（商品名为泰素，taxol）是将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇（1:1, V/V）的混合溶媒中，增加了紫杉醇的水溶性。但是紫杉醇的这种注射剂目前被证实可导致一系列的不良反应，如过敏反应和神经系统毒性等（WEISS R B, DONEHOWER R C, WIERNIK P H, et al. Hypersensitivity reactions from taxol [J]. J Clin Oncol, 1990, 8(7): 1263-1268.），并且对紫杉醇的药代动力学有一定影响（Sparrebooma, Van Tellingen, Nooijen W J, et al. Nonlinear pharmacokinetics of paclitaxel in mice results from the pharmaceutical vehicle Cremophor EL[J]. Cancer Res, 1996, 56(9): 2112-2115.）。而且助溶剂聚氧乙烯蓖麻油在体内降解时会释放组胺，会引起较严重的过敏反应以及肾毒性和神经毒性等不良反应（Singla K, Garg A , Aggarwal L. Paclitaxel and its formulation[J]. Int J Pharm, 2002, 235: 179-192）。同时，这种注射制剂不能用普通的聚氯乙烯（PVC）塑料容器或注射容器配制、盛装和注射，以避免药液和PVC反应生成焦碳酸二乙酯等致敏物。根据临床表现，紫杉醇注射液的过敏反应可分为轻度过敏反应、严重过敏反应、超敏反应（即过敏性休克）以及其他症状。紫杉醇注射液的过敏反应严重阻碍了其临床应用。因此紫杉醇新型制剂的开发，不仅仅要满足增加其水溶性，而更应该满足肿瘤患者需要长期用药的特殊治疗要求。目前紫杉醇新剂型开发主要从提高紫杉醇的药效并且降低不良反应为出发点。口服抗肿瘤药物比静脉注射抗肿瘤药物不仅更方便临床使用而且也有更高的安全性，所以开发合适口服给药的紫杉醇制剂具有重要的临床意义和需求。

但是由于紫杉醇口服几乎不吸收，所以要将紫杉醇开发成口服制剂还需要大量的研究工作。目前在改善口服紫杉醇水溶性方面已经有大量的研究，例如可溶性半合成紫杉醇衍生物，它不需要聚氧乙烯蓖麻油的增溶作用，并且还能够降低紫杉醇的全身清除率。Choia等的研究结果表明为，合用P-gp外排抑制剂环孢素A提高紫杉醇口服生物利用度。开发紫杉醇的新剂型是突破其口服给药的另外一个重要研究方向，如微乳、胶束、前体药物、包合物、脂质体、纳米粒、糊剂、凝胶、植入剂和药物释放支架等（张晓静，张频.紫杉醇新剂型的开发及临床研究进展. 癌症进展杂志, 2007,1(5):66-72）。近年来也有紫杉醇与单克隆抗体、蛋白和多肽等结合能实现肿瘤的靶向治疗的报道（Chen X Y, Plasenciac, Hou Y P, et al. Synthesis and biological evaluation of dimeric RGD peptide-paclitaxel conjugate as a model for in-tegrin- targeted drug delivery[J]. J Med Chem , 2005, 48: 1098-1106）。这些新的剂型在降低不良反应及药效和毒性方面在研究中表现出了各自的优势，但正真应用于临床的剂型还较少，且应用于肿瘤患者身上时表现出相应的局限性。例如，环抱素A（Cs A）是一种免疫抑制剂，同时为P-gp （P-glycoprotein, P-gp）的抑制剂，与紫杉醇合用后能够有效提高紫杉醇的血药浓度及生物利用度，但是由于Cs A具有一定的不良反应，如肾毒性和免疫抑制作用等，从而限制其作为多药耐药逆转剂的临床使用。

因此，我们仍需不懈的努力研究紫杉醇口服制剂及其利用效率的问题。本课题组前期研究发现一些中药提取单体化合物能够提高紫杉醇的口服生物利用度（申请号CN201110004638.9）。目前现有技术中尚未发现紫杉烷类药物单体与紫杉醇单体合用后是否能够提高紫杉醇生物利用度的组合物的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有紫杉醇口服生物利用度低的问题，提供一种可以抑制紫杉醇的肠道外排，进而提高紫杉醇血药浓度、提高紫杉醇口服生物利用度的紫杉烷类组合物。

本发明另一目的是提供所述紫杉烷类组合物在提高紫杉醇口服生物利用度中的应用。

本发明另一目的是提供所述紫杉烷类组合物在制备抑制紫杉醇肠道外排的药物方面的应用。

本发明再一目的是提供一种包含上述紫杉烷类组合物和紫杉醇的复方药物组合物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种提高紫杉醇口服生物利用度的紫杉烷类组合物，包含一种或几种紫杉烷类单体化合物；所述紫杉烷类单体化合物为三尖杉宁碱、巴卡亭III、10-去乙酰巴卡亭III、7-表-10-去乙酰基紫杉醇、紫杉宁M或10-去乙酰基紫杉醇。

一种包含紫杉醇和上述紫杉烷类组合物的复方药物组合物。紫杉烷类组合物中的紫杉烷类单体化合物可以抑制紫杉醇的肠道外排作用，从而提高紫杉醇的口服生物利用度，与紫杉醇合用制备成口服药，可以明显提高SD大鼠口服后紫杉醇的血药浓度。因此可以提高紫杉醇的口服生物利用度，提高紫杉醇的抗癌效果。

优选地，所述紫杉醇和紫杉烷类组合物的质量比为1：0.5～1：2。更优选地，所述紫杉醇和紫杉烷类组合物的质量比为1：0.5～1：1。

如上所述复方药物组合物通过常规方法，加上辅料，制备成为口服剂型。

优选地，所述口服剂型为滴丸剂、乳剂、胶囊剂/软胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、糖浆剂、颗粒剂、散剂、膏剂、微球剂、微囊剂、缓释制剂或控释制剂。

另外，上述包含紫杉醇的复方药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述癌症是指肺癌、卵巢癌、恶性胸腺癌、胆囊癌、食道癌、非小细胞肺癌、淋巴癌、膀胧癌、生殖细胞癌、头颈癌、晚期转移性卵巢癌、乳腺癌、肺鳞癌或肺腺癌。

本发明人考虑到紫杉醇作为临床治疗肿瘤的主要化疗药物之一，随着化疗的进行，肿瘤细胞对紫杉醇越来越不敏感，即多药耐药（Multidrug Resistance, MDR）的现象，而P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）在多药耐药现象中起着尤为重要的作用，紫杉醇是P-gp的经典底物，P-gp的外排作用是紫杉醇口服吸收低的重要原因之一。本发明人经过大量的研究和探索，终于发现三尖杉宁碱、巴卡亭III、10-去乙酰巴卡亭III、7-表-10-去乙酰基紫杉醇、紫杉宁M或10-去乙酰基紫杉醇等紫杉烷类单体化合物能够有效抑制紫杉醇的肠道外排作用，提高紫杉醇的口服生物利用度，与紫杉醇合用制备成口服药，可以明显提高SD大鼠口服后紫杉醇的血药浓度。因此可以提高紫杉醇的口服生物利用度，提高紫杉醇的抗癌效果。

而且三尖杉宁碱、巴卡亭III、10-去乙酰巴卡亭III、7-表-10-去乙酰基紫杉醇、紫杉宁M或10-去乙酰基紫杉醇的任意一种都能够提高紫杉醇的生物利用度，其中的任意几种配合使用效果更好。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种紫杉烷类组合物，可以显著提高紫杉醇的口服生物利用度，而且提高其抗肿瘤活性，对于进一步提升推广紫杉醇的抗癌应用具有重要的意义。

本发明所述紫杉烷类组合物提高紫杉醇的口服生物利用度的机理是：紫杉烷类组合物中的紫杉烷类单体化合物可以抑制紫杉醇的肠道外排作用，从而提高紫杉醇的口服生物利用度，与紫杉醇合用制备成口服药，可以明显提高SD大鼠口服后紫杉醇的血药浓度。因此可以提高紫杉醇的口服生物利用度，提高紫杉醇的抗癌效果。

本发明的口服制剂可以是口服液、片剂、胶囊剂、颗粒等等，本发明的药物的原料药（紫杉醇及上述各种紫杉烷类活性物质）可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、粘合剂、润滑剂、助流剂等制备成口服制剂，应用范围广。

附图说明

图1为紫杉醇及其合用三尖杉宁碱后在SD大鼠中的血药浓度。

图2为紫杉醇及其合用紫杉烷类组合物口服给药后在SD大鼠中的血药浓度。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 MDR1-MDCKII细胞模型转运实验

本实施例进行MDR1-MDCKII细胞模型实验：用UPLC-MS/MS测定在不同浓度中药单体的作用下，浓度为1μM的紫杉醇经MDR1-MDCKII单层细胞转运至AP面的浓度，得到BL-AP转运表观渗透系数值（Papp值），来研究探讨各种紫杉烷类单体化合物对紫杉醇肠道外排的影响。

MDCK-MDR1细胞是高表达P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp），且P-gp在MDCK-MDR1细胞中呈极性分布，它是作为药物转运模型快速筛选P-gp底物和抑制剂，以及肠道、血脑屏障、肾脏的体外通用的模型。MDCK-MDR1 细胞高表达目的蛋白P-gp，可以排除这些干扰，专一地鉴定P-gp在药物外排中的作用，筛选它的底物及抑制剂，所以在许多研究中用它的单细胞层来检测P-gp底物和抑制剂的活性，MDCK-MDR1 细胞是研究药物双向转运率、快速筛选、吸收转运机制、预测体内吸收和药物相互作用、新药设计及评价药物安全性的一个比较理想的体外模型。

1、实验方法

（1）取25～30 代MDCK-MDR1 细胞接种于培养皿内，待融合度达80%～90% 时，使用含EDTA 的0.25(w/v)%胰酶消化，并用含5%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至2×10⁵个/mL，得细胞悬液。

接种所用的Transwell聚碳酸酯膜12孔板为市购，小室顶端（AP）加入0.5 mL细胞悬液，基底端（BL）加入1.5 mL上述新鲜培养基。每天换液，连续培养6 d，测定并记录单层细胞的跨膜电阻值。

（2）AP →BL方向的转运试验

S1.吸去Transwell小室AP和BL端的培养基，加入37 ℃预热的HBSS溶液（配方为：8g/L NaCl，0.4g/L KCl，1g/L葡萄糖，60mg/L KH₂PO₄，47.5mg/L Na₂HPO₄，0.35g/L NaHCO₃），37 ℃平衡 20 min；

S2.吸去 HBSS溶液，在AP 端分别加入以下溶液：1）0.5 mL预热的含有1 μmol/L紫杉醇的HBSS溶液，2）0.5 mL预热的含有1 μmol/L紫杉醇和一种本发明所述紫杉烷类单体（25，50，100 μmol/L）的HBSS溶液，3）0.5 mL预热的含有1 μmol/L紫杉醇和维拉帕米（25，50，100 μmol/L）的HBSS溶液；

S3.在BL端加入1.5 mL空白HBSS溶液；

S4.在37℃恒温振荡器培养1.5h，振荡器转速为60 r/min；按时间吸取BL端的转运液，测定转运液中的药物浓度。

（3）BL →AP方向的转运试验

S1.吸去Transwell小室AP和BL端的培养基，加入37 ℃预热的HBSS溶液，37 ℃平衡 20min；

S2.吸去HBSS，在AP端加入0.5mL空白HBSS 溶液；BL端分别加入以下溶液：1）1.5mL预热的含有1μmol/L紫杉醇的HBSS溶液，2）1.5mL预热的含有1μmol/L紫杉醇和一种本发明所述紫杉烷类单体（25，50，100μmol/L）的HBSS溶液，3）1.5mL预热的含有1μmol/L紫杉醇和维拉帕米（25，50，100μmol/L）的HBSS溶液；

S3.在37 ℃恒温振荡器培养 1.5h，振荡器转速为 60r/min；按时间吸取AP 端的转运液，测定转运液中的药物浓度。

（4）数据处理

根据下式计算紫杉醇的双向转运的表观渗透系数Papp（apparent permeability coefficient）：

Papp =（dC/dt ×V）/（A × C0）

其中，C0 是紫杉醇所在端（donor）的初始浓度， dC/dt 是在接收端（receiver） 紫杉醇出现的速率，V是接收端的溶液体积，A是Transwell多聚碳酸酯膜的表面积1.12 cm²。

2、结果

BL-AP转运表观渗透系数值（Papp值）如表1所示。结果表明，本发明所述的各种紫杉烷类单体均具有一定的抑制紫杉醇肠道外排的作用。

表1

实施例2 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括三尖杉宁碱、巴卡亭III和10-去乙酰巴卡亭III。

实施例3 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括7-表-10-去乙酰基紫杉醇、紫杉宁M和10-去乙酰基紫杉醇。

实施例4 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括三尖杉宁碱、巴卡亭III和10-去乙酰基紫杉醇。

实施例5 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括巴卡亭III、10-去乙酰巴卡亭III和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。

实施例6 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括三尖杉宁碱、紫杉宁M和10-去乙酰基紫杉醇。

实施例7 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括10-去乙酰巴卡亭III、7-表-10-去乙酰基紫杉醇和10-去乙酰基紫杉醇。

实施例8 一种紫杉烷类组合物

一种紫杉烷类组合物，包括三尖杉宁碱、7-表-10-去乙酰基紫杉醇和10-去乙酰基紫杉醇。

实施例9 紫杉醇生物利用度实验

1、实验仪器

超高效液相色谱系统（Acquity UPLCTMsystem，Waters，USA），质谱仪（Premier^TMXE三重四极杆质谱系统，Waters, USA），数据采集及处理软件（Masslynx V 4.1, Waters, USA），低温离心机（5417R型，EPPENDORF, Germany）真空干燥箱（DZF-6050型，上海一恒科学仪器有限公司），涡旋混合器（XW-80A上海医科大学仪器厂），SAS（SAS Ver.8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）。

2、实验动物

雄性SD大鼠，购自广州中医药大学实验动物中心。

3、实验材料

紫杉醇，三尖杉宁碱，多西紫杉醇，聚氧乙烯蓖麻油，无水乙醇，肝素钠注射液，聚乙烯插管。

（1）紫杉醇灌胃液（10 mg/kg, p.o.）

精密称取紫杉醇40mg，放入50mL的离心管中，聚氧乙烯蓖麻油2.9 mL，无水乙醇2.9 mL，加纯水至40 mL，超声，得1mg/mL的紫杉醇灌胃液40mL。

（2）三尖杉宁碱灌胃液（5 mg/kg, p.o.）

精密称取三尖杉宁碱5mg，放入15mL的离心管中，聚氧乙烯蓖麻油0.7 mL，无水乙醇0.7 mL，加纯水至10 mL，超声，得0.5mg/mL的三尖杉宁碱灌胃液10mL。

（3）三尖杉宁碱灌胃液（10 mg/kg, p.o.）

精密称取三尖杉宁碱10mg，放入15mL的离心管中，聚氧乙烯蓖麻油0.7 mL，无水乙醇0.7 mL，加纯水至10 mL，超声，得1mg/mL的三尖杉宁碱灌胃液10mL。

（4）三尖杉宁碱灌胃液（20 mg/kg, p.o.）

精密称取三尖杉宁碱20mg，放入15mL的离心管中，聚氧乙烯蓖麻油0.7 mL，无水乙醇0.7 mL，加纯水至10 mL，超声，得2mg/mL的三尖杉宁碱灌胃液10mL。

4、实验方法

（1）雄性SD大鼠随机分为4组，实验前禁食12 h，自由饮水。

手术方法按照大鼠颈静脉插管方法操作规程进行，简要步骤如下：

用乙醚轻度麻醉后，剃毛，暴露右颈，作一约5 mm切口，然后钝性分离出右颈静脉，结扎远心端后，用眼科剪剪出一小切口，插入外径为0.98 mm、内径为0.56 mm的聚乙烯管后结扎固定，导管经颈背部皮下穿出，确保血流通畅后，固定于后背上，聚乙烯管内充满50 U/mL肝素生理盐水溶液抗凝，术后恢复12 h后用于实验。

（2）随机选取4组雄性SD大鼠中的一组，灌胃给予紫杉醇灌胃液（10 mg/kg），于灌胃给药前（0 h）及给药（灌胃给予紫杉醇）后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 从右颈静脉取血。

其它三组配合各浓度的三尖杉宁碱给药：即先分别给予各浓度的三尖杉宁碱灌胃液，10min后再给予紫杉醇灌胃液。在给予紫杉醇灌胃液后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h从插管处取血。

（3）每次取血量约为220 μL，取血后即从插管处补充同体积的肝素化生理盐水（含50 U/mL肝素的生理盐水）。所取血样4000 rpm离心后，精密吸取100 μL血浆分装后置-70℃保存。

（4）血浆样本经液液萃取后用液质联用法测定，分析紫杉醇的血浆浓度，比较在合用三尖杉宁碱和没有合用三尖杉宁碱给药时紫杉醇的相对生物利用度（主要指标：药时曲线下面积（AUC）代表药物的生物利用度，即药物在人体中被吸收利用的程度），AUC大则生物利用度高，反之则低）。

5、结果如附图1所示。

由附图1可知，给药早期，合用三尖杉宁碱的低剂量组、中剂量组和高剂量组中，紫杉醇的血药浓度都有提高（生物利用度），其中合用三尖杉宁碱的低剂量组和中剂量组的生物利用度有显著提高。

由表2可知，紫杉醇在合用三尖杉宁碱后AUC_0-24明显提高，其中合用三尖杉宁碱的低剂量组和中剂量组的AUC_0-24分别是对照组的130%，160%；即紫杉醇与三尖杉宁碱的比例范围从1：0.5到1：1的各剂量组的生物利用度都显著提高，比例范围从1：0.5到1：1的各剂量组提高幅度远超紫杉醇单独给药组，比例范围从1：0.5到1：1的各剂量组提高达130%以上。

而高剂量合用组的紫杉醇的AUC_0-24相对不明显，没有统计学差异；高剂量三尖杉宁碱没有明显提高紫杉醇的AUC，可能原因是因为在三尖杉宁碱配置口服灌胃液时由于浓度过高，超声溶解不够充分，也有可能是因为由于浓度过高灌胃后三尖山宁碱与紫杉醇在胃里发生物理化学反应，导致紫杉醇在胃内析出而吸收减少。总之，紫杉烷类组合物在与紫杉醇配合提高紫杉醇生物利用度的作用中，紫杉烷类组合物的用量及其与紫杉醇的配比是很关键的影响因素之一。

表2 紫杉醇及其合用三尖杉宁碱后的药动学参数

注：Pac（紫杉醇），cep（三尖杉宁碱）；C_max：口服的药-时曲线的最高点称峰浓度。T_max：达到峰浓度的时间；T_1/2：药物浓度在体内变为原始浓度一半的时间；AUC_0-t：时间从0到所选择的最后一个时间点时血药浓度时间曲线下面积；AUC_0-∞：时间从0到无穷大时，期间的血药浓度时间曲线下面积。

 综上所述，实验结果表明，低、中两个剂量的合用三尖杉宁碱的紫杉醇的生物利用度相比于同剂量的单独给予紫杉醇组的生物利用度具有明显的提高，高剂量组的合用三尖杉宁碱的紫杉醇的生物利用度相比于同剂量的单独给予紫杉醇组的生物利用度，早期有明显的提高，因此，与紫杉醇单独给药组相比，紫杉醇与三尖杉宁碱的比例范围从1：0.5到1：2的各剂量组，都能够提高紫杉醇的生物利用度。紫杉醇与三尖杉宁碱的比例范围最优为从1：0.5到1：1。

实施例10 紫杉醇生物利用度实验

1、实验仪器

超高效液相色谱系统（Acquity UPLCTMsystem，Waters，USA），质谱仪（Premier^TMXE三重四极杆质谱系统，Waters, USA），数据采集及处理软件（Masslynx V 4.1, Waters, USA），低温离心机（5417R型，EPPENDORF, Germany）真空干燥箱（DZF-6050型，上海一恒科学仪器有限公司），涡旋混合器（XW-80A上海医科大学仪器厂），SAS（SAS Ver.8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）。

2、实验动物

雄性SD大鼠，购自广州中医药大学实验动物中心。

3、实验材料

紫杉醇，三尖杉宁碱，巴卡亭III，10-去乙酰巴卡亭III，7-表-10-去乙酰基紫杉醇，紫杉宁M，10-去乙酰基紫杉醇，多西紫杉醇，脂肪油，聚氧乙烯蓖麻油，无水乙醇，肝素钠注射液，聚乙烯插管。

紫杉醇合用紫杉烷类组合物灌胃液:

精密称取紫杉醇40mg，三尖杉宁碱41mg，巴卡亭III 8.1mg，10-去乙酰巴卡亭III 43mg，7-表-10-去乙酰基紫杉醇4.5mg，紫杉宁M 1.0mg，10-去乙酰基紫杉醇41mg，脂肪油2mL，聚氧乙烯蓖麻油2.9mL，无水乙醇2.9mL，加纯水至40mL，超声，得紫杉烷类组合物灌胃液（灌胃时以紫杉醇10 mg/kg计）40mL。

4、实验方法

参照实施例2。

5、结果如附图2所示。

给予SD大鼠口服紫杉醇合用紫杉烷类组合物灌胃液后，使用液质联用法测定SD大鼠血浆中的紫杉醇浓度，结果显示，紫杉烷类组合物配合紫杉醇相对于单独紫杉醇原料药灌胃液后，紫杉醇的生物利用度提高了500%，说明紫杉烷类组合物中紫杉醇的口服生物利用度显著提高。