一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用。本发明利用基因同源重组、基因插入失活的方法敲除产1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因，从而得到甲酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物甲酸合成大幅度降低，使得甲酸对细胞的毒害作用降低，1,3-丙二醇浓度、生产强度与底物转化率提高。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵32小时，甲酸合成量降低90％以上，1,3-丙二醇浓度可达72g/L以上。本发明将促进微生物发酵法生产1,3-丙二醇技术进步，具有应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用。

背景技术：

1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，有多种重要用途。它可用来合成杂环、药物 中间体、聚酯、润滑剂、染料、油墨、防冻剂等，其主要用途是合成聚酯-聚对苯二甲酸丙二 醇脂(PTT)。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二 醇酯(PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型 聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚 酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加 特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内应 力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循环利用性等。由于PTT的具有以上优 良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。

Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产PDO。 化学合成法生产PDO的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高压，设备 投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来PDO售价偏高。目前1,3-丙二醇的 生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有显著 的优点：1、利用成本较低的可再生资源(如甘油、玉米、淀粉)为原料；2、生产条件温和， 操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境污染 小。微生物发酵法是以生物技术为特征的“绿色工业”向传统石油化工提出的强有力的挑战， 具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。

微生物发酵法生产1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的1,3-丙二 醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter  freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有较高的1,3-丙二醇转化率和1,3-丙二醇生产强 度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。

目前被用来生产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌只能利用 甘油产生1,3-丙二醇。在发酵产生1,3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应。还原途径包括 两步反应：第一步，由依赖于辅酶B₁₂的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙醛；第二步， 由1,3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1,3-丙二醇，此过程消耗1摩尔还原力。 还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1,3-丙二醇。氧化途径中的产物与糖类发酵 产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在氧化产物形成的同时释放还原力NADH。氧 化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰CoA和甲酸， 甲酸容易分解为CO₂和H₂。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的ATP，而 在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为2,3-丁二醇,乳酸和琥 珀酸，生成乳酸的过程要消耗1摩尔还原力，而生成琥珀酸的过程要消耗2摩尔还原力。

克雷伯氏菌发酵甘油产生1,3-丙二醇，从代谢途径分析可知，甘油被转化为主产物1,3- 丙二醇的同时，产生多种副产物：甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、2,3-丁二醇和乙醇等。副产物 有机酸往往对发酵产生抑制作用。有文献报道甲酸、乙酸、乳酸等对微生物菌体生长及利用 底物存在抑制作用。甲酸抑制作用大于乙酸，1g/L甲酸即明显抑制底物利用及菌体生长，2g/L 乙酸开始对发酵产生较明显影响，而乳酸的抑制浓度较高。甲酸可能对克雷伯氏菌发酵甘油 产生1,3-丙二醇产生抑制作用。副产物有机酸的生成不但抑制细胞生长，还会造成底物甘油 的浪费。例如，乳酸的产生导致1,3-丙二醇产量降低。研究报道敲除乳酸代谢途径关键编码 基因乳酸脱氢酶基因，可以使乳酸合成大幅度减少，1,3-丙二醇生产能力得到增强。

发明内容：

本发明的目的是提供一种生产1,3-丙二醇的工程菌—敲除甲酸代谢途径基因的工程菌及 其构建方法和应用。

本发明的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌，是通过以下方法构建的，将产1，3-丙二醇的 野生型菌株的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后获得的工程菌。

所述的1,3-丙二醇的野生型菌株优选为克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌，进一步优选为肺 炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

所述的将克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除，优选通过以下方法敲除：

a、PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，将其与自杀载体相 连，然后再导入杂交供体菌株中；

b、将步骤a获得的携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列与自杀载体的供体菌 与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得丙酮酸 甲酸裂解酶flpB基因被失活的敲除乙酸代谢途径基因的克雷伯氏菌。

所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列是丙酮酸 甲酸裂解酶flpB基因的哪一部分序列并不重要，只要是该基因的部分同源序列即可。当所述 的产1,3-丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的 PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列优选为是以肺炎克雷伯氏菌的 基因组DNA为模板，以上游引物pflB-F：taggtacctgaaagacaaattcgcccag与下游引物pflB-R： gagagctccatgcgatccattacttcgt组成的引物进行PCR扩增后的序列。

所述的自杀载体可为自杀载体pGPCm，可从试剂公司购买。

所述的将携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因部分同源序列的自杀载体导入杂交供体菌株 中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。

所述的杂交供体菌可以为大肠杆菌SM10(λpir)。通过双亲本杂交，使丙酮酸甲酸裂解酶 flpB基因的部分序列与产l,3-丙二醇的目的菌株发生同源重组，从而使产1,3-丙二醇的野生型 菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因插入失活，从而获得敲除甲酸代谢途径基因的工程菌。

本发明还提供了敲除甲酸代谢途径基因的工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用。

本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲 酸裂解酶flpB基因沉默，从而得到甲酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进 行1,3-丙二醇的发酵生产，甲酸生产大幅度降低，使得副产物甲酸对细胞的毒害作用大大减 少，1,3-丙二醇生产浓度、速率提高，另外，由于减少甲酸的代谢分流作用，提高了底物转化 率。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵32小时，1,3-丙二醇浓度可达72g/L以上， 甲酸合成减少90％以上。本发明在微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有实用价值，可促进微生 物发酵生产1,3-丙二醇水平提高。

附图说明：

图l是回收并纯化PCR扩增的pflB基因目的片段图

图2是载体pGPCm的物理图谱

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：甲酸代谢途径关键基因—丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克雷伯氏 菌突变株的构建。

(l)、克隆丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB部分序列

设计PCR扩增部分丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因序列的引物，引物序列如下：上游引物 pflB-F：taggtacctgaaagacaaattcgcccag与下游引物pflB-R：gagagctccatgcgatccattacttcgt。以野生 型肺炎克雷伯氏菌(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2011075)基 因组DNA为模板，在引物pflB-F和pflB-R的引导下，PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶pflB的部 分序列，PCR扩增条件为：先95℃3min；然后94℃1min，50℃1min，72℃1min，共32 个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收 并纯化约850bp的目的基因片段(图1)，将其克隆入载体pMD18-T(TaKaRa公司)中，将 重组质粒转化大肠杆菌Dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，测序验证，用限制性 内切酶kpnI和sacI进行酶切鉴定，获得插入序列正确的重组质粒，命名为pT-pflB质粒。

(2)、构建丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB自杀载体pGP-pflB

用限制性内切酶kpnI和sacI酶切pT-pflB质粒，回收并纯化长度约为850bp的pflB基因 DNA片段，再将其与经kpnI和sacI酶切的载体pGPCm(其物理图谱如图2所示)用DNA 连接酶进行连接，将连接产物转入大肠杆菌SM10(λpir)感受态细胞，筛选阳性转化子，培养， 提取质粒，kpnI和sacI酶切验证，得到含有丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的部分序列的重组自 杀载体pGP-pflB，即将丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的部分同源序列与自杀载体pGPCm相连。

(3)、构建丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被敲除的肺炎克雷伯氏菌突变株

将步骤(2)的携带有载体pGP-pflB的大肠杆菌SM10(λpir)(供体菌)和野生型肺炎克 雷伯氏菌(CCTCC M 2011075)(受体菌)进行双亲本杂交，具体方法为：在含有氯霉素的 LB液体培养基中过夜培养混合后的供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按数量比3:1比例混合 后，涂布于氯霉素抗性LB平板上，37℃培养12小时；用挑选培养基上的氯霉素抗性菌落克 隆，梯度稀释后再次涂布于氯霉素抗性平板上，37℃培养进行筛选，得到具有氯霉素(Cm)抗 性的重组菌株，即为甲酸代谢途径关键基因—丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎 克雷伯氏菌突变株(敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株)。

实施例2：丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的活性检测。

对实施例1的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株进行丙酮 酸甲酸裂解酶的活性检测，以野生型肺炎克雷伯氏菌为对照，具体方法包括以下步骤：

(l)将丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株接种于100mL培养基 (每升水中含有甘油20g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH 7.0，120℃灭菌20min) 中，在37℃下振荡培养6-12小时，每2小时取样离心收集菌体；

(2)用100mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮洗涤菌体2次；

(3)用2.5mL磷酸缓冲液(0.1M，pH7.5)悬浮菌体；

(4)超声波低温4℃破碎菌体；

(5)3000g低温离心30min，取上清测定酶活，测定方法为用紫外分光光度计测定反应体系 在OD_340nm处1min内的变化值，即△A_340nm/min。反应体系为：含20mM的丙酮酸钠，0.08mM CoA，l mM NAD，2mM DTT，6mM DL苹果酸钠，1.4U/mL柠檬酸合成酶，13.8u/mL苹 果酸脱氢酶，在pH为7.5，终浓度为0.03M磷酸钾缓冲溶液中进行反应。加入10uL粗酶液 激活酶促反应。测定10min内NADH在340nm处吸光度的变化。酶活力单位定义为：在温度 为30℃，pH为7.5条件下，每分钟内转化1u mol丙酮酸所需的酶量定义为1个酶活单位。

结果显示，实施例l构建的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株的 丙酮酸甲酸裂解酶活性为野生型菌株的1.5％-3.6％，表明实施例l构建的敲除丙酮酸甲酸裂 解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株的丙酮酸甲酸裂解酶失活。

实施例3：利用敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株发酵生产1,3- 丙二醇

(1)培养基

LB培养基(g·L^-1)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂10，调节至pH 7.0，用于克雷伯 氏菌菌种的短期保藏及活化。种子及发酵培养基组成见表1：

表1：培养基组成

(2)培养方式

(i)种子活化：从甘油管保藏的实施例1中的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯 氏菌突变株及野生菌分别接种至LB培养基斜面活化，温度37℃下培养12小时活化种子。

(ii)种子培养：250mL三角瓶9层纱布封口，装液量100mL种子培养基，接入斜面菌苔(步 骤i的活化种子)一环，摇床中进行好氧种子培养，温度30℃，转速150r·min^-1。

(iii)发酵培养：为了考察敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB对肺炎克雷伯氏菌发酵甘油生产 1,3-丙二醇的影响，以实施例1中的敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB的肺炎克雷伯氏菌突变株 为实验组，以出发野生菌肺炎克雷伯氏菌为对照组，进行补料批式发酵，采用岛津LC-20A HPLC分析发酵液中物质组成。

在5L搅拌发酵罐中进行时，装液量4L，接种量1％，通入0.5vvm空气进行微氧发酵培养， 搅拌转速为250rpm，发酵温度恒定在37℃；NaOH调节pH至6.8，发酵过程中体系pH通过流 加40％的NaOH溶液调控。待菌株进入对数生长期后进行甘油补料，甘油浓度控制在1-50g/L。

(iv)发酵结果

发酵进行32小时，1,3-丙二醇及副产物生产情况结果见表2。

表2：失活丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因对肺炎克雷伯氏菌发酵甘油产1,3-丙二醇的影响

简写：CDW，生物量(细胞干重)；GLY，甘油；FOR，甲酸；SUC，丁二酸；LAC，乳酸；AC，乙酸；PDO，1,3- 丙二醇；BDO，2,3-丁二醇；ETH，乙醇

从发酵结果可以得知，敲除丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因使甲酸合成代谢途径被切断，甲 酸合成量大幅度降低90.2％，合成1,3-丙二醇浓度增加6.0％，1,3-丙二醇的生产强度增加6.1％， 发酵生产1,3-丙二醇得率也增加5.6％。