通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法

摘要

本发明涉及通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法。目前促进骨髓间充质干细胞软骨向分化的方法在进行在体培养之前，需要大量的外源性生长因子和体外培养操作。本发明将传代培养至P3代的骨髓间充质干细胞与软骨细胞及细胞外基质大聚集体（细胞砖）混合，重悬于富血小板血浆，制备骨髓间充质干细胞-细胞砖-富血小板血浆细胞复合体，逐渐凝结时，将其注射于裸鼠背部皮下，经培养获得新生组织工程软骨。本发明在骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养方法的基础上，获得完全生物性的、可注射的组织工程软骨，能够稳定维持BMSCs软骨向分化，有效抑制体内肥大化，解决了背景技术中的不足。

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建组织工程软骨的方法，具体涉及一种通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法。

背景技术

如何构建可注射的、同时具有持续稳定性的软骨表型组织工程软骨，是临床软骨缺损修复所面临的一大挑战。骨髓间充质干细胞（BMSCs），具有软骨向分化潜能。当BMSCs与软骨细胞共培养时，会促进BMSCs的软骨向分化。目前促进BMSCs软骨向分化的方法在进行在体培养之前，需要大量的外源性生长因子和体外培养操作。但是如何抑制BMSCs在体内肥大化进而骨化的发生，维持持续稳定的软骨向分化仍然是临床应用上的瓶颈问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，获得完全生物性的、可注射的、能够稳定维持BMSCs软骨向分化的组织工程软骨。

本发明所采用的技术方案是：

通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：软骨细胞及细胞外基质大聚集体的制备：

（1）软骨细胞分离，成膜培养：

取1月龄新西兰白兔的入耳软骨，剪碎后用质量分数为0.2%的II型胶原酶溶液在37^○C温度下消化12小时，之后，取单细胞悬液于15ml 离心管内以1000rpm的转速离心5min；

弃去上清，PBS冲洗1次，以1000rpm转速离心5min，利用成膜诱导液重悬细胞，以6.5×10⁵个细胞/cm²的浓度种植于6孔板中培养，之后每3天换一次液，培养液即前述成膜诱导液；

（2）软骨细胞膜片细胞砖化处理：

10天后，软骨细胞成膜，将软骨细胞膜片刮下，浸入盛有质量分数为1.2%的褐藻酸钠溶液的培养皿中铺平，滴入102mM的氯化钙溶液直至褐藻酸钠溶液完全凝结为胶冻状复合体，厚度为3-5mm；

用多片刀先横后纵切割胶冻状复合体，并将其浸于藻酸盐溶解缓冲液中，释放获得细胞砖；PBS冲洗两次，备用；

步骤二：富血小板血浆提取：

取2月龄新西兰白兔耳缘静脉血，按总体积的10%加入质量分数为3.8%的柠檬酸钠溶液抗凝，采用两步离心法制备富血小板血浆；

步骤三：骨髓间充质干细胞-细胞砖-富血小板血浆细胞复合体制备与注射：

将传代培养至P3代的骨髓间充质干细胞和细胞砖重悬于500ul富血小板血浆中，其中，骨髓间充质干细胞数量为2.25×10⁷个，细胞砖中初始细胞数量为7.5×10⁶个；

混匀后加入溶有50ul凝血酶的氯化钙溶液中，氯化钙溶液质量体积分数为100mg/ml，得到细胞复合体；

将此细胞复合体转移至2ml注射器内， 1分钟后，细胞复合体逐渐凝结时，将其注射于裸鼠背部皮下，经过12周体内培养，获得新生组织工程软骨。

步骤一（1）中，成膜诱导液为高糖DMEM培养基，包含20%胎牛血清、272ug/ml谷氨酰胺、50ug/ml抗坏血酸、50ug/ml青霉素、30ug/ml链霉素，余量为水。

步骤一（2）中，藻酸盐溶解缓冲液包含55mM柠檬酸钠，0.15mM氯化钠，余量为水，pH6.8。

步骤一（2）中，多刀片的刀片间距离为1mm。

步骤二中，两步离心法制备富血小板血浆由以下步骤实现：

全血室温1800rpm转速离心8分钟后，分为上中下三层，上层为乏血小板血浆，中层为富血小板血浆，下层为红细胞；

转移上中两层血浆于另一新的离心管中3600rpm转速离心8分钟，弃去上层3/4的乏血小板血浆，余下部分用滴管将血小板反复吹打均匀，即为富血小板血浆，血小板终浓度为20.9±1.1×10⁸/ml，置于冰上保存备用。

本发明具有以下优点：

本发明在BMSCs与软骨细胞共培养方法的基础上，获得完全生物性的、可注射的组织工程软骨，大体形态良好，软骨表型稳定，能够稳定维持BMSCs软骨向分化，有效抑制体内肥大化，不需要在进行在体培养之前进行大量的外源性生长因子和体外培养操作，解决了背景技术中的不足。

附图说明

图1为本发明制备流程图。

图2为细胞转切割步骤图。

图3为切割厚度测量结果。

图4为B-CB-P复合体的细胞砖在PRP中的分布情况。

图5为B-CB-P、B-C-P、B-P三组样本大体形态观测结果。

图6为B-CB-P、B-C-P、B-P三组样本相关染色结果对比。

图7为肥大化特征基、成骨特异性基因、后期GAG和胶原定量实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，由以下步骤实现：

步骤一：软骨细胞及细胞外基质大聚集体（细胞砖）的制备：

（1）软骨细胞分离，成膜培养：

取1月龄新西兰白兔的入耳软骨，剪碎后用质量分数为0.2%的II型胶原酶(（Gibco，美国）溶液在37^○C温度下消化12小时，之后，取单细胞悬液于15ml 离心管内以1000rpm的转速离心5min；

弃去上清，PBS冲洗1次，以1000rpm转速离心5min，利用成膜诱导液重悬细胞，以6.5×10⁵个细胞/cm²的浓度种植于6孔板中培养，之后每3天换一次液，培养液即前述成膜诱导液；

（2）软骨细胞膜片细胞砖化处理：

10天后，软骨细胞成膜，将软骨细胞膜片刮下，浸入盛有质量分数为1.2%的褐藻酸钠溶液的培养皿中铺平，滴入102mM的氯化钙溶液直至褐藻酸钠溶液完全凝结为胶冻状复合体，厚度为3-5mm；

用多片刀先横后纵切割胶冻状复合体，并将其浸于藻酸盐溶解缓冲液中，释放获得细胞砖；PBS冲洗两次，备用。

步骤一（1）中，成膜诱导液为高糖DMEM培养基（Hyclone，美国），包含20%胎牛血清（Gibco，美国）、272ug/ml谷氨酰胺（Amresco，美国）、50ug/ml抗坏血酸（Amresco，美国）、50ug/ml青霉素（Amresco，美国）、30ug/ml链霉素（Amresco，美国），余量为水。

步骤一（2）中，藻酸盐溶解缓冲液包含55mM柠檬酸钠（Sigma，美国），0.15mM氯化钠（Sigma，美国），余量为水，pH6.8。

步骤一（2）中，多刀片指的是在一块基板上固定有多片平行刀片的结构，参见图2，刀片间距离为1mm。

步骤二：富血小板血浆（PRP）提取：

取2月龄新西兰白兔耳缘静脉血，按总体积的10%加入质量分数为3.8%的柠檬酸钠溶液抗凝，采用两步离心法制备富血小板血浆。

步骤二中，两步离心法制备富血小板血浆由以下步骤实现：

全血室温1800rpm转速离心8分钟后，分为上中下三层，上层为乏血小板血浆，中层为富血小板血浆，下层为红细胞；

转移上中两层血浆于另一新的离心管中3600rpm转速离心8分钟，弃去上层3/4的乏血小板血浆，余下部分用滴管将血小板反复吹打均匀，即为富血小板血浆，血小板终浓度为20.9±1.1×10⁸/ml，置于冰上保存备用。

步骤三：骨髓间充质干细胞-细胞砖-富血小板血浆（BMSCs-细胞砖-PRP）细胞复合体制备与注射：

将传代培养至P3代的骨髓间充质干细胞和细胞砖重悬于500ul富血小板血浆中，其中，骨髓间充质干细胞数量为2.25×10⁷个，细胞砖中初始细胞数量为7.5×10⁶个；

混匀后加入溶有50ul凝血酶的氯化钙溶液中，氯化钙溶液质量体积分数为100mg/ml，得到细胞复合体；

将此细胞复合体转移至2ml注射器内， 1分钟后，细胞复合体逐渐凝结时，将其注射于裸鼠背部皮下，经过12周体内培养，获得新生组织工程软骨。

诱导微环境对于BMSCs软骨向分化、抑制新生软骨细胞肥大化和骨化效果的鉴定：

8周在体培养后，样本取材。对实验组和对照组样本进行肉眼观察，体积、质量、厚度测量比较。然后将各组样本一分为二，一半进行组织学相应检测，另一半进行生物化学及分子生物学检测。

1.大体形态观测

B-CB-P和B-C-P组样本生成了白色、质韧有弹性的组织，B-C-P组样本比B-CB-P组样本略坚硬。B-P组则样本生成了粉红色，质地坚硬的组织。排水法测量各组样本体积发现（n =6，F = 572.6，p < 0. 0001），B-CB-P组样本体积（388.6±28.6ul）显著大于B-C-P（85.6±6.3ul，p < 0.01）组与B-P组（96.1±8.5ul， p < 0.01）。湿重的测量结果显示（n=6，F=516.9，p<0.0001）B-CB-P组样本湿重（356.9±10.2 mg）明显大于B-C-P（115.2±10.9 mg，p < 0.01）组与B-P组（49.1±4.7 mg，p < 0.01）。样本厚度（n =6, F = 228.3， p < 0. 0001）测量结果显示，B-CB-P组样本厚度（3.9±0.2mm）显著大于B-C-P（3.0± 0.1mm，p < 0.01）组与B-P组（2.0±0.2mm，p < 0.01）。以上结果显示，细胞砖与PRP共同构建额BMSCs诱导微环境在维持新生组织工程软骨大体形态稳定中发挥重要作用，而该方法构建的组织工程软骨有效的维持了大体形态的稳定（图2）。

2.体视显微镜观察细胞砖，扫描电镜观察B-CB-P复合体

利用体视显微镜测量细胞砖的大小为1016um×1032um，对细胞砖横断面切片测量其厚度为50-80um(图3的c1-c3)。扫描电镜（Jeol JSM6330F，日本）对冻干12消失并喷金处理的B-CB-P复合体观测结果发现细胞砖均匀分布于PRP中，PRP填补细胞砖之间的空隙，为BMSCs附着、生长、分化提供空间（图4的b）。

3. 组织学和免疫组织化学检测

通过对细胞砖-PRP支架HE染色及扫描电镜检测我们发现软骨细胞转均匀分布于PRP之中，形成良好的诱导微环境，而PRP充填在细胞砖形成的空隙之间，为BMSCs附着，生长，分化提供了空间，BRDU免疫荧光染色证明BMSCs为我们加入的，对于BMSCs区域的番红O及，II型胶原免疫组化染色证明其分化为新生软骨组织。我们通过BMSCs软骨向分化鉴的相关染色包括HE、番红O染色，II型胶原免疫组化染色，发现实验组（B-CB-P）组II型胶原及糖胺多糖（GAG）含量明显高于对照组（图2），后期GAG和胶原定量实验进一步证明了这一点（图5E，F）而肥大化骨化特异性染色结果（Von kossa、马松三色染色，I型、X型胶原免疫组化染色）则表明其抑制肥大化骨化的效果明显优于两对照组（图3）。实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real time-PCR）结果表明，成软骨基因（II型胶原， COL-II）实验组高于对照组，而肥大化特征基（X型胶原，COL-X）以及成骨特异性基因（I型胶原，COL-I）实验组明显低于对照组（图5A，B，C），这些都证明软骨细胞砖-PRP-BMSCs结构具有良好的成软骨特性同时具有良好的抑制异位成软骨过程中BMSCs肥大化骨化的作用。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。