一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法

摘要

本发明涉及一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，首次使用衍生化试剂4’-羧基罗丹明对人参皂苷及其苷元中的游离羟基进行衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆质谱检测分析的质谱增敏分析方法。本发明的方法可用于分析检测10种人参皂苷4种人参皂苷苷元，通过计算分析检测结果，准确得到人参皂苷及其苷元的含量，该方法的灵敏度高，准确性佳，选择性好，并能显著地改善基质效应，对于药理学、药物筛选、人参药材及人参相关产品质量控制具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，尤其是涉及一种利用4’-羧基罗丹明对人参皂苷及其苷元的活性羟基进行衍生化后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析的质谱增敏分析方法。

背景技术

人参皂苷是人参中的主要活性成分，许多研究已报导人参皂苷具有抗癌保健等作用。绝大多数人参皂苷根据其苷元结构的不同可以分为原人参二醇（PPD）型和原人参三醇（PPT）型，而原人参二醇（PPD）与原人参三醇（PPT）也被认为是人参皂苷在生物体内的最终代谢产物并体现其药理学活性。人参皂苷因具有优越的生理学、药学特性，成为国内外研究的热门领域。

因为人参皂苷及其苷元缺乏可被高灵敏检测的分子结构，常规的光谱法、色谱法、质谱法、免疫法的检测灵敏度难以满足微量分析需求。文献《高效液相色谱-串联质谱法同时测定参麦注射液中9种皂苷》（中华中医药学刊，2014年第32卷，第1期）和《高效液相色谱串联质谱法分析紫红参中人参皂苷类成分》（药物分析杂志，2013年第33卷第5期），研究了色谱-质谱联用技术用于人参皂苷直接检测，但仅仅是针对注射液等皂苷含量较高的样品进行直接检测，具有灵敏度低、基质干扰严重等局限性。衍生化技术是提高人参皂苷及其苷元质谱检测灵敏度的有效手段，现有的衍生剂多利用苯甲酰氯等将人参皂苷母核上的羟基进行衍生化反应，反应时间长、条件苛刻，现有的衍生方法使用吡啶作为溶剂兼催化剂，吡啶挥发性强，具有刺激性，污染环境且基质效应较为明显，因此更需要寻找一种更为方便、有效、环境友好的高灵敏检测分析方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何准确且灵敏的分析检测人参皂苷及其苷元。本发明的目的是提供一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，首次使用了4’-羧基罗丹明对人参皂苷及其苷元中的活性羟基进行衍生化，同时利用乙腈替代了传统的挥发性强、具有刺激性的吡啶作为溶剂，解决了反应时间长等问题。利用4’-羧基罗丹明作为衍生剂联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法，由于罗丹明分子结构中含有一个稳定的季铵型阳离子，因此衍生化方法能够带来显著的质谱增敏检测效果。此法克服了常规方法的灵敏度不高等问题，且衍生化反应温和快捷，能够提高质谱检测灵敏度、选择性和准确度，并且大大改善了基质效应，本发明对生物样品中的痕量人参皂苷及其苷元进行定量分析对于药理学、药物筛选、人参药材及人参相关产品质量控制具有重要意义。

本发明提供的技术方案是：

一种基于衍生的人参皂苷及其苷元的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

a向人参皂苷及其苷元的萃取物中加入4’-羧基罗丹明， 2-氯-1-甲基碘代吡啶和4-二甲氨基吡啶，乙腈，摇匀，置于水浴中加热，4’-羧基罗丹明与人参皂苷及其苷元上的游离羟基进行衍生化反应，得到衍生化产物； 

b将a中的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱串联质谱法进行分析检测；

所述的人参皂苷及其苷元在C-20或C-3位置具有游离羟基。

所述的分析检测方法针对的分析物包括10种人参皂苷和4种人参皂苷苷元，所述的人身皂苷为原人参二醇型人参皂苷或原人参三醇型人参皂苷，所述的原人参二醇型人参皂苷为Rg3、 Rh2、Rs3或Compound K（C-K），所述的原人参三醇型人参皂苷为Re、Rf、 Rg1、Rg2、Rh1或F1，所述的苷元为原人参二醇型人参皂苷苷元或原人参三醇型人参皂苷苷元，所述的原人参二醇型人参皂苷苷元为原人参二醇（PPD）或人参二醇(PD)，所述的原人参三醇型人参皂苷苷元为原人参三醇(PPT)或人参三醇(PT)。具体结构式如下：

   

所述的步骤a中的人参皂苷及其苷元的萃取物的制备方法为超声辅助-分散液液微萃取：将人参皂苷及其苷元的水溶液加入到离心管中，去离子水定容，再加入萃取剂和分散剂，超声处理形成均匀的乳浊液体系后，放入高速离心机中，离心3分钟，转速为10000 r/min，离心所得沉积相用氮气吹干后，复溶于乙腈，制得人参皂苷及其苷元的萃取物。

上述人参皂苷及其苷元的水溶液为药理学等研究中的动物血浆处理液，以及人参药材及产品的提取液的实际样品。

上述超声辅助-分散液液微萃取技术中，萃取剂选自二氯甲烷，三氯甲烷，三氯乙烯，四氯乙烯及氯苯，更优选三氯甲烷；分散剂选自丙酮，乙腈，甲醇和乙醇，更优选甲醇。

上述超声处理时间为0-10分钟，最优化的为2分钟；超声萃取过程中，PH值调节在5-7之间。

所述的步骤a中衍生剂4’-羧基罗丹明（CSR）按照2012年Cardoso等报道的合成方法执行（European Journal of Organic Chemistry, 2012, 5810–5817），采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测用于监控合成反应进程，经过三次微波辅助反应处理（每次10 min）即可获得最高收率。粗产品采用半制备液相色谱法进行纯化，得到纯度为99%的CRS，产率45%。

为了便于控制各试剂的加入量，上述4’-羧基罗丹明溶于乙腈得到4’-羧基罗丹明/乙腈溶液，为了得到最高的衍生化效率，4’-羧基罗丹明溶液的摩尔浓度为人参皂苷及其苷元萃取物摩尔浓度的5-15倍，最优化的4’-羧基罗丹明溶液的摩尔浓度为人参皂苷及其苷元萃取物摩尔浓度的浓度的10倍。

所述2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI）溶于乙腈中制成质量浓度为1-10%的溶液，其摩尔浓度为4’-羧基罗丹明摩尔浓度的500-10000倍，更优选的为7000倍。

所述的4-二甲氨基吡啶（DMAP）溶于乙腈中制成质量浓度为12-25%的溶液，其摩尔浓度为4’-羧基罗丹明摩尔浓度100-1000倍，更优选的为500倍。

所述的衍生化反应为置于25-60 °C水浴中加热10-60分钟。更优化的反应时间与温度为在45 °C的水浴中加热30 min进行。

上述衍生化反应中，由于衍生化反应空间位阻和分子动力学的原因，一分子4’-羧基罗丹明与一分子的人参皂苷或其苷元反应生成一取代衍生化产物， 4’-羧基罗丹明优先与C-20位置上的羟基反应；如果C-20位置无游离羟基，就会再次优先于C-3位置上的游离羟基进行衍生化反应，由于罗丹明分子结构中含有一个稳定的季铵型阳离子，在质谱多反应监测模式中能够特异性的产生含有罗丹明结构的报告离子，带来显著的质谱增敏检测效果。以PPD和PD为例的衍生化反应示意图见图1。

所述的步骤b中衍生化产物经0.45 μm滤膜过滤后利用超高效液相色谱-质谱法进行分剂析检测。

所述的超高效液相色谱串联质谱法为超高效液相色谱三重四极杆质谱系统：安捷伦1290系列超高效液相色谱，配备安捷伦6460三重四极杆串联质谱系统组成。色谱分离使用安捷伦SB C18柱 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm) ，采用流动相线性梯度洗脱法，进样体积为2 μL，柱温恒定在30 °C。

上述的流动相为酸性乙腈/水溶液（含0.1%甲酸），流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为5%乙腈含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸。

上述的线性梯度洗脱法0分钟时，流动相A与流动相B的体积比为60:40；5 min时，流动相A与流动相B的体积比为35:65。

本发明中所述的2-氯-1-甲基碘代吡啶（CMPI），4-二甲氨基吡啶（DMAP），三氯甲烷，丙酮等化学试剂为分析纯，乙腈为高效液相色谱纯。

本发明提供的人参皂苷及其苷元的分析检测方法，还提供了一种最优化的质谱条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。

本发明中采用的超高效液相色谱三重四极杆质谱法能够进行定性、定量分析。以血浆中含量最低的人参苷元PPD和PPT为例，简要说明质谱定性、定量分析的过程。含有PPD和PPT的标准品溶液或者血浆样品溶液，经处理后得到CSR衍生物，用于接下来的质谱分析。

第一，采用色谱-质谱联用仪器的自动扫描功能，扫描得到PPD和PPT的CSR衍生物的母离子，分别对应[M-H₂O]⁺ （m/z分别为865.3）和[M-2H₂O]⁺（m/z 865.4），并在0-300 V范围内优化两种母离子的碎裂电压（Fragmentor）参数，PPD和PPT衍生物的最佳碎裂电压分别为260 V和280 V。第二，采用色谱-质谱联用仪器的自动扫描功能，扫描选取PPD和PPT的CSR衍生物丰度最高的产物离子，二者的主要产物离子均为m/z 551.0（定量产物离子） 和 m/z 623.1（定性产物离子），并在0-100 ev范围内优化碰撞能，以期得到最大的质谱分析灵敏度。总之，PPD和PPT的CSR衍生物的质谱多反应监测参数为：PPD-CSR，定量离子对865.3→551.0，碎裂电压260 V，碰撞能75 ev；定性离子对865.3→623.1，碎裂电压260 V，碰撞能83 ev。PPT-CSR，定量离子对865.4→551.0，碎裂电压280 V，碰撞能77 ev；定性离子对865.4→623.1，碎裂电压280 V，碰撞能88 ev。血浆中PPD和PPT的质谱多反应检测离子流图见图2。

所述的人参皂苷及其苷元标准品购自中国药品与生物制品检定所。

为了验证本发明所建立的联用技术的适用性，对于线性范围，检出限，定量限，富集因子，准确度，精密度，重复性，回收率以及基质效应都进行了详细的考察。对于生物样品中的上述人参皂苷或苷元，其线性范围在0.1–100 ng mL^-1，回归系数R²均大于0.98，显示出良好的线性，检出限分别为0.010-0.105 ng mL^-1，定量限分别为0.030-0.350 ng mL^-1。以PPT和PPD为例的分析方法验证回收率、基质效应、重现性、精密度和准确度结果结果见表1。结果表明，所建立的分析方法能够很好地应用于检测生物样品中的人参皂苷及其苷元。

表1

  

本发明中超声辅助-分散液液微萃取技术提取富集生物样品中的人参皂苷及其苷元，具有简单、快速、高效、绿色等优点；利用4’-羧基罗丹明对人参皂苷及其苷元进行衍生化反应条件温和快速，且由于罗丹明分子结构中含有一个稳定的季铵型阳离子，因此衍生化方法能够带来显著的质谱增敏检测效果。

本发明的基于衍生化的人参皂苷及其苷元的质谱增敏分析方法，首次使用4’-羧基罗丹明作为衍生化试剂对带有活性羟基官能团的人参皂苷及其苷元进行衍生化并利用超高效液相色谱三重四极杆质谱的质谱增敏分析，衍生化反应条件温和快速，仅用30分钟即可完成衍生化反应。检测方法灵敏度高，准确性及选择性佳，基质效应小，检出限分别为0.010-0.105 ng mL^-1，定量限分别为0.030-0.350 ng mL^-1，对于大鼠血浆、人参药材及产品等生物样品中人参皂苷及其苷元的检测效果完全能够满足实际需求。

附图说明   

图1为以PPD和PD为例，与衍生化试剂CSR分别在反应位点C-20、C-3的衍生反应示意图。

图2为血浆中PPD和PPT的质谱多反应检测离子流图。

 具体实施方式

为便于理解发明内容，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

人参药材中人参皂苷苷元PD和PT的检测

1.人参皂苷苷元PD和PT的超声辅助-分散液液微萃取

称取1.0 g人参药材粉末（北京、长春、济南同仁堂药店购得），按照文献方法进行提取处理和酸水解，使药材中的人参皂苷转化为PD和PT（理化检验-化学分册，2010, 46(5): 482-484），进行微萃取：吸取5ml上述样品溶液于尖底离心试管中，加入500 μL乙醇作为分散剂，150 μL氯仿作为萃取剂，再加入4.35 mL纯净水使总体积10 mL，室温下超声波辅助-分散液液微萃取3 min，离心2 min (12000 rpm)，吸取下层有机相氮气吹至干，加入200 μL乙腈复溶，制得浓度为2.0 × 10^-5 mol/L的人参皂苷及其苷元的萃取物。

2.人参皂苷苷元PD和PT萃取物的衍生化反应

向上述人参皂苷苷元萃取物中加入400 μL 浓度为2.0× 10^-4mol/L 的4’-羧基罗丹明/乙腈溶液，200 μL浓度为5w%的CMPI/乙腈溶液和200 μL浓度为20w% 的DMAP/乙腈溶液，封口后摇匀，置于45 °C水浴中反应30 min。制得衍生化产物。

3. 超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测

衍生化产物溶液经0.45 μm滤膜过滤后进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测。色谱分离：进样体积为2 μL，柱温恒定在30 °C。线性梯度洗脱程序8 min完成，流速为0.2 mL/min。流动相A为5%乙腈/水含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸。采用线性梯度洗脱法，0 min流动相组成为80%A+20%B，8 min时10%A+90%B。正离子模式，采用多反应监测模式。质谱条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。按照实施例2中质谱多反应监测实验参数的摸索方法，得到人参药材中PD和PT的质谱多反应监测实验条件：PD-CSR衍生物，定量离子对885.4→443.1，碎裂电压280 V，碰撞能75 ev；定性离子对885.4→399.1，碎裂电压280 V，碰撞能80 ev；PT-CSR衍生物，定量离子对885.4→443.1，碎裂电压280 V，碰撞能73 ev；定性离子对885.4→399.1，碎裂电压280 V，碰撞能78 ev。按照实施例3的实验条件得到不同药店人参药材中2种人参皂苷苷元（PD和PT）的检出限、定量限、线性范围、线性相关系数结果见表2。

表2

  比较实施例1

该实施例的方法过程与实施例1相同，只是在衍生化反应过程中采用苯甲酰氯为衍生化试剂。

比较实施例2

该实施例的方法过程与实施例1相同，只是在衍生化反应过程中采用3,5-二硝基苯甲酰氯为衍生化试剂。

下表3给出了实施例1与比较实施例1、2所得的数据结果

表3

实施例2

大鼠血浆中人参皂苷及其苷元的检测

1.人参皂苷及其苷元的超声辅助-分散液液微萃取

取50μL含有人参皂苷及其苷元且已脱蛋白的大鼠血浆到离心管中，用去离子水定容到2 mL（PH值5-7），快速注入含80 μL三氯甲烷及300 μL甲醇的混合溶液。超声波处理2 min后，形成均匀的乳浊液体系。将溶液放入高速离心机中，离心3 min，转速为10000 r/m。离心后有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，氮气吹干后复溶于适量的乙腈，制得浓度为2.0 × 10^-5 mol/L的人参皂苷及其苷元的萃取物。

2.人参皂苷及其苷元萃取物的衍生化反应

向步骤1中盛有人参皂苷及其苷元的萃取物中加入200μL浓度为3.0 × 10^-4mol/L的4’-羧基罗丹明/乙腈溶液，150μL浓度为10w%的 CMPI/乙腈溶液和150 μL浓度为10w% 的DMAP/乙腈溶液，封口后摇匀，置于45 °C水浴中反应30 min。制得衍生化产物。

3. 超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测

衍生化产物溶液经0.45 μm滤膜过滤后进行UHPLC-MS/MS（MRM）分析检测。色谱分离：进样体积为2 μL，柱温恒定在30 °C。线性梯度洗脱程序5 min完成，流速为0.2 mL/min。流动相A为5%乙腈/水含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸。采用线性梯度洗脱法，0 min流动相组成为60%A+30%B，5 min时35%A+65%B。正离子模式，采用多反应监测模式。质谱条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。

实施例3

大鼠血浆中人参皂苷及其苷元的检测

1.人参皂苷及其苷元的超声辅助-分散液液微萃取

取50μL含有人参皂苷及其苷元且已脱蛋白的大鼠血浆到离心管中，用去离子水定容到2

mL（PH值5-7），快速注入含100 μL三氯甲烷及350 μL甲醇的混合溶液。超声波处理2 min后，形成均匀的乳浊液体系。将溶液放入高速离心机中，离心3 min，转速为10000 r/m。离心后有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，氮气吹干后复溶于适量的乙腈，制得浓度为2.0 × 10^-5 mol/L的人参皂苷及其苷元的萃取物。

2.人参皂苷及其苷元萃取物的衍生化反应

向上述步骤1中盛有人参皂苷及其苷元的萃取物的小瓶中加入600μL浓度为1.0 × 10^-4 mol/L 4’-羧基罗丹明/乙腈溶液，200μL 浓度为10w%的 CMPI/乙腈溶液和200 μL浓度为为25w% 的DMAP/乙腈溶液，封口后摇匀，置于45 °C水浴中反应30 min。制得衍生化产物。

3. 超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测

检测分析中所用设备和各参数同实施例2.

下表4给出了按照实施例2和实施例3的实验条件得到10种人参皂苷（Rg3、Rh2、Rs3、Compound K、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1和F1）和2种苷元（PPD和PPT）的检出限、定量限、线性范围、线性相关系数。

表4

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。