一种黑莓提取物及其在制备肝脏细胞氧化损伤抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种黑莓提取物，按质量百分含量计，该黑莓提取物的组成为：矢车菊素-3-葡萄糖苷58.3％～72.5％；矢车菊素-3-木糖苷11.6％～15.8％；矢车菊素-3-草酸酰葡萄糖苷9.8％～14.6％；矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷3.1％～6.4％；飞燕草素-3-木糖2.7％～4.1％和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷0.3％～0.8％。提取步骤为：黑莓鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液，所述上清液经超滤膜过滤后截留分子量大于10kDa的成分，滤出液经真空冷冻干燥，得到所述的黑莓提取物。本发明还公开了该黑莓提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种黑莓提取物及其在制备肝脏 细胞氧化损伤抑制剂中的应用。

背景技术

自由基被认为是引起人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一，当人 体内的自由基产生过多或清除过慢时，就会转而攻击各种细胞器官并使之 受到损伤，从而加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。

肝脏是人体重要的代谢器官，并在身体里面起着去氧化，储存肝糖， 分泌性蛋白质的合成等作用。肝脏如果受到损伤，其功能将会受到抑制。

丙烯酰胺(Acrylamide，AA)是一种潜在的具有致癌性的化学物质， 是一些富含淀粉类的食品经高温加工后产生。其被人体吸收后对健康存在 潜在威胁。丙烯酰胺具有神经毒性、生殖毒性、遗传毒性以及致癌性，国 际肿瘤研究机构(IARC)将丙烯酰胺认定为2A类致癌物。经研究发现， 丙烯酰胺具有一定的全身损伤作用，孙凤祥等(孙凤祥，翟筱，崔群，丙 烯酰胺对染毒小鼠血清生化指标的影响[J].潍坊医学院学报， 2002,24(1):64-65)以0，50，100，150mg/kg剂量灌胃染毒，发现丙烯酰 胺染毒小鼠的心、肝、肾、脾均受到一定程度的损伤，同时还发现，小鼠 抗氧化功能抑制，认为丙烯酰胺还具有氧化损伤作用。

因此，研制一种对肝脏损伤有保护作用的物质，尤其是由丙烯酰胺导 致的肝脏损伤有保护作用的物质是很有必要的。

黑莓(Blackberry)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)浆果类果树， 是重要的第三代小果类果树。果实呈紫黑色，柔软多汁且营养丰富，富含 多种氨基酸和微量元素，还含有黄酮、多酚、花青素、超氧化物歧化酶 (SOD)等抗氧化活性物质，具有提高免疫力、降压、降血脂和抗心律失 常等功能。目前，并没有针对黑莓提取物在保护肝脏细胞氧化损伤方面的 研究。

发明内容

本发明公开了一种黑莓提取物，模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋白 酶、胰蛋白酶等制备得到。本发明黑莓提取物含有人体最终吸收的有效成 分，由于采用体外模拟的方式，最大限度的保留了有效成分，其功能性具 有实用性；而通过传统方法提取的黑莓产物，进入人体后，会有部分有效 物质被人体消化系统分解消化，因而功能性具有不可预测性，不能代表进 入人体后的真实情况。

一种黑莓提取物，提取步骤如下：

黑莓鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液， 所述上清液经超滤膜过滤后截留分子量大于10kDa的成分，滤出液经真 空冷冻干燥，得到所述的黑莓提取物；

所述黑莓提取物的主要成分：矢车菊素-3-葡萄糖苷 (Cyanidin-3-glucoside)，矢车菊素-3-木糖苷(Cyanidin-3-xyloside)，矢车 菊素-3-草酸酰葡萄糖苷(Cyanidin-3-dioxalylglucoside)，矢车菊素-3-丙二酰 葡萄糖苷(Cyanidin-3-malonylglucoside)，飞燕草素-3-木糖苷 (Delphinidin-3-xyloside)和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷 (Cyanidin-3-arabinoside)，质量百分含量如下：

作为优选，黑莓鲜果经胃蛋白酶酶解的具体步骤为：

黑莓鲜果与水等质量混合打浆，加入HCl调节pH＝1.5～2后得到匀浆， 再加入胃蛋白酶，37℃、200～300rpm下水浴振荡2～3h，得到混合浆液；

进一步优选，所述HCl的浓度为5mol/L；

所述胃蛋白酶的加入量为6000～8000单位胃蛋白酶/20g匀浆。

作为优选，胰蛋白酶酶解的具体步骤为：

取经胃蛋白酶酶解得到的混合浆液，加入NaOH调节pH＝6～7，再加 入胰液，然后用NaHCO₃调节pH至7.4，37℃，200～300rpm水浴振荡2～3 h后，再经5000～8000rpm下离心6～10min得到上清液。

进一步优选，所述NaOH的浓度为1mol/L，NaHCO₃的浓度为1mol/L；

所述胰液中胰蛋白酶的含量为4mg/mL，胆盐的含量为30～40mg/mL； 所述胰液的加入量为6mL/18mL混合浆液。

本发明还公开了所述黑莓提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂 中的新用途，拓展了黑莓的应用领域。

进一步公开了所述的黑莓提取物在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细胞 氧化损伤的抑制剂中的应用。

作为优选，所述的抑制剂中黑莓提取物的有效剂量为0.5mg/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶制备黑莓提 取物。

本发明首次发现了黑莓提取物能够有效抗丙烯酰胺诱导的氧化损伤， 减少活性氧的生成，是一个具有良好开发前景的化合物；

本发明为黑莓提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领 域。

附图说明

图1为实施例1制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞氧化损 伤的保护作用；

图2为实施例1制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞活性氧 自由基ROS(DCF荧光)的抑制作用；

图3为实施例2制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞线粒体 膜电位(MMP)的保护作用；

图4为实施例2制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞谷胱甘 肽(GSH)含量降低的抑制作用；

图5为实施例3制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞核损伤 (Hochest)的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明 的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

黑莓鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将黑莓匀浆酸化至pH＝1.5， 加入胃蛋白酶(6000单位胃蛋白酶/20g匀浆)，在37℃，300rpm水浴振 荡3h，模拟胃消化后，继续用1M NaOH调pH至6，每18ml混合浆液 加入6mL胰液(胰液中胰酶含量为4mg/mL，胆盐含量为40mg/mL)， 再用1M NaHCO₃调pH至7.4，在37℃，300rpm水浴振荡2h，6000rpm 条件下离心10min，上清液即为黑莓粗提取物。利用Millipore Pellicon超 滤系统，将上清液泵至截留分子量为10kDa的再生纤维素超滤膜表面， 收集滤出液，真空冷冻干燥，得到黑莓提取物。

经液相色谱测试可知，该黑莓提取物的主要成分如下表所示：

表1

成分 含量 矢车菊素-3-葡萄糖苷 70.5％ 矢车菊素-3-木糖苷 12.1％ 矢车菊素-3-草酸酰葡萄糖苷 11.2％ 矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷 3.1％ 飞燕草素-3-木糖苷 2.8％ 矢车菊素-3-阿拉伯糖苷 0.3％

实施例2

黑莓鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将黑莓匀浆酸化至pH＝2， 加入胃蛋白酶(8000单位胃蛋白酶/20g匀浆)，在37℃，200rpm水浴振 荡2h，模拟胃消化后，继续用1M NaOH调pH至6.5，每18ml混合浆 液加入6mL胰液(胰液中胰酶含量为4mg/mL，胆盐含量为30mg/mL)， 再用1M NaHCO₃调pH至7.4，在37℃，200rpm水浴振荡3h，8000rpm 条件下离心6min，上清液即为黑莓粗提取物。利用Millipore Pellicon超 滤系统，将上清液泵至截留分子量为10kDa的再生纤维素超滤膜表面， 收集滤出液，真空冷冻干燥，得到黑莓提取物。

实施例3

黑莓鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将黑莓匀浆酸化至pH＝1.5， 加入胃蛋白酶(7000单位胃蛋白酶/20g匀浆)，在37℃，250rpm水浴振 荡2.5h，模拟胃消化后，继续用1M NaOH调pH至7，每18ml混合浆 液加入6mL胰液(胰液中胰酶含量为4mg/mL，胆盐含量为35mg/mL)， 再用1M NaHCO₃调pH至7.4，在37℃，250rpm水浴振荡2.5h，7000rpm 条件下离心8min，上清液即为黑莓粗提取物。利用Millipore Pellicon超 滤系统，将上清液泵至截留分子量为10kDa的再生纤维素超滤膜表面， 收集滤出液，真空冷冻干燥，得到黑莓提取物。

性能测试

以实施例1-3制备的黑莓提取物为样品，测试其对丙烯酰胺诱导的肝脏细 胞氧化损伤的保护作用

(1)细胞存活率测定(MTT法)

按照参考文献的方法，采用MTT法检测细胞的存活率。将对数期的 HepG2细胞接种到96孔细胞培养板中(浓度为4×10³个细胞/孔)，孵育 24h后；在含有0.5mg/mL浓度黑莓提取物的条件下，用丙烯酰胺(2.5mM) 处理HepG2细胞24h，然后用MTT(0.5mg/mL)孵育4h。生成的沉淀 物溶解于200μL的DMSO中，用酶标仪检测费490nm处的吸光度。

细胞存活率(％)＝[A样品/A空白]×100％

如图1显示，HepG2细胞经2.5mM AA损伤2h后，细胞密度明显降 低，与正常组(Control组)相比，损伤率达到63.37％，具有统计学意 义(p<0.05)。实施例1制备的黑莓提取物在2.5mM AA浓度作用下时， 对HepG2细胞有较好的保护作用，与对照组相比，具有显著性差异，0.5 mg/mL黑莓提取物作用下，细胞存活率达85.19％(p<0.05)，上述结果证 实了黑莓提取物具有干预丙烯酰胺诱导的细胞损伤的保护作用。

(2)细胞内ROS水平检测(DCF荧光)

收集对数期的HepG2细胞，将细胞接种到6孔细胞培养板中(浓度 为6×10⁵个细胞/孔)，孵育24h后；在含有0.5mg/mL浓度黑莓提取物的 条件下，分别用丙烯酰胺(2.5mM)处理HepG2细胞24h，然后用DCFH-DA 染色，37℃孵育30min，将染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，然后 分析其荧光强度。

如图2显示，与未处理的对照组(control)相比，经2.5mM AA作用 肝细胞HepG2 2h，荧光强度明显增强(荧光强度265.6％)。实施例1制 备的黑莓提取物能显著降低AA诱导产生的ROS荧光强度，且具有统计 学意义，0.5mg/mL黑莓提取物效果最佳(荧光强度126.23％)。上述结 果表明黑莓提取物能有效降低AA诱导产生的细胞ROS水平。

(3)细胞线粒体膜电位MMP水平检测

收集对数期的HepG2细胞，将细胞接种到6孔细胞培养板中(浓度 为6×10⁵个细胞/孔)，孵育24h后；在含有0.5mg/mL浓度黑莓提取物的 条件下，分别用丙烯酰胺(2.5mM)处理HepG2细胞24h，然后采用线 粒体膜电位探针罗丹明123(RH123)荧光探针进行染色，37℃孵育30 min，将染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，然后分析其荧光强度。

一些研究表明线粒体膜电位变化与活性氧自由基(ROS)的产生相关 联。线粒体是细胞中制造能量的结构，它与细胞的活力密切相关，线粒体 膜电位能有效反映细胞内线粒体的功能状态。如图3显示，与未处理的对 照组(control)相比，经2.5mM AA作用肝细胞HEPG-22h，细胞膜电位 显著降低(荧光强度24.64％)。实施例2制备的黑莓提取物能显著抑制 AA诱导的细胞膜电位降低，0.5mg/mL黑莓提取物效果最佳(荧光强度 73.16％)。上述结果表明黑莓提取物能有效抑制AA诱导产生的细胞膜电 位降低。

(4)细胞内谷胱甘肽GSH水平检测

收集对数期的HepG2细胞，将细胞接种到6孔细胞培养板中(浓度 为6×10⁵个细胞/孔)，孵育24h后；在含有0.5mg/mL浓度黑莓提取物的 条件下，分别用丙烯酰胺(2.5mM)处理HepG2细胞24h，然后用荧光 探针染色，37℃孵育30min，将染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照， 然后分析其荧光强度。

GSH作为一种良好的细胞内氧化还原状态的调节剂，能清除氧自由 基，对毒物所致的氧化损伤具有保护作用。如图4显示，与未处理的对照 组(control)相比，经2.5mM AA作用肝细胞HepG2 2h，细胞谷胱甘肽 含量显著降低(荧光强度23.49％)。实施例2制备的黑莓提取物能显著抑 制AA诱导的细胞谷胱甘肽含量降低，0.5mg/mL黑莓提取物效果显著(荧 光强度72.2％)。上述结果表明黑莓提取物能有效抑制AA诱导产生的细 胞谷胱甘肽含量的降低。

(5)细胞核损伤Hochest水平检测

收集对数期的HepG2细胞，将细胞接种到6孔细胞培养板中(浓度 为6×10⁵个细胞/孔)，孵育24h后；在含有0.5mg/mL浓度黑莓提取物的 条件下，分别用丙烯酰胺(2.5mM)处理HepG2细胞24h，用70％酒精 固定20-30min，PBS洗净后用荧光探针染色，37℃孵育10-15min，将染 料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，然后分析其荧光强度。

如图5显示，与未处理的对照组(control)相比，经2.5mM AA作用 肝细胞HepG2 2h，细胞核出现明显损伤且荧光强度明显加强。实施例3 制备的黑莓提取物能缓解AA诱导产生的细胞核损伤并降低荧光强度， 0.5mg/mL黑莓提取物效果最佳。上述结果表明黑莓提取物能有效恢复AA 诱导产生的细胞核损伤。

最后，本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式 来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是 对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而 上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当 的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。