用于生物毒性检测的肺组织模型及生物毒性检测方法

摘要

本发明公开了一种用于生物毒性检测的肺组织模型和检测方法，所述肺组织模型包括：气管，所述气管内限定有气体通道，所述气管的两端设有分别与所述气体通道导通的进气口和出气口；血管，所述血管内限定有血液通道，所述血管的两端设有分别与所述血液通道导通的进液口和出液口；和肺泡单元，所述肺泡单元内限定有腔室，所述肺泡单元的壁形成为弹性透气膜，所述肺泡单元设在所述血液通道内且所述腔室与所述气体通道导通。根据本发明实施例的肺组织模型，实现了模拟体内肺部血液的气体交换功能以及呼吸应变作用；通过在肺泡单元部分种植细胞，在后续培养过程中可实现体内肺泡单元的结构和功能的仿生以及模拟免疫细胞的炎症反应。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，涉及一种用于生物毒性检测的肺组织模型及生物 毒性检测方法，更具体地，涉及肺组织模型的体外仿生构建以及利用该模型进行环境PM2.5 生物毒性以及药物生物毒性的检测。

背景技术

据北京市环保局公布的数据，2013年北京市优良天数仅为176天，不足50％。而五、 六级重污染天数累计达58天。空气污染(“雾霾”)已经成为中国面临的严重问题。空气 污染可以引起急性和慢性呼吸道疾病，心脏病和肺癌等疾病，严重威胁人类健康。2014年 3月25日，世界卫生组织公布的最新数据显示2012年全球因空气污染死亡的人数高达700 万。其中，室外空气污染导致约370万人过早死亡。其主要原因是暴露于PM10中。

PM10(particulate matter 10)是指空气中直径小于10微米的颗粒物。短期的暴露 于PM10中会造成呼吸系统疾病，但长期致死的原因主要是由于直径更小的PM2.5。空气中 PM2.5的来源复杂，其中包括物质燃烧、汽车尾气、尘土等。同样，PM2.5的颗粒成分也非 常复杂，既有有机物质，也有金属等物质。不同来源和成分的PM2.5颗粒的致病机理也不 尽相同。

目前，针对PM2.5毒性的检测方法，主要是利用物理方法检测空气中粒子的数量，然 后再根据数量范围估算出其生物毒性。但如前文所述，PM2.5成分的复杂性，决定了同浓 度的不同成分的颗粒物的生物毒性具有差异，物理的检测方法已经不能准确表征PM2.5的 生物毒性。

在生物体中，肺是承担呼吸作用的重要器官，包含上呼吸道和下呼吸道，由40余种细 胞组成，结构和组成极为复杂。与血液直接进行气体交换的是肺泡。人肺中具有肺泡300 多万个，面积约70m²，平均直径200μm。PM2.5等有害气体主要影响的是肺泡，肺泡主要 有三种细胞组成，Ⅰ型肺泡细胞，Ⅱ型肺泡细胞和巨噬细胞。Ⅰ型肺泡细胞，在肺泡内表 面展开形成紧密连接，占肺泡约95％的面积，而Ⅱ型肺泡细胞合成和分泌细胞活性剂，主 要起分泌和祖细胞的功能。巨噬细胞则存在于肺间质，吞噬、清除外来的尘粒或病原。

研究者对纳米粒子引发肺及相关疾病的机制仍旧缺乏足够的了解。这是因为这些关于 粒子生物毒性的研究工作多是基于传统的二维细胞培养模型和动物模型。而传统的动物模 型涉及免疫准确、成本和伦理等问题，不是PM2.5毒性研究的理想模型。二维细胞培养模 型缺乏体内肺组织的三维特征，使之也不能准确的表征纳米粒子的生物毒性。因此，后续 的研究者利用三维体外肺模型研究肺病机理，环境毒性，药物安全等领域。但面对体内复 杂的肺部组织结构，如何构建一个高度仿生的三维体外肺模型，是一个重要且困难的问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了 一种用于生物毒性检测的肺组织模型，所述用于生物毒性检测的肺组织模型可以实现体内 肺组织的仿生。

本发明还提出了一种PM2.5生物毒性的检测方法。

本发明还提出了一种药物生物毒性以及吸入式药物生物毒性的检测方法。

根据本发明实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型，包括：气管，所述气管内限定 有气体通道，所述气管的两端设有分别与所述气体通道导通的进气口和出气口；血管，所 述血管内限定有血液通道，所述血管的两端设有分别与所述血液通道导通的进液口和出液 口；和肺泡单元，所述肺泡单元内限定有腔室，所述肺泡单元的壁形成为弹性透气膜，所 述肺泡单元设在所述血液通道内且所述腔室与所述气体通道导通。

根据本发明实施例的肺组织模型，实现了模拟体内肺部血液的气体交换功能以及呼吸 应变作用；通过在肺泡单元部分种植细胞，在后续培养过程中可实现体内肺泡单元的结构 和功能的仿生以及模拟免疫细胞的炎症反应。

另外，根据本发明上述实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型还可以具有如下附加 的技术特征：

根据本发明的一个实施例，所述肺泡单元形成为空心球状，所述肺泡单元与所述气管 之间设有连接管，所述连接管导通所述腔室和所述气体通道。

根据本发明的一个实施例，所述连接管包括两个，其中一个所述连接管与所述进气口 连通且另一个所述连接管与所述出气口导通。

根据本发明的一个实施例，所述血管中部设有容纳腔，所述容纳腔与所述血液通道导 通且所述容纳腔的径向尺寸大于所述血液通道的径向尺寸，所述肺泡单元设在所述容纳腔 内。

根据本发明的一个实施例，所述用于生物毒性检测的肺组织模型还包括：基底层；血 管层，所述血管层设在所述基底层上，所述血管设在所述血管层内；气管层，所述气管层 设在所述血管层上，所述气管设在所述气管层内；和封盖层，所述封盖层设在所述气管层 上方并覆盖所述气管层。

根据本发明的一个实施例，所述气管、血管和肺泡单元分别由天然生物材料、合成生 物材料、聚合物、金属和非金属中的一种或多种制成。

根据本发明的一个实施例，所述肺泡单元的壁形成为多孔膜。

根据本发明实施例的PM2.5生物毒性的检测方法，包括以下步骤：S1：提供根据本发 明实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型；S2：在所述气管内灌注含有第一细胞的第一 培养基，在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基；S3：待所述第一细胞在肺泡单元 内壁上贴壁生长，且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养；S4：停止向所 述气管灌注所述第一培养基，向所述气管内通入含有PM2.5颗粒物的空气并保持气压脉冲； S5：将所述第二培养基更换为第三培养基，并持续培养；S6：检测所述肺组织模型的细胞 毒性。

根据本发明的一个实施例，所述第一细胞为上皮细胞和/或免疫细胞，所述第一培养基 为上皮细胞培养基，所述第二细胞为内皮细胞，所述第二培养基为内皮细胞培养基，所述 第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基，第三培养基中包含游离的免疫细胞。

根据本发明的一个实施例，所述用于生物毒性检测的肺组织模型通过微制造方法、软 光刻方法、3D打印方法中的一种或多种制备而成。

根据本发明的一个实施例，所述肺泡单元的制造方法包括：S11：制造内芯；S12：通 过电喷在所述内芯的表面制造膜结构；S13：去除所述内芯，得到所述肺泡单元。

根据本发明的一个实施例，所述步骤S1与所述步骤S2通过细胞打印技术集成实现。

根据本发明的一个实施例，所述细胞毒性的检测方法包括检测细胞活性、纳米粒子渗 透率和炎症反应。

根据本发明实施例的药物生物毒性的检测方法，包括以下步骤：S1：提供根据本发明 实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型；S2：在所述气管内灌注含有第一细胞的第一培 养基，在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基；S3：待所述第一细胞在肺泡单元内 壁上贴壁生长，且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养；S4：停止向所述 气管灌注所述第一培养基，向所述气管内通入空气并保持气压脉冲；S5：将所述第二培养 基更换为第三培养基，并持续培养；S6：将药物加入到第三培养基内，并持续培养；S7： 检测所述肺组织模型的细胞毒性。

根据本发明的一个实施例，所述第一细胞为上皮细胞和/或免疫细胞，所述第一培养基 为上皮细胞培养基，所述第二细胞为内皮细胞，所述第二培养基为内皮细胞培养基，所述 第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基，第三培养基中包含游离的免疫细胞。

根据本发明的一个实施例，所述细胞毒性的检测方法包括检测细胞活性、纳米粒子渗 透率和炎症反应。

根据本发明实施例的吸入式药物生物毒性的检测方法，包括以下步骤：S1：提供根据 本发明实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型；S2：在所述气管内灌注含有第一细胞的 第一培养基，在所述血管内灌注含有第二细胞的第二培养基；S3：待所述第一细胞在肺泡 单元内壁上贴壁生长，且所述第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进行灌流培养；S4：停止 向所述气管灌注所述第一培养基，向所述气管内通入空气并保持气压脉冲；S5：将所述第 二培养基更换为第三培养基，并持续培养；S6：将药物弥散在空气内，并向所述气管内通 入含有药物的空气并保持气压脉冲，并持续培养；S7：检测所述肺组织模型的细胞毒性。

根据本发明的一个实施例，所述第一细胞为上皮细胞和/或免疫细胞，所述第一培养基 为上皮细胞培养基，所述第二细胞为内皮细胞，所述第二培养基为内皮细胞培养基，所述 第三培养基为上皮细胞与内皮细胞混合培养基，第三培养基中包含游离的免疫细胞。

根据本发明的一个实施例，所述细胞毒性的检测方法包括检测细胞活性、纳米粒子渗 透率和炎症反应。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型的结构示意图；

图2是根据本发明实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型的肺泡单元、气管以及血 管的连接示意图；

图3是根据本发明实施例的PM2.5生物毒性的检测方法；

图4是根据本发明实施例的药物生物毒性的检测方法；

图5是根据本发明实施例的吸入式药物生物毒性的检测方法。

附图标记：

肺组织模型100；

封盖层1；气管层2；血管层3；基底层4；进液口5；血管6；出液口7；进气口8； 气管9；肺泡单元10；出气口11；容纳腔12；气体通道13；血液通道14；连接管15。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、 “厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、 “外”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置 关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具 有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性 或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示 或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个 以上，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以 是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征 在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅 仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面” 可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定” 等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是 机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两 个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根 据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

下面结合附图详细描述根据本发明第一方面实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型 100。

参照图1至图2所示，根据本发明实施例的用于生物毒性检测的肺组织模型100包括 气管9、血管6和肺泡单元10。

气管9内限定有气体通道13，气管9的两端设有进气口8和出气口11，进气口8和出 气口11分别与气体通道13导通。血管6内限定有血液通道14，血管6的两端设有进液口 5和出液口7，进液口5和出液口7分别与血液通道14导通。肺泡单元10设在血液通道 14内，肺泡单元10内限定有腔室，腔室与气体通道13导通。肺泡单元10的壁形成为弹 性透气膜。气体可从进气口8进入到气体通道13内，然后经过气体通道13进入到肺泡单 元10的腔室内，腔室内的气体可与血液通道14内的气体进行气体交换，交换后的气体从 经过气体通道13后从出气口11排出。

根据本发明实施例的肺组织模型100，肺泡单元10的壁形成为弹性透气膜，肺泡单元 10可以随气体通道13中气体压力的变化而膨胀和收缩，同时还可以使肺泡单元10的内部 与外部可以相通，肺泡单元10内的气体可与血液通道14内的气体进行交换，实现了模拟 体内肺部血液的气体交换功能。同时，通过在肺泡单元10部分种植细胞，种植细胞后的肺 泡单元10在后续培养过程中可实现体内肺泡的结构和功能的仿生。

具体而言，可利用气体通道13模拟体内气管9，可利用血液通道14模拟体内的肺部毛 细血管6。肺组织模型100在后续培养过程中，当气体被压入肺泡单元10时，肺泡单元10 即可胀大，从而可以模拟体内呼吸时的吸气过程；当减小气体压力后，肺泡单元10可收缩， 实现模拟体内呼吸作用时的呼气过程。

另外，还可以在肺泡单元10处培养免疫细胞来模拟体内的炎症反应，从而实现了体内 肺器官的高度仿生模拟。

可选地，肺组织模型100的进气口8可与空气连通，空气可从进气口8进入到气体通 道13内。其中，空气成分可以是洁净的空气，也可以是人工合成的已知成分和含量的PM2.5 纳米粒子的空气，还可以是随机产生或采集的含有PM2.5纳米粒子的空气。其中，含PM2.5 颗粒物的气体可为包含各种来源(金属、非金属)和粒子直径的人工/非人工合成的含颗粒 物的气体。

空气从进气口8进入气体通道13的方式可以是无压渗透式，也可以是强迫注入式。其 中，强迫注入方式可以包括注射泵、蠕动泵、有压力的气瓶等。在实际操作中，可以将注 射泵、蠕动泵或者压力气瓶等连接在进气口8处，从而使气体可以容易地进入到气体通道 13内。

血管6的进液口5可与营养液供应装置相连，营养液可通过进液口5进入到血液通道 14内。营养液供应装置可以是注射泵、蠕动泵、脉动泵等动力装置。

肺组织模型100在后续培养时，可以采用静态培养(即不开启动力装置)，也可以采用 动态培养，即开启动力装置。

研究表明：球状肺泡仿生结构对构建肺组织的准确性具有重要影响。有利地，如图2 所示，根据本发明的一些实施例，肺泡单元10可形成为空心球状体结构。由此，可以更准 确的模拟生物体的肺组织模型100，实现了肺泡球状结构单元的体外仿生构建。该仿生单 元实现了模拟体内肺部血液的气体交换功能，呼吸应变作用，以及免疫细胞的炎症反应的 仿生功能，为生物毒性检测提供更为有效且可靠的保证。

研究表明：气液界面(空气—血管界面)、免疫细胞以及呼吸应变作用等特征对构建肺 组织的准确性具有重要影响。而根据本发明实施例的肺组织模型100，可在维持肺组织细 胞正常存活的前提下，创新性地构建了球状肺泡仿生结构并且可以与气液界面(空气—血 管界面)，和/或免疫细胞，和/或呼吸应变作用等肺组织功能集成实现高度仿生的肺组织模 型100。

同时还可以根据需要选择性地实现肺组织气液界面(空气—血管界面)，免疫细胞，呼 吸应变作用及球状肺泡仿生结构四大特征中一种或多种组合的体外重构，为生物毒性检测 提供更有效可靠的手段。

可选地，肺泡单元10的直径可为100微米-200微米，膜厚可为1微米-10微米。

如图2所示，肺泡单元10与气管9之间可设有连接管15，连接管15可以将腔室和气 体通道13导通。具体地，连接管15的一端可与腔室导通，连接管15的另一端可与气体通 道13导通。由此，从进气口8进入气体通道13内的气体可通过连接管15进入到肺泡单元 10的腔室内，同时腔室内的经过交换的气体可通过连接管15进入到气体通道13，进而从 出气口11排出肺组织模型100。

有利地，连接管15可包括两个，其中一个连接管15可与进气口8连通，另一个连接 管15可与出气口11导通。也就是说，一个连接管15可作为气体进入腔室的进气通道，另 一个连接管15则可作为气体从腔室内排出的出气通道。由此，气体进入和排出腔室分别各 占一个通道，进气和出气可独立开来，有效避免了进气与出气发生混合。

血管6的中部可设有容纳腔12，容纳腔12可与血液通道14导通。同时容纳腔12的径 向尺寸可大于血液通道14的径向尺寸，肺泡单元10可设在容纳腔12内。例如，血液通道 14的径向尺寸可为50微米-200微米。容纳腔12可形成为柱状腔或者其它形状的腔室。例 如，容纳腔12可形成为圆柱形腔，容纳腔12的径向尺寸可为300微米，容纳腔12的深度 (即轴向尺寸)可为300微米。气体通道13的直径可为50微米-200微米。

在肺组织模型100的培养过程中，血液通道14的内壁面上可培养有内皮细胞。肺泡单 元10的内壁面可培养有肺上皮细胞和/或免疫细胞，肺泡单元10的外壁可培养有内皮细胞。 由此，可以实现体内肺组织器官的高度仿生。其中，根据本发明的一些示例，肺上皮细胞、 免疫细胞及内皮细胞可以包含原代细胞和/或干细胞和/或已建系的细胞和/或去分化后再 分化的细胞。也就是说，肺上皮细胞、免疫细胞及内皮细胞均可以包含原代细胞、干细胞、 已建系的细胞和去分化后再分化的细胞中的一种或多种。

肺泡单元10的壁可形成为多孔膜。即肺泡单元10可为多孔膜结构。该多孔膜结构的 肺泡单元10可以使肺泡单元10的内部与外部相通，进一步模拟了体内肺部血液的气体交 换作用。并且可以通过培养免疫细胞来模拟体内的炎症反应，从而实现体内肺器官的高度 仿生模拟。

气管9可以由天然生物材料、合成生物材料、聚合物、金属和非金属中的一种或多种 制成。同样地，血管6和肺泡单元10也可以由以上材料中的一种或多种制成，这可以根据 实际情况进行合理选择。另外，肺泡单元10还可通过营养材料制作形成。

具体而言，天然生物材料可以为明胶及其衍生物、藻酸盐及其衍生物、琼脂、基质胶、 胶原、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白、纤维连接蛋白等。合成生物材料及聚 合物可以为聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚 二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基 甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等。金属及非 金属材料可以为硅、钛及钛合金、铜及铜合金、钢、铝及铝合金等。

需要说明的是，制造气管9、血管6或肺泡单元10的材料可以是上述材料中的一种或 多种的混合物。可以理解的是，天然生物材料、合成生物材料、金属及非金属材料的具体 种类不仅限于以上所描述的，还可以是其他物质，在此不再详细描述。

根据本发明实施例的肺组织模型100的最终实现形式可以是芯片，也可以是其他类似 的模型表现形式，例如生物反应器等。例如，根据本发明的一些实施例，肺组织模型100 为芯片式肺组织模型。具体地，如图1所示，肺组织模型100除了包括气管9、血管6、肺 泡单元10之外，还包括基底层4、血管层3、气管层2以及封盖层1。

如图1所示，血管层3可设在基底层4上，气管层2可设在血管层3上，封盖层1可 设在气管层2的上方并且覆盖气管层2。血管6设在血管层3内，气管9设在气管层2内。 由此，肺组织模型100由下到上依次为基底层4、血管层3、气管层2和盖封层。并且其中 夹设有血管6和气管9以及肺泡单元10。该肺组织模型100可形成为芯片式的结构，当其 中培植有细胞时，即可实现在芯片尺度上对体内肺组织的结构和功能的高度仿生，可以更 准确地进行生物毒性的检测。

根据本发明实施例的肺组织模型100，可以根据需要选择性地实现肺组织气液界面(空 气—血管6界面)、免疫细胞、呼吸应变作用及球状肺泡仿生结构四大特征中一种或多种组 合的体外重构。该模型可用于环境PM2.5生物毒性的检测，也可应用于研究肺病机理以及 药物安全等领域。

下面结合附图详细描述根据本发明第二方面实施例的PM2.5生物毒性的检测方法。

如图3所示，根据本发实施例的PM2.5生物毒性的检测方法可包括以下步骤：

S1：提供上面所描述的用于生物毒性检测的肺组织模型。

S2：在肺组织模型的气管内灌注含有第一细胞的第一培养基，在肺组织模型的血管内 灌注含有第二细胞的第二培养基。

S3：待第一细胞在肺泡单元内壁上贴壁生长并且第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进 行灌流培养。

S4：停止向气管灌注第一培养基，然后向气管内通入含有PM2.5颗粒物的空气并保持 气压脉冲。

S5：将第二培养基更换为第三培养基，并持续培养，检测肺组织模型的细胞毒性。

其中，在步骤S2中，第一细胞可为上皮细胞和/或免疫细胞，第一培养基可为上皮细 胞培养基。第二细胞可为内皮细胞，第二培养基可为内皮细胞培养基。第三培养基可为上 皮细胞与内皮细胞混合培养基，第三培养基中包含游离的免疫细胞，比如血液中的游离免 疫细胞，白细胞等。在实际制备中也可以通过细胞打印技术将S1与S2集成在一起实现， 即将模型的制备和细胞的灌注集成在一起实现。由此，在模型的制造过程中可实现细胞在 通道内的可控分布。

其中，肺组织模型可通过微制造方法、软光刻方法、3D打印方法中的一种或多种制备 而成。其中，3D打印方法可包括直接3D打印方法和间接3D打印方法等。直接3D打印方 法是指芯片和/或细胞一体打印完成。间接3D打印方法指利用3D打印方法制造通道和/或 模具以辅助模型的制造。肺组织模型的制造方法可以是上述方法的一种，也可以是上述多 种方法的组合。

进一步地，肺组织模型中的肺泡单元的制造方法可包括以下步骤：

S11：制造内芯。

S12：通过电喷在内芯的表面制造膜结构。

S13：去除内芯，得到肺泡单元。

具体地，肺泡单元的制造可以为利用可去除材料(比如糖)制造内芯，再通过电喷在 内芯表面制造膜结构，最后去除掉内芯来即可。当然，肺泡单元也可以是通过3D打印方法 直接制造。

在步骤S5中，细胞毒性的检测方法可以包括检测细胞活性、纳米粒子渗透率和炎症反 应。可以理解的是，以上所描述的生物毒性的检测方法仅作为示例进行描述，细胞毒性的 检测方法不仅限于此，还可以是其他可以评估肺细胞和/或组织生物学性能的方法，在此不 再详细描述。

下面结合附图详细描述根据本发明第三方面实施例的药物生物毒性的检测方法。

如图4所示，根据本发明实施例的药物生物毒性的检测方法可包括以下步骤：

S1：提供上面所描述的用于生物毒性检测的肺组织模型。

S2：在肺组织模型的气管内灌注含有第一细胞的第一培养基，在肺组织模型的血管内 灌注含有第二细胞的第二培养基。

S3：待第一细胞在肺泡单元内壁上贴壁生长并且第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进 行灌流培养。

S4：停止向气管灌注第一培养基，然后向气管内通入空气并保持气压脉冲。

S5：将第二培养基更换为第三培养基，并持续培养。

S6：将待检测的药物加入到第三培养基内，并持续培养。

S7：检测肺组织模型的生物毒性。

其中，在步骤S2中，第一细胞可为上皮细胞和/或免疫细胞，第一培养基可为上皮细 胞培养基。第二细胞可为内皮细胞，第二培养基可为内皮细胞培养基。第三培养基可为上 皮细胞与内皮细胞混合培养基，第三培养基中包含游离的免疫细胞，比如血液中的游离免 疫细胞，白细胞等。

在步骤S7中，细胞毒性的检测方法可以包括检测细胞活性、纳米粒子渗透率和炎症反 应。可以理解的是，以上所描述的细胞毒性的检测方法仅作为示例进行描述，细胞毒性的 检测方法不仅限于此，还可以是其他可以评估肺细胞和/或组织生物学性能的方法，在此不 再详细描述。

下面结合附图详细描述根据本发明第四方面实施例的吸入式药物生物毒性的检测方 法。

如图5所示，根据本发明实施例的吸入式药物生物毒性的检测方法可包括以下步骤：

S1：提供上面所描述的用于生物毒性检测的肺组织模型。

S2：在肺组织模型的气管内灌注含有第一细胞的第一培养基，在肺组织模型的血管内 灌注含有第二细胞的第二培养基。

S3：待第一细胞在肺泡单元内壁上贴壁生长并且第二细胞在血管内壁上贴壁生长后进 行灌流培养。

S4：停止向气管灌注第一培养基，然后向气管内通入空气并保持气压脉冲。

S5：将第二培养基更换为第三培养基，并持续培养。

S6：将待检测的药物弥散在空气内，并向气管内通入含有药物的空气并保持气压脉冲， 并且持续培养。

S7：检测肺组织模型的细胞毒性。

其中，在步骤S2中，第一细胞可为上皮细胞和/或免疫细胞，第一培养基可为上皮细 胞培养基。第二细胞可为内皮细胞，第二培养基可为内皮细胞培养基。第三培养基可为上 皮细胞与内皮细胞混合培养基，第三培养基中包含游离的免疫细胞，比如血液中的游离免 疫细胞，白细胞等。

在步骤S7中，细胞毒性的检测方法可以包括检测细胞活性、纳米粒子渗透率和炎症反 应。可以理解的是，以上所描述的细胞毒性的检测方法仅作为示例进行描述，细胞毒性的 检测方法不仅限于此，还可以是其他可以评估肺细胞和/或组织生物学性能的方法，在此不 再详细描述。

实施例1

本实施是通过构建肺组织模型进行PM2.5肺毒性评价。

一、肺组织模型介绍

本实施例中的肺组织模型为芯片式结构。肺芯片装置主要由气管、血管和肺泡单元三 部分组成，其中气管为直径200微米的通道，与肺泡单元的内部相连。血管为直径200微 米的通道，与肺泡单元的外部相连。在与肺泡单元相连的位置为直径300微米及深度300 微米的圆柱腔体结构。其内壁培养有内皮细胞。肺泡单元为直径200微米的空心球状体结 构，膜厚为10微米。并且肺泡单元膜为多孔结构，膜内表面培养有肺上皮细胞，外表面培 养有内皮细胞。

肺芯片装置的主体材料为明胶-甲基丙烯酸(GelMA)，只有基底层为玻璃。气管的进气 口与含有人工合成的已知成分和含量的PM2.5纳米粒子的空气泵相连，气管的出气口与空 气阀相连。血管的进液口与装有培养基的注射泵相连，血管的出液口与废液收集装置相连。

二、肺组织模型的制造及使用

1.芯片制造与培养工艺

3D可打印肺组织芯片模型的数据产生。具体操作如下：利用三维制图软件(Solidworks) 设计肺芯片的三维结构图，并保存为STL格式，再利用分层软件(自开发软件)将肺芯片 的三维结构图转化成可被打印机识别的文件格式(cli)。

2.材料的制备

A)芯片材料(明胶-甲基丙烯酸)的制备

按照如下方法制备明胶-甲基丙烯酸甲酯：1g明胶(G1890，Sigma,美国)粉末加入 10mL DPBS溶液中，70℃水浴加热，均匀搅拌至完全融化后，以0.5mL/min缓慢加入1mL 甲基丙烯酸甲酯(276685，Sigma,美国)，反应2h后取下，待溶液冷却至室温，加入40mL DPBS溶液稀释，用截留分子量12000-14000的透析袋在去离子水中60℃透析3天，冷冻干 燥2天，形成白色蓬松泡沫状固体，为明胶-甲基丙烯酸甲酯聚合物，-80℃干燥保存。

将上述制备好的明胶-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培养液(11965092，Invitrogen，美 国)中，60℃助溶3小时，形成浓度为0.1g/ml明胶-甲基丙烯酸甲酯溶液，再添加0.005g/ml 的光引发剂(I2959，2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，106797-53-9，英力，中国) 粉末溶于0.1 g/ml明胶-甲基丙烯酸甲酯溶液中，Votex振荡混匀，用0.2μm滤膜过滤后 分装成1ml/管备用，避光4℃低温保存。并且之后的相关操作均在避光的条件下进行。

B)牺牲层材料(明胶)的制备

0.5g明胶(G1890，Sigma,美国)粉末加入10mL DPBS溶液中，70℃水浴加热，均匀 搅拌至完全融化后，用0.2μm滤膜过滤后分装成1ml/管备用，4℃低温保存。

3.芯片打印工艺

开启3D细胞打印机，将成形室的温度设定为10℃，将喷头温度设置为25摄氏度。将 制备的两种打印墨水在37度融化30分钟后，分别吸入打印机的两个喷头中。再将构建的 含有将打印芯片数据信息的cli文件导入3D细胞打印机中，运行程序使3D细胞打印机自 动完成设计芯片的打印。值得说明的是，芯片的主体材料为GelMA，而明胶被打印在设计 的通道中，在打印过程中，起到支撑作用，避免GelMA的悬空打印。两种材料均在25度及 以上为溶胶态，10度为凝胶态，而GelMA可以被紫外线交联，明胶不能交联。

芯片封闭后，紫外线(5mW/cm2)固化60s后，将成形室温度升高到37度，3分钟后， 将已经融化了的明胶牺牲层通过通道口吸出来，而GelMA芯片主体得到保留，完成对所设 计芯片结构的制造。

4.灌注细胞构建肺组织模型

将芯片进行紫外线灭菌30分钟后，将气体通道和血液通道分别灌注3μg/ml的胶原溶 液进行包被，通过气管的进气口(8)灌注含有肺上皮细胞NCI H441的培养基RPMI-1640 (含10％血清及添加物)，并通过血管的进液口(5)灌注含有人肺微血管内皮细胞的培养 基EBM-2(含5％血清及生长因子)，待培养基充满通道后，静置培养2小时，待细胞贴壁后， 进行5天灌流培养，以让细胞充分融合形成紧密连接。

5.对PM2.5空气的生物毒性进行检测

撤掉气体通道的培养基供应，改为通含有PM2.5颗粒物的空气，并保持有0.3HZ的气 压脉冲，以让肺泡单元实现有规律地机械地收缩和膨胀，将血液通道的培养基改为EBM-2 和RPMI-1640培养基的1:1混合培养基，再进行持续培养两周。利用CCK-8试剂盒评估细 胞毒性。以上所述培养均在37摄氏度，5％CO₂的培养箱中进行。

实施例2

本实施是在实施例1构建的肺组织模型的基础上进行药物肺毒性评价。

一、肺组织模型介绍

本实施例中的肺组织模型与实施例1中的肺组织模型相同，在此不再详细描述。

二、肺组织模型的制造及使用

本实施例中的1、芯片制造和培养工艺，2、材料制备工艺，3、芯片打印工艺，4、灌 注细胞构建肺组织模型的步骤与实施例1中的步骤1,2,3和4相同，在此不再详细描述。

5.对药物的生物毒性进行检测

撤掉气体通道的培养基供应，改为通含有正常空气，并保持有0.3HZ的气压脉冲，以 让肺泡单元实现有规律地机械地收缩和膨胀；将血液通道的培养基改为EBM-2和RPMI-1640 培养基的1:1混合培养基，再进行持续培养一周。将待检测药物A按所需剂量溶入EBM-2 和RPMI-1640培养基的1:1混合培养基，并替代血液通道的培养基，再持续培养1周。利 用CCK-8试剂盒评估细胞毒性。以上所述培养均在37摄氏度、5％CO₂的培养箱中进行。

实施例3

本实施是在实施例1构建的肺组织模型的基础上进行吸入式药物肺毒性评价。

一、肺组织模型介绍

本实施例中的肺组织模型与实施例1中的肺组织模型相同，在此不再详细描述。

二、肺组织模型的制造及使用

本实施例中的1、芯片制造和培养工艺，2、材料制备工艺，3、芯片打印工艺，4、灌 注细胞构建肺组织模型的步骤与实施例1中的步骤1,2,3和4相同，在此不再详细描述。

5.对吸入式药物的生物毒性进行检测

撤掉气体通道的培养基供应，改为通含有正常空气，并保持有0.3HZ的气压脉冲，以 让肺泡单元实现有规律地机械地收缩和膨胀，将血液通道的培养基改为EBM-2和RPMI-1640 培养基的1:1混合培养基，再进行持续培养一周。将待检测药物B按所需剂量弥散分布在 正常空气中，并替代气体通道的空气并保持有0.3HZ的气压脉冲，再持续培养1周。利用 CCK-8试剂盒评估细胞毒性。以上所述培养均在37摄氏度，5％CO2的培养箱中进行。

根据本发明实施的用于生物毒性检测的肺组织模型的其他构成以及使用该模型进行 PM2.5空气、药物以及吸入式药物生物毒性的检测方法的其他操作对于本领域的普通技术 人员来说是可知的，在此不再详细描述。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点 包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必 须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的 技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。