一种提高植物抗病毒病能力的复配制剂及其应用

摘要

本发明公来了一种提高植物抗病毒病能力的复配制剂及其应用，其特点是由β-氨基丁酸与宁南霉素或氨基寡糖素复配获得；应用时以复配制剂浸泡种子6h，和/或以复配制剂对5-6叶期的植株进行叶面喷施。本发明的复配制剂极大程度的发挥了各原料各自的药效，使药剂的活性显著提高，通过本发明的复配制剂，可以显著提高大田中植株抵御病毒病的能力，提高植株的产值与品质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高植物抗病毒病能力的复配制剂，属于生物工程技术领域。

背景技术

植物病毒浸染宿主后，由于病毒的严格寄生性和植物缺乏完善的免疫系统，使得病毒病 的防治十分困难。因此，植物病毒病又称为“植物癌症”。据统计，每年植物病毒病对植物造 成的经济损失就达5.5亿多美元。病毒在侵染寄主后，不仅与寄主争夺生长所必需的营养成 分，而且破坏植物的养分输导，改变寄主植物的某些代谢平衡，使植物的光合作用受到抑制， 致使植物生长困难，产生畸形、黄化等症状，严重的造成寄主植物死亡。为了有效地控制植 物病毒病，人们采用了各种措施，包括轮作、种子脱毒、病毒间的弱毒株系交叉保护、抗病 品种的选用、传毒介体的控制及化学农药的使用等，近年来转基因植物抗病研究也有了新的 进展。但这些措施还不能有效克服病毒的危害，且化学农药的使用对环境造成了很大危害， 在当前大力提倡绿色食品和环境保护的前提下，加强植物病害的综合防治和减少化学农药的 使用已成为植保工作者工作的重点内容之一。防治植物病毒病主要是生物防治和化学防治。 由于化学防治操作简单、见效迅速和经济适用，化学防治在病毒病的防治中具有重要地位。 苯并噻唑及其衍生物是一类具有广泛生物活性的物质。在农用方面，具有抗真菌、杀虫、杀 螨、杀线虫、抗植物病毒、除草、植物生长调节等活性。近几十年来，人们对氨基磷酸衍生 物的合成方法和生物活性进行了广泛研究，发现此类化合物具有广泛的生物活性，如氨基膦 酸酯具有抗肿瘤、植物生长调节、除草、杀菌、抑制酶、抗氧化及破坏生物细胞膜等多种生 物活性，尤其是近几年抗植物病毒的活性的多次报道。为了能开发出有效控制病毒且不会造 成环境污染的抗病毒药剂，研究人员不断寻找和筛选天然的生物源抗病毒物质。但是，目前 仍未寻找出一种合适有效的天然的生物源抗病毒物质。

β-氨基丁酸(DL-3-氨基丁酸，β-Amino-butyric acid，BABA)是一种结构简单的非蛋白质氨 基酸，在自然状态下很少存在。BABA是从经曝晒的番茄根系中分离得到的一种次生代谢非 蛋白质氨基酸，Oort等在1960年最早发现BABA能诱导番茄产生对晚疫病抗性，随着对BABA 研究的逐渐增多，发现了BABA具有广谱的诱抗活性，BABA不仅能诱导多种作物对多种病 害的抗性，还能诱导作物对逆境的抗性，因此，是一种极具潜力和研究价值的植物诱抗剂。 BABA能诱导植物抗病,但其自身对病原菌并不具有直接毒性，许多植物病原体的体外反复 测试表明，BABA不具有毒性反应。

近年来，国内外许多学者对BABA的研究多集中在BABA的诱导抗病性方面，取得了一定 的成果。研究表明，BABA诱导植物抗病不是因为其本身对病原物具有毒性，而是诱导植物 产生多种生理、生化防卫反应。BABA诱导植物抗病机制涉及植物多方面生理生化反应，由 多个功能不同基因共同参与控制。

宁南霉素(ningnanmycin)是中国科学院成都生物研究所制的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，是 一种高效、低毒、无“三致”和无蓄积的广谱杀菌剂，其生产菌经鉴定为诺尔斯链霉菌的一 个新变种，定名为诺尔斯链霉菌西昌变种。多年研究表明，宁南霉素不仅对水稻白叶枯病、 小麦、蔬菜等白粉病，而且对烟草花叶病、辣椒病毒病等多种病毒病都具有明显的防病和增 产、增值效果，已在生产应用中产生了极大的经济效益。

氨基寡糖是从海洋生物外壳提取而来的安全、无毒、无残留的多糖类天然产物，经酶解 产生聚合度为2～15的寡聚糖，是一种新型的生物农药，对真菌和细菌病害的防治也有一定的 作用，并对病原菌的生长有一定的抑制作用。该药为寡糖类诱导剂，是无毒生物农药，对于 经济作物的无公害生产有积极的作用。

发明内容

本发明旨在提供一种简便有效且适于大面积推广应用的提高植物抗病毒病能力的新方 法。

本发明采取以下技术方案：

本发明提高植物抗病毒病能力的复配制剂，其特点在于：所述复配制剂由浓度为5mmol/L β-氨基丁酸与宁南霉素复配获得，所述宁南霉素在所述复配制剂中的质量分数为8％。

或所述复配制剂由浓度为5mmol/Lβ-氨基丁酸与氨基寡糖素复配获得，所述氨基寡糖素 在所述复配制剂中的质量分数为2％。

其中5mmol/Lβ-氨基丁酸是由β-氨基丁酸粉末和蒸馏水配制获得。

本发明上述复配制剂可用于提高植物抗病毒病能力，方法是：以复配制剂浸泡种子6h， 和/或以复配制剂对5-6叶期的植株进行叶面喷施，喷施至使叶面湿润。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明的复配制剂极大程度的发挥了各原料各自的药效，使药剂的活性显著提高，通 过本发明的复配制剂，可以显著提高大田中植株抵御病毒病的能力，提高植株的产值与品质；

2、本发明通过复配制剂喷施叶面或浸泡种子以提高植物抗病毒病能力的方法操作简便， 易于大面积推广；

3、本发明复配制剂所用原料BABA是一种存在于自然界的非蛋白氨基酸，绿色环保型 物质，对人畜无害；宁南霉素是一种高效、低毒、无“三致”和无蓄积的广谱杀菌剂；氨基 寡糖素是一种无毒生物农药，有别于传统农药。

4、本发明的方法在提高植物抵御植物病毒病的同时，也提高了植物各种生理生化指标和 抗胁迫能力，本发明对于提高植物抵御病毒病能力有重要的意义，将对我国农业生产带来巨 大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为实施例1的测试1中经不同处理的5个烟草样品的叶片表型照片，其中上方为单 个叶片的放大照片，下方为整棵烟草的照片；

图2为实施例1的测试2中经不同处理的4个实验田在不同阶段的植株发病率的统计图；

图3为实施例1的测试2中经不同处理的4个实验田在不同阶段的植株病情指数的统计 图；

图4为实施例1的测试2中经不同处理的4个实验田在不同阶段的植株防治效果的统计 图；

图5为实施例1的测试3中经不同处理的各样品经二氨基联苯胺(DAB)染色原位检测 H₂O₂的结果图；

图6为实施例1的测试3中经不同处理的各样品的CAT活性的对比图；

图7为实施例1的测试3中经不同处理的各样品的PAL活性的对比图；

图8为实施例1的测试3中经不同处理的各样品的SA含量的对比图；

图9为实施例2的测试1中经不同处理的5个烟草样品的叶片表型照片，其中上方为单 个叶片的放大照片，下方为整棵烟草的照片；

图10为实施例2的测试2中经不同处理的4个实验田在不同阶段的植株发病率的统计图；

图11为实施例2的测试2中经不同处理的4个实验田在不同阶段的植株病情指数的统计 图；

图12为实施例2的测试2中经不同处理的4个实验田在不同阶段的植株防治效果的统计 图；

图13为实施例2的测试3中经不同处理的各样品经二氨基联苯胺(DAB)染色原位检测 H₂O₂的结果图；

图14为实施例2的测试3中经不同处理的各样品的CAT活性的对比图；

图15为实施例2的测试3中经不同处理的各样品的PAL活性的对比图；

图16为实施例2的测试3中经不同处理的各样品的SA含量的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不应理解为是对本发明的限制，凡是基于 本发明的技术基本思想所做的其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术方案均属于本 发明的范围。

实施例1

本实施例的复配制剂A由浓度为5mmol/Lβ-氨基丁酸与宁南霉素复配获得，宁南霉素在 复配制剂中的质量分数为8％；β-氨基丁酸来自于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，宁 南霉素来自于德强生物股份有限公司。

以烟草普通栽培种云烟97为实验材料，按下列方式测试复配制剂A对植物抗病毒病的 作用：

测试1、以复配制剂A处理烟草后检测其发病情况：

设置一组对比实验，进行5种不同处理，具体如下：

取5-6叶期的烟草作为5个样品，对每一个样品分别进行如下处理：

样品1：喷施清水；

样品2：喷施清水，2天后接种TMV(烟草花叶病毒来源于安徽农业大学)；

样品3：喷施浓度为5mmol/L的BABA，2天后接种TMV；

样品4：喷施质量份数为8％的宁南霉素水液，2天后接种TMV；

样品5：喷施复配制剂A，2天后接种TMV。

1.1经不同方式处理后，烟草材料叶片的表型

如图1所示，在接种TMV后15-20d，随着心叶的长大，与样品1相比，接种TMV植株 心叶上开始出现黄绿相间的病斑，样品4和样品3的病斑少于样品2的病斑，且样品5的病 斑少于样品2、样品3及样品4。这一结果表面由宁南霉素与BABA混合形成的复配制剂A 的效果好于单独使用两者，复配制剂A提高了烟草抗TMV浸染的能力。

1.2经不同方式处理烟草材料后，Elisa检测其发病情况

准确称取0.1g各个样品的叶片加入50mL的PBS缓冲液研磨，然后以5000rpm离心5 分钟后，取上清液进行Elisa检测，评判标准如下：

OD样本/OD阴性平均值<2.1为阴性－；

7.1>OD样本/OD阴性平均值≥6.1为阳性+；

8.1>OD样本/OD阴性平均值≥7.1为阳性++；

9.1>OD样本/OD阴性平均值≥8.1为阳性+++；

10.1>OD样本/OD阴性平均值≥9.1为++++；

OD样本/OD阴性平均值≥10.1为out；

为提高检测结果的准确度，每个样品进行两次实验，分别为平行1和平行2，Elisa检测 的结果如表1所示，从表中可以看出喷施复配制剂A的样品5与单独喷施BABA的样品3及 单独喷施宁南霉素的样品4相比，病毒检出相对较低，证明复配制剂效果优于两者单独使用， 这与叶片的表型的测试结果一致。

表1

  样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 阴性对照 阳性对照 平行1 - ++++ +++ ++ + - out 平行2 - ++++ +++ ++ + - out

测试2、经不同方式处理后，烟草植株在各阶段的发病率、病情指数及防治效果

在大田内进行烟草植株发病率的测试，将大田分为4个实验田，在实验田内烟草长至5～6 叶时，分别喷施清水、浓度为5mmol/L的BABA、质量份数为8％的宁南霉素水液及复配制 剂A，喷施日期为3月23日，观察并计算在喷施后不同阶段植株的发病率(发病率＝发病植 株数量/植株总数量)，统计结果如图2所示，从图中可以看出，在喷施第10天时(即4月3 日)，喷施复配制剂A的试验田的发病率为0，且随着时间的推进，复配制剂组植株发病率最 低，且比清水对照组平均降低75％，比单独施用BABA组平均降低61％，比单独施用宁南霉 素组平均降低22％。

观察并按式(1)计算在喷施后植株的病情指数，统计结果如图3所示，从图中可以看出 随着时间的变化，复配制剂组植株病情指数最低，且比清水对照组平均降低70％，比单独施 用BABA组平均降低47％，比单独施用宁南霉素组平均降低36％。

观察并按式(2)计算在喷施后植株的防治效果，统计结果如图4所示，从图中可以看出 随着时间的变化，复配制剂组植株防治效果最好，且比清水对照组平均提高62％，比单独施 用BABA组平均提高41％，比单独施用宁南霉素组平均提高24％。

测试3、以复配制剂A处理后烟草叶片生理生化指标的变化

3.1二氨基联苯胺(DAB)染色原位检测H₂O₂

取测试1的五个样品的完整叶片，在1mg/mL、pH＝3.8的DAB溶液中浸泡8h，有H₂O₂的部位将会形成棕红色斑点，煮沸10min初步脱去叶绿素。然后放在95％乙醇中于沸水浴中 脱色数分钟，至完全脱去叶绿素为止。

测定结果如图5所示，从图中可以看出样品2的红褐色斑点比样品1多，说明接毒能诱 导过氧化氢的产生，激活烟草自身的防御体系。样品3和样品4的红褐色斑点比样品2的少， 说明5mmol/LBABA或宁南霉素处理后抑制了H₂O₂的过多积累，减少了H₂O₂对烟草的毒害 作用，提高了烟草对TMV的抗性。样品5的红褐色斑点比样品3和样品4少，说明以复配 制剂A处理大大提高了烟草对TMV的抗性。

3.2对过氧化氢酶(CAT)活性的影响

分别称取测试1的五个样品的叶片各0.5g，置于研钵中，加入2～3mL 4℃下预冷的pH7.0 磷酸缓冲液(含1％聚乙烯吡咯烷酮)和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25mL容量瓶中，并 用磷酸缓冲液(含1％聚乙烯吡咯烷酮)冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容至刻度，混合均 匀，将容量瓶置于5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r/min下离心15min，上部澄 清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃保存备用。

取10mL试管，加入反应体系：1mL蒸馏水、1.5mL pH7.8磷酸缓冲液和0.2mL过氧化 氢酶粗提液。以蒸馏水为参照，25℃预热后，加入0.3mL 0.1mol/L H₂O₂，立即计时，迅速倒 入石英比色皿中，240nm下测吸光度。每隔1min读一次，共测4次，按式(3)计算获得其 过氧化氢酶活性(CAT activity)，结果如图6所示，从图中可以看出样品5的CAT活性比样品 2提高了850％，比样品3提高了280％，比样品4的提高了90％。

CAT activity＝ΔA₂₄₀×V_T/(0.1×V×t×FW)    (3)；

3.3对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

分别称取测试1的五个样品的叶片各0.5g，慢慢加入预冷的10mL提取缓冲液即0.2mol/L (硼酸根)硼砂－硼酸缓冲液，加入石英砂，冰浴研磨，至匀浆，在12000r/min、4℃下离心 20min，上清液即为酶粗液，4℃下保存备用。

由1mL酶粗液+9mL提取缓冲液+1mL 0.1mol/L苯丙氨酸标准液构成混合体系。将混合 体系放在40℃水浴锅中保温1h，取出后用6mol/L的盐酸2滴终止反应，测定在紫外分光光 度计下290nm处光吸收值变化。由光吸收值按照式(4)计算获得苯丙氨酸解氨酶活性(PAL activity)，统计结果如图7所示，从图中可以看出样品5的PAL活性比样品2提高了52.9％， 比样品3提高了95％，比样品4提高了23.8％。

PAL活性＝ΔA₂₉₀×V/(a×0.01×W×t)    (4)；

3.4对水杨酸(SA)含量的影响

在测试1接种TMV 2天后，称取5个样品的叶片各0.5g置于研钵中，分两次加入3mL 80％ 甲醇，分次匀浆，5000r.min^-1离心匀浆10min，取上清液并去除亲脂色素，用C18-柱去除亲 脂色素获得纯化液，取纯化液200μL，在水浴锅中35-45℃吹干，密封保存(<0℃)，用ELISA 试剂盒和酶标仪测定样品中SA的含量。测定结果如图8所示，从图中可以看出样品5的SA 含量比样品2提高了14.1％，比样品3提高了1.8％，比样品4提高了5.8％。

综上，可以看出经复配制剂A处理后的植株在表型、发病情况、发病率、病情指数、防 治效果和各生理生化指标上都高于其他实验组，说明复配制剂A提高了植物抗病毒病的能力。 实施例2

本实施例的复配制剂B由浓度为5mmol/Lβ-氨基丁酸与氨基寡糖素复配获得，氨基寡糖 素在复配制剂中的质量分数为2％；氨基寡糖素来自于北京三浦百草绿色植物制剂有限公司。

下面以烟草普通栽培种云烟97为实验材料，研究复配制剂B对植物抗病毒病的作用：

测试1、以复配制剂B处理烟草后检测其发病情况：

设置一组对比实验，进行5种不同处理，具体如下：

取5-6叶期的烟草作为5个样品，对每一个样品分别进行如下处理：

样品1：喷施清水；

样品2：喷施清水，2天后接种TMV(烟草花叶病毒来源于安徽农业大学)；

样品3：喷施浓度为5mmol/L的BABA，2天后接种TMV；

样品4：喷施质量份数为2％的氨基寡糖素水液，2天后接种TMV；

样品5：喷施复配制剂B，2天后接种TMV。

1.1经不同方式处理后，烟草材料叶片的表型

如图9所示，在接种TMV后15-20d，随着心叶的长大，与样品1相比，接种TMV植株 心叶上开始出现黄绿相间的病斑，样品3病斑少于样品2接种TMV的，样品4的病斑略多 于样品3，样品5的病斑明显少于样品3。这一结果表面由氨基寡糖素与BABA混合形成的 复配制剂B的效果好于单独使用两者，复配制剂B提高了烟草抗TMV浸染的能力。

1.2经不同方式处理烟草材料后，Elisa检测其发病情况

准确称取0.1g各个样品的叶片加50mL的PBS缓冲液研磨，然后以5000rpm离心5分钟 后，取上清液进行Elisa检测，评判标准如下：

OD样本/OD阴性平均值<2.1为阴性－；

7.1>OD样本/OD阴性平均值≥6.1为阳性+；

8.1>OD样本/OD阴性平均值≥7.1为阳性++；

9.1>OD样本/OD阴性平均值≥8.1为阳性+++；

10.1>OD样本/OD阴性平均值≥9.1为++++；

OD样本/OD阴性平均值≥10.1为out；

为提高检测结果的准确度，每个样品进行两次实验，分别为平行1和平行2，Elisa检测 的结果如表2所示，从表中可以看出喷施复配制剂B的样品5与单独喷施BABA的样品3及 单独喷施宁南霉素的样品4相比，病毒检出相对较低，证明复配制剂效果优于两者单独使用， 这与叶片的表型的测试结果一致。

表2

  样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 阴性对照 阳性对照 平行1 - ++++ +++ ++ ++ - out 平行2 - ++++ ++ +++ + - out

测试2、经不同方式处理后，烟草植株在各阶段的发病率、病情指数及防治效果

在大田内进行烟草植株发病率的测试，将大田分为4个实验田，在实验田内烟草长至5～6 叶时，分别喷施清水、浓度为5mmol/L的BABA、质量份数为2％的氨基寡糖素水液及复配 制剂B，喷施日期为3月23日，观察并计算在喷施后不同阶段植株的发病率(发病率＝发病 植株数量/植株总数量)，统计结果如图10所示，从图中可以看出，在喷施第10天时(即4 月3日)，喷施复配制剂B的试验田的发病率为0，且随着时间的推进，复配制剂组植株发病 率最低，且比清水对照组平均降低68％，比单独施用BABA组平均降低50％，比单独施用氨 基寡糖素组平均降低18％。

观察并按式(1)计算在喷施后植株的病情指数，统计结果如图11所示，从图中可以看 出随着时间的变化，复配制剂组植株病情指数最低，且比清水对照组平均降低75％，比单独 施用BABA组平均降低55％，比单独施用氨基寡糖素组平均降低25％。

观察并按式(2)计算在喷施后植株的防治效果，统计结果如图12所示，从图中可以看 出随着时间的变化，复配制剂组植株防治效果最好，且比清水对照组平均提高82％，比单独 施用BABA组平均提高86％，比单独施用氨基寡糖素组平均提高14％。

测试3、以复配制剂B处理后烟草叶片生理生化指标的变化

3.1二氨基联苯胺(DAB)染色原位检测H₂O₂

取测试1中的五个样品的完整叶片，在1mg/mL pH＝3.8的DAB溶液中浸泡8h，有H₂O₂的部位将会形成棕红色斑点，煮沸10min初步脱去叶绿素。然后放在95％乙醇中于沸水浴中 脱色数分钟，至完全脱去叶绿素为止。

测定结果如图13所示，从图中可以看出样品2红褐色斑点比样品1多，说明接毒能诱导 过氧化氢的产生，激活烟草自身的防御体系。样品3的红褐色斑点比样品2的少，说明 5mmol/LBABA处理后抑制了H₂O₂的过多积累，减少了H₂O₂对烟草的毒害作用，提高了烟 草对TMV的抗性。样品5的红褐色斑点比样品3和样品4相对较少，说明以复配制剂B处 理提高了烟草对TMV的抗性。

3.2对过氧化氢酶(CAT)活性的影响

分别称取测试1的五个样品的叶片各0.5g，置于研钵中，加入2～3mL 4℃下预冷的pH7.0 磷酸缓冲液(含1％聚乙烯吡咯烷酮)和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25mL容量瓶中，并 用磷酸缓冲液(含1％聚乙烯吡咯烷酮)冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容至刻度，混合均 匀，将容量瓶置于5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r/min下离心15min，上部澄 清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃保存备用。

取10mL试管，加入反应体系：1mL蒸馏水、1.5mL pH7.8磷酸缓冲液和0.2mL过氧化 氢酶粗提液。以蒸馏水为参照，25℃预热后，加入0.3mL 0.1mol/L H₂O₂，立即计时，迅速倒 入石英比色皿中，240nm下测吸光度。每隔1min读一次，共测4次，按式(3)计算获得其 过氧化氢酶活性(CAT activity)，结果如图14所示，从图中可以看出样品5的CAT活性比样 品2提高了600％，比样品3提高了180％，比样品4的提高了180％。

3.3对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响

分别称取测试1的五组样品的叶片各0.5g，慢慢加入预冷的10mL提取缓冲液即0.2mol/L (硼酸根)硼砂－硼酸缓冲液，加入石英砂，冰浴研磨，至匀浆，在12000r/min、4℃下离心 20min，上清液即为酶粗液，4℃下保存备用。

由1mL酶粗液+9mL提取缓冲液+1mL 0.1mol/L苯丙氨酸标准液构成混合体系。将混合 体系放在40℃水浴锅中保温1h，取出后用6mol/L的盐酸2滴终止反应，测定在紫外分光光 度计下290nm处光吸收值变化。由光吸收值按照式(4)计算获得苯丙氨酸解氨酶(PAL)活 性，统计结果如图15所示，从图中可以看出样品5的PAL活性比样品2提高了31.4％，比样 品3提高了67.5％，比样品4提高了45.9％。

3.4对水杨酸(SA)含量的影响

在测试1接种TMV2天后，称取5个样品的叶片各0.5g置于研钵中，分两次加入3mL 80％ 甲醇，分次匀浆，5000r.min^-1离心匀浆10min，取上清液并去除亲脂色素，用C18-柱去除亲 脂色素获得纯化液，取纯化液200μL，在水浴锅中35-45℃吹干，密封保存(<0℃)，用ELISA 试剂盒和酶标仪测定样品中SA的含量。测定结果如图16所示，从图中可以看出样品5的SA 含量比样品2提高了0.64％，比样品3降低了10.2％，比样品4提高了2.4％。

综上，可以看出经复配制剂B处理后的样品5在表型、发病情况、发病率、病情指数、防 治效果和各生理生化指标上都高于其他实验组，说明复配制剂B提高了植物抗病毒病的能力。