一种银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器的制备及应用

摘要

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，其公开了一种银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器的制备及应用，用于快速检测前列腺特异性抗原PSA。其制作方案是：以丝网印刷电极为工作电极，将金纳米溶胶对其进行修饰，然后依次加入PSA抗体、牛血清白蛋白、PSA以及银离子取代羟基磷灰石标记的抗体溶液。金纳米溶胶有利于抗体的固定和火星保持，银离子取代羟基磷灰石具有羟基磷灰石的生物相容性，可以吸附抗体等蛋白质，同时其内部的银离子可在酸性条件下释放出来，使PSA的检测转化为银离子的检测，实现了较高的灵敏度，检测限可低至0.01pg/mL。

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析与生物传感技术领域，具体涉及一种银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器的制备及应用，研制一种快速检测前列腺肿瘤标志物的丝网印刷电极免疫传感器。

背景技术

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌（腺泡腺癌）、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中前列腺腺癌占95%以上，因此，通常我们所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。根据世界卫生组织国际癌症研究机构最新统计，2012年新诊断的前列腺癌患者为110万，约占新增癌症病例总数的15%，是全球范围内男性第二位最常见的癌症。

临床诊断前列腺癌主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查，CT对诊断早期前列腺癌的敏感性低于MRI。因前列腺癌骨转移率较高，在决定治疗方案前通常还要进行核素骨扫描检查。确诊前列腺癌需要通过前列腺穿刺活检进行病理检查。尽管有一些不可逆的因素，但前列腺癌只要能早期发现、早期诊断，治愈率相当高。因此，前列腺癌的早期发现具有重要意义和科学价值。

PSA是前列腺特异抗原，作为前列腺癌的特异性标志物，PSA对前腺癌的诊断特异性达90％?97％，被认为是最有价值的前列癌的肿瘤标志物，被广泛应用于前列腺癌的筛选、诊断及治疗后的监测。 PSA是代表前列腺特异性抗原小于4 ng/mL正常，大于4ng/mL要考虑到前列腺是否有问题。它具有组织特异性，但不是肿瘤所特异的。

目前国内绝大多数检测机构都在使用酶联免疫法进行PSA的检测。由于其检测周期长，程序复杂所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学生物化学，分子生物学的不断发展，电化学免疫传感器已经引起广泛的研究兴趣。

本发明采用丝网印刷电极，价格低廉，结合电化学技术和免疫技术，提高了传感器的选择性和灵敏度，不需要对样品进行预处理，节省了检测时间，降低了检测成本，因此是一种快速、廉价且灵敏度高的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本高等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便且价廉易得的检测PSA的丝网印刷电极免疫传感器的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 一种银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器的制备方法

（1）银离子取代的羟基磷灰石标记抗体的制备

将粒径20~60nm的纳米羟基磷灰石和硝酸银以质量比为1 : 1 ~ 3的比例混合，溶于5~10mL水中，震荡10~24小时，离心分离；

取1~2mg获得的银离子取代的纳米羟基磷灰石，溶于5mL磷酸盐缓冲溶液，加入0.05~0.1ml浓度为10 μg/mL 的PSA抗体溶液，孵化震荡5~12小时，离心分离；

将获得的银离子取代的羟基磷灰石标记抗体重新加入5mL磷酸盐缓冲溶液，并加入1mg的牛血清白蛋白，孵化震荡5~12小时，离心分离；

将沉淀重新分散到2~4mL磷酸盐缓冲溶液中，即获得银离子取代的羟基磷灰石标记抗体的储备液；

（2）银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器制备

取5~20μL金纳米溶胶滴加到丝网印刷电极上，晾干；

依次在丝网印刷电极上滴加5~10μL的PSA抗体、牛血清白蛋白、PSA、银离子取代的羟基磷灰石标记抗体溶液，孵化1~4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得一种银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器；

上述抗体浓度为10μg/mL，牛血清白蛋白浓度为1%。

2.  PSA的检测步骤

（1）工作曲线的绘制

采用不同浓度的PSA按照权利要求1中所述的方法制备一系列银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器；

将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入50μL的磷酸盐缓冲溶液溶液，再加入5~10μL的10%的盐酸溶液，将银离子取代的羟基磷灰石溶解，释放出银离子；

设定电位范围为-0.2~0.4V，沉积电位为-0.2V，沉积时间为30~300s，通过阳极溶出伏安法检测修饰好的工作电极的电流响应；

根据所得电流响应与PSA浓度的关系，绘制工作曲线；

（2）PSA的检测

采用5~10μL待测血清样品取代步骤（1）中的PSA，其它与步骤（1）相同；

根据所测得的数值，对照PSA的工作曲线，计算出样品中PSA的含量。

本发明具备以下优势：

（1）本发明快速、准确，不需前处理，可用于复杂的血清样品中的PSA的检测。

（2）本发明采用的银离子取代羟基磷灰石中的钙离子，使银离子负载于羟基磷灰石的纳米结构中，具有良好的生物相容性，利于抗体等蛋白质分子的固定。

（3）羟基磷灰石可溶于酸性溶液，易于将携带的银离子释放出来，实现了由测定PSA到测定银离子的转化，从而提高了本发明传感器的灵敏度，使PSA的检测限可低至0.01pg/mL。

（4）本发明印刷电极制备简单、成本低、便于携带、试剂消耗少，易于微型化和集成化，应用范围广。

具体实施方式

实施例一 银离子取代的羟基磷灰石标记抗体的制备

（1）将粒径20nm的纳米羟基磷灰石和硝酸银以质量比为1:1的比例混合，溶于5mL水中，震荡10小时，离心分离；

（2）取1mg获得的银离子取代的纳米羟基磷灰石，溶于5mL磷酸盐缓冲溶液，加入0.05ml浓度为10 μg/mL 的PSA抗体溶液，孵化震荡5小时，离心分离；

（3）将获得的银离子取代的羟基磷灰石标记抗体重新加入5mL磷酸盐缓冲溶液，并加入1mg的牛血清白蛋白，孵化震荡5小时，离心分离；

（4）将沉淀重新分散到2mL磷酸盐缓冲溶液中，即获得银离子取代的羟基磷灰石标记抗体的储备液。

实施例二 银离子取代的羟基磷灰石标记抗体的制备

（1）将粒径60nm的纳米羟基磷灰石和硝酸银以质量比为1: 3的比例混合，溶于10mL水中，震荡24小时，离心分离；

（2）取2mg获得的银离子取代的纳米羟基磷灰石，溶于5mL磷酸盐缓冲溶液，加入0.1ml浓度为10 μg/mL 的PSA抗体溶液，孵化震荡12小时，离心分离；

（3）将获得的银离子取代的羟基磷灰石标记抗体重新加入5mL磷酸盐缓冲溶液，并加入1mg的牛血清白蛋白，孵化震荡12小时，离心分离；

（4）将沉淀重新分散到4mL磷酸盐缓冲溶液中，即获得银离子取代的羟基磷灰石标记抗体的储备液。

实施例三  银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器制备

（1）取5μL金纳米溶胶滴加到丝网印刷电极上，晾干；

（2）在丝网印刷电极上滴加5μL的浓度为10μg/mL PSA抗体溶液，孵化1小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；

（3）在丝网印刷电极上滴加5μL的浓度为1%牛血清白蛋白溶液，孵化1小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；

（4）在丝网印刷电极上滴加5μL的PSA溶液，孵化1小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得PSA免疫传感器；

（5）依次在丝网印刷电极上滴加5μL的银离子取代的羟基磷灰石标记抗体溶液，孵化1小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器制备。

实施例四 银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器制备

（1）取20μL金纳米溶胶滴加到丝网印刷电极上，晾干；

（2）在丝网印刷电极上滴加10μL的浓度为10μg/mL PSA抗体溶液，孵化4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；

（3）在丝网印刷电极上滴加10μL的浓度为1%牛血清白蛋白溶液，孵化4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；

（4）在丝网印刷电极上滴加10μL的PSA溶液，孵化4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得PSA免疫传感器；

（5）依次在丝网印刷电极上滴加10μL的银离子取代的羟基磷灰石标记抗体溶液，孵化4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得银离子取代羟基磷灰石中钙的免疫传感器制备。

实施例五  PSA的检测方法

实施例1~4中任一所述的一种高灵敏前列腺肿瘤标志物免疫传感器，用于PSA的检测，包括以下步骤：

（1）工作曲线的绘制

采用不同浓度的PSA按照实施例1~4中任一所所述的方法制备一系列丝网印刷电极免疫传感器；

将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入50μL的磷酸盐缓冲溶液溶液，再加入10μL的1+10的盐酸溶液，将银离子取代的羟基磷灰石溶解，释放出银离子；

设定电位范围为-0.2~0.4V，沉积电位为-0.2V，沉积时间为30~300s，通过阳极溶出伏安法检测修饰好的工作电极的电流响应；

根据所得电流响应与PSA浓度的关系，绘制工作曲线；

（2）PSA的检测

采用10μL待测血清样品取代步骤（1）中的PSA，其它与步骤（1）相同；

根据所测得的数值，对照PSA的工作曲线，计算出样品中PSA的含量。