公开/公告号CN104334737A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-02-04
原文格式PDF
申请/专利权人 株式会社糖锁工学研究所;
申请/专利号CN201480001391.7
发明设计人 村濑健文;
申请日2014-04-17
分类号C12P19/04;C08B37/00;C07K7/06;
代理机构北京市磐华律师事务所;
代理人董巍
地址 日本京都府京都市下京区中堂寺南町134番地
入库时间 2023-12-17 03:53:39
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-02-22
授权
授权
2016-03-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P19/04 申请日:20140417
实质审查的生效
2015-02-04
公开
公开
技术领域
本发明涉及活化的糖链衍生物的制备方法和活化的糖链衍生物化合 物。
背景技术
糖链通常是指单糖与单糖通过糖苷键这种键结合成链状的物质。在生 物体内，已知各种糖链发挥着重要的作用。在生物体内，糖链往往是作为 与肽、蛋白质、脂质等结合的复合糖质而存在。
特别是，在存在于生物体内的糖肽或糖蛋白中，已知具有特定结构的 糖链与肽的特定氨基酸结合。已知这些糖链根据其结构的不同而对肽(蛋 白质)的活性或活体内动力学等产生各种影响。
已知还有人将这种糖链或添加有糖链的肽用作药品，但通过细胞系来 制备添加有糖链的肽时，糖链的结构不均一。若糖链的结构不均一，则在 药效上也会产生偏差，因此迫切需要在肽上添加分离纯化或化学合成的结 构均一的糖链。但是，为了使分离纯化或化学合成的糖链与肽等其他物质 结合，根据需要，需要在糖链上添加结合所需的官能团。
作为在糖链上添加与其他物质结合所需的官能团(在本发明中，还称 作活化基团)的方法，可以进行如下的方法：从天然的蛋黄等中分离纯化 在糖链的还原末端具有-OH基的糖链，利用碳酸铵法向糖链的还原末端导 入氨基，在该氨基上添加活化基团(例如参照专利文献1、2和非专利文献1、 2)。然而，在这种方法中，尽管天然存在的糖肽在糖链与肽的结合中的立 体构型是β型，但在向糖链中导入氨基的过程中，位于糖链还原末端的单元 糖是经过开环闭环而导入氨基的，因此出现了产生α端基异构体和β端基异 构体的混合物的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2005/010053号
专利文献2：EP0413675A2
非专利文献
非专利文献1：Biochemistry(1992),第31卷,10724-10732页
非专利文献2：Biochemical J.(1993),第296卷,817-825页
发明内容
发明所要解决的课题
在制备具有活化基团的糖链化合物时，在作为现有技术的碳酸铵法 中，在向糖链的还原末端导入氨基的过程中，位于糖链的还原末端的单元 糖开环，出现了产生α端基异构体和β端基异构体的混合物的问题。
用于解决课题的方法
为了解决上述课题，本发明人对β选择性地制备在糖链的还原末端具 有活化基团的糖链化合物的方法进行了深入研究。其结果，本发明人发现 了下述方法：以具有糖链天冬酰胺结构的化合物为原料，从糖链肽中切断 糖链，使糖链的还原末端与来自天冬酰胺侧链的氮原子保持结合的状态， 不仅保持了上述糖链的还原末端与上述氮原子之间的共价键、还保持了β 立体构型不变，向上述氮原子上导入活化基团，制备作为β端基异构体的、 具有活化基团的糖链化合物。另外，本发明人对上述制备方法进行了深入 研究的结果，作为本发明的化合物，发现了作为β端基异构体的新的具有活 化基团的糖链化合物。
即，本发明涉及下述式(1a)所表示的化合物的制备方法，
G-NH-CO-CH2-Y1
(1a)
(其中，G表示糖链，Y1表示活化基团，G与NH结合，使NH的氮 原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结合)。
本发明的制备方法可以是上述式(1a)所表示的化合物的制备方法， 该方法包括以下的步骤(a)～(b)。
在本发明的制备方法中，步骤(a)可以是如下表示的步骤：
步骤(a)：在碱性条件下，使糖链天冬酰胺水解酶与具有下述式(2) 所表示的糖链天冬酰胺结构的化合物发生作用，得到下述式(3)所表示的 化合物。
G-Asn
(2)
(其中，G表示糖链，Asn表示天冬酰胺，G与Asn结合，使上述天 冬酰胺侧链的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进 行结合)。
G-NH2
(3)
(其中，G表示糖链，NH2表示氨基，G与NH2结合，使来自上述天 冬酰胺侧链的氮原子的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型 的方式进行结合)。
在本发明的制备方法中，步骤(b)可以是如下表示的步骤：
步骤(b)：使步骤(a)中得到的上述式(3)所表示的化合物与下述 式(4)所表示的化合物反应。
L1-CO-CH2-Y1
(4)
(其中，L1为离去基团，Y1为活化基团)。
另外，在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施 方式中，涉及下述式(1b)所表示的化合物的制备方法。
G-NH-CO-CH2-Y2
(1b)
(其中，G表示糖链，Y2表示活化基团，G与NH结合，使NH的氮 原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结合)。
在本发明的制备方法中，上述式(1b)所表示的化合物的制备方法可 以包含以下的步骤(a)～(c)。
在本发明的式(1b)所表示的化合物的制备方法中，步骤(a)可以是 如下表示的步骤：
步骤(a)：在碱性条件下，使糖链天冬酰胺水解酶与具有下述式(2) 所表示的糖链天冬酰胺结构的化合物发生作用，得到下述式(3)所表示的 化合物。
G-Asn
(2)
(其中，G表示糖链，Asn表示天冬酰胺，G与Asn结合，使上述天 冬酰胺侧链的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进 行结合)。
G-NH2
(3)
(其中，G表示糖链，NH2表示氨基，G与NH2结合，使来自上述天 冬酰胺侧链的氮原子的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型 的方式进行结合)。
在本发明的式(1b)所表示的化合物的制备方法中，步骤(b)可以 是如下表示的步骤：
步骤(b)：使步骤(a)中得到的上述式(3)所表示的化合物与下述 式(5)所表示的化合物反应。
L1-CO-CH2-Z
(5)
(其中，L1为离去基团，Z为卤原子)。
在本发明的式(1b)所表示的化合物的制备方法中，步骤(c)可以是 如下表示的步骤。
步骤(c)：使步骤(b)中得到的化合物与下述式(6a)或式(6b)所 表示的化合物反应。
L2-Y2
(6a)
(其中，L2为离去基团，Y2为活化基团)。
L3Y3
(6b)
(其中，L3为阳离子，Y3为上述活化基团Y2的阴离子，L3Y3是L3与Y3的盐)。
在本发明的上述式(1a)所表示的化合物的制备方法的一个实施方式 中，Y1可以是选自由溴原子、氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组的基团。
在本发明的上述式(1a)所表示的化合物的制备方法的一个实施方式 中，Y1可以是选自由溴原子、氯原子、碘原子和CH(OMe)2所构成的组的 基团。
在本发明的上述式(1b)所表示的化合物的制备方法的一个实施方式 中，Z可以为溴原子，Y2可以是选自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2和SHCH2CH2NH2所构成的组的基团。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式 中，上述步骤(a)中的上述糖链天冬酰胺水解酶可以是糖基天冬酰胺酶(GA) 和/或肽：N-聚糖酶(PNGase)。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式 中，上述步骤(a)中的上述糖链天冬酰胺水解酶可以是被固定在载体上的 那些酶。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式 中，上述步骤(a)中的上述糖链天冬酰胺水解酶被固定在载体上，而且， 在上述步骤(a)之后以及上述步骤(b)之前可以包括以下的步骤(d)。
步骤(d)：从反应系统中分离被固定在载体上的上述糖链天冬酰胺水 解酶。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式 中，上述步骤(a)可以在0℃～40℃的温度条件下进行。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式 中，上述步骤(a)可以在0℃～10℃的温度条件下进行。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式中， 上述糖链可以是N-结合型糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式中， 上述糖链可以是N-结合型的复合型糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式中， 上述糖链可以是选自由二唾液酸糖链、去唾液酸糖链和DiGlcNAc糖链所构 成组的糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式中， 上述糖链可以用下述的式(7)来表示。
[化学式1]
(其中，R和R’各自独立地选自由下述的式(8a)～式(8f)所表示的糖链 所构成的组)
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
[化学式5]
[化学式6]
[化学式7]
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式中， 上述糖链可以是二唾液酸糖链，其中构成上述二唾液酸糖链的唾液酸的侧链 羧酸通过酯化或酰胺化而得到保护。
在本发明的另一实施方式中，本发明涉及作为具有活化基团的糖链化合 物的、下述式(1c)所表示的化合物：
[化学式8]
(其中，Y选自由溴原子、氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’各自独立地选自以下的式(8a)～式(8f) 所表示的糖链所构成的组。)
[化学式9]
[化学式10]
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化合物14]
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，可以是上述 式(1c)所表示的化合物，式中，Y选自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’各自独立地选自上述式 (8a)～式(8f)所表示的糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，可以是上述 式(1c)所表示的化合物，式中，Y选自由碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’各自独立地选自上述式 (8a)～式(8f)所表示的糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，可以是上述 式(1c)所表示的化合物，式中，Y选自由SH、N3、NHNH2、SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’各自独立地选自上述式(8a)～式(8f) 所表示的糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，可以是上述 式(1c)所表示的化合物，式中，Y选自由碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’相同，均选自上述式(8a)～ 式(8e)所表示的糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，可以是上述 式(1c)所表示的化合物，式中，Y选自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’均为上述式(8b)所表示的 糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，可以是上述 式(1c)所表示的化合物，式中，Y选自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、 SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组，R和R’均为上述式(8c)所表示的 糖链。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的制备方法的一个实施方式中， 进行各步骤时的碱性条件、反应温度、反应时间、反应的化合物等可以是上 述所示例的任意组合。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物的一个实施方式中，式中的Y、 R和R’可以是选自上述所示基团的基团的任意组合。
发明效果
本发明作为具有活化基团的糖链衍生物的制备方法，与作为现有技术的 碳酸铵法相比，具有对于糖链的还原末端能够保持β型立体构型不变而导入 活化基团的效果、即具有优异的β选择性的效果。
另外，本发明根据其实施方式，作为具有活化基团的糖链衍生物的制备 方法，与现有的碳酸铵法相比，具有能够在更短时间内制备β端基异构体的 纯度更高的糖链衍生物的效果。
另外，本发明作为具有活化基团的糖链衍生物的制备方法，通过采用低 温条件，具有能够制备收率更高且β端基异构体的纯度高的糖链衍生物的效 果。
另外，本发明通过将酶固定在固相上，具有能够更简便地以更高的收率 制备β端基异构体的纯度高的糖链衍生物的效果。
而且，通过使用本发明的具有活化基团的糖链衍生物，并使其与存在于 肽等的侧链中的、或者导入到肽等的侧链中的官能团反应，能够制备具有结 构均一的糖链的糖肽和/或糖蛋白，所述糖链相对于肽为β端基异构体。
附图说明
图1是显示现有技术的合成流程图的反应式。
图2是显示本发明的合成流程图的反应式。
图3是按照现有技术的方法合成的去唾液酸糖链-NH-AcBr的1H-NMR 谱。
图4是按照本发明的方法合成的去唾液酸糖链-NH-AcBr的1H-NMR谱。
具体实施方式
下面，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明涉及具有活化基团的糖链化合物的制备方法。
在本发明中，具有活化基团的糖链化合物是指，在糖链的还原末端具有 氨基、且又使活化基团与该氨基结合而得到的化合物。在本发明中，有时将 “使活化基团与糖链化合物结合”称作“向糖链化合物中导入活化基团”。活 化基团是指具有反应性高的官能团的取代基，所述官能团能够用于使糖链与 肽、蛋白质、脂质等其他物质结合。在本发明中，具有活化基团的糖链化合 物是指为了使糖链与其他物质结合而衍生物化的化合物，在这个意义上，还 可以将其称作活化的糖链衍生物，或者，只称作糖链衍生物。
本发明中的具有活化基团的糖链化合物的制备方法包括步骤(a)和步骤 (b)。
步骤(a)是指，使糖链天冬酰胺水解酶与糖链天冬酰胺或含糖链天冬酰 胺的糖链肽发生作用，得到在糖链的还原末端结合有来自天冬酰胺侧链的氨 基的糖链胺化合物。
步骤(b)是指，使步骤(a)中得到的糖链胺化合物与具有活化基团的 化合物反应，向存在于糖链还原末端的氨基的氮原子上导入活化基团。
在步骤(a)中，其特征在于：在碱性条件下使用糖链天冬酰胺水解酶。
在现有技术中，在从糖肽中分离纯化糖链时，有时也使用酶从糖链天冬 酰胺中切断糖链并进行分离(例如参照上述专利文献1)，但在这样的现有方 法中，通过糖链天冬酰胺水解酶得到了在糖链的还原末端具有羟基而不是氨 基的糖链。而且，已知在还原末端具有羟基的糖链得到了具有-OH基的α立体 构型的糖链(即α端基异构体)和具有-OH基的β立体构型的糖链(即β端基异 构体)的混合物。
而且，对于这种作为在还原末端具有-OH基的糖链的α端基异构体和β端 基异构体的混合物的糖链，实行了通过碳酸铵法将还原末端的羟基取代成氨 基的方法。而且，在碳酸铵法中，已知为了使其与碳酸铵发生作用，而在某 种程度的高温下进行某种程度的长时间的反应。而且，其结果，得到的糖链 化合物也不是β型端基异构体的纯度充分高的化合物。
因此，本发明人对β选择性高的、具有活化基团的糖链化合物的制备方法 进行了深入研究的结果，令人惊奇的是，发现了：通过在使用糖链天冬酰胺 水解酶时采用碱性条件，能够在糖链的还原末端保持来自天冬酰胺的侧链氮 原子的氨基，能够实现优异的β选择性。
即，作为本发明的一个方面，本发明人发现了：通过在使用糖链天冬酰 胺水解酶时采用碱性条件、并且在低温下进行反应，能够实现更显著的β选择 性。
另外，作为本发明的一个方面，本发明人还发现了：通过在使用糖链天 冬酰胺水解酶时采用碱性条件、并且在短时间内进行反应，能够实现更显著 的β选择性。
另外，作为本发明的一个方面，本发明人还发现了：通过在使用糖链天 冬酰胺水解酶时采用碱性条件、在低温下且在短时间内进行反应，能够实现 更显著的β选择性。
作为本发明人反复进行深入研究的结果，如在以下的实施例中说明的那 样，根据本发明的制备方法，能够实现β选择性超过94％的、更优选超过99％ 的非常高的β选择性的反应。
此外，根据本发明的制备方法，由于在分离纯化糖链后不需要进行将糖 链氨基化的步骤，所以能够削减现有方法中的氨基化所需的成本和时间。
而且，根据本发明的制备方法，能够大幅缩短由糖链天冬酰胺或糖链肽 得到糖链胺化合物的时间。
而且，在现有的碳酸铵法中，在30℃～50℃的高温下长时间反应中，当 发生糖链的分解反应或糖链的保护基的脱保护反应，而导致收率下降时，根 据本发明的制备方法，能够防止这种糖链的分解或脱保护，成为收率更高的 制备方法。
在本发明的制备方法中，作为目的化合物的、具有活化基团的糖链化合 物，能够作为式(1a)所表示的化合物、式(1b)所表示的化合物、式(1c) 所表示的化合物等来显示。
例如，式(1a)所表示的化合物如下。
G-NH-CO-CH2-Y1
(1a)
(其中，G表示糖链，Y1表示活化基团，G与NH结合，使NH的氮原 子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结合)。
这些化合物可谓是活化基团(Y、Y1或Y2)经由-NH-CO-CH2-与糖链的 还原末端结合而得到的化合物。
作为本发明的制备方法中使用的原料化合物，可以例示“具有式(2)所 表示的糖链天冬酰胺结构的化合物”等。
G-Asn
(2)
(其中，G表示糖链，Asn表示天冬酰胺，G与Asn结合，使上述天冬 酰胺侧链的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结 合)。
这里，“式(2)所表示的糖链天冬酰胺结构”是指，天冬酰胺侧链的氮原 子与糖链的还原末端结合为β型立体构型的结构。在本说明书中，有时将其称 作“糖链天冬酰胺结构”。“具有式(2)所表示的糖链天冬酰胺结构的化合物” 除了包含由糖链和天冬酰胺构成的糖链天冬酰胺以外，还包含在糖链天冬酰 胺的两端还有通过肽键结合的其他氨基酸的含糖链天冬酰胺的肽。
即，“具有式(2)所表示的糖链天冬酰胺结构的化合物”还能够以下述式 (2a)的形式来表示。
(Aa)n-Asn(G)-(Aa)m
(2a)
(其中，Aa表示任意的氨基酸，(Aa)n表示独立选择的任意的n个氨基酸 通过肽键结合，(Aa)m表示独立选择的任意的m个氨基酸通过肽键结合，n、m 各自独立为0～100的整数；关于Asn(G)，与式(2)一样，表示天冬酰胺侧链 的氮原子与糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结合)。
这里，当n和m同时为0时，是指在糖链天冬酰胺的两端没有其他的氨基 酸通过肽键而结合、而是1分子的糖链与1分子的天冬酰胺结合的糖链天冬酰 胺。
这里，当n或m为0时，是指式(2a)中的天冬酰胺的C末端的羧基或N末 端的氨基没有与其他氨基酸通过肽键而结合，而是游离的羧基或游离的氨基。
在本发明的一个方面中，n为0～100的整数，优选为0～10的整数，更优 选为0～5的整数。
在本发明的一个方面中，m为0～100的整数，优选为0～10的整数，更优 选为0～5的整数。
在本发明的一个方面中，具有式(2)所表示的糖链天冬酰胺结构的化合 物除了可以直接使用糖蛋白或糖肽以外，还可以使用以糖蛋白或糖肽为原料， 事先通过肽水解酶进行了某种程度的片段化的物质。另外，还可以使用市售 的糖肽或糖链天冬酰胺、或其衍生物等。
作为本发明的制备方法中的中间体，可以例示式(3)所表示的化合物等。
G-NH2
(3)
(其中，G表示糖链，NH2表示氨基，G与NH2结合，使来自上述天冬 酰胺侧链的氮原子的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方 式进行结合)。
式(3)所表示的化合物在糖链的还原末端以与来自天冬酰胺侧链的氮原 子的氮原子以成为β型立体构型的方式进行结合，还可以将其称作糖链胺化合 物。
作为本发明的制备方法中的活化剂，可以例示式(4)所表示的化合物。
L1-CO-CH2-Y1
(4)
(其中，L1为离去基团，Y1为活化基团)。
式(4)所表示的化合物还可以称作用于使-CO-CH2-Y1部分与上述式(3) 所表示的化合物的氮原子结合的活化剂，或者只称作活化剂。
本发明的制备方法包括步骤(a)和步骤(b)。下面，更详细地对步骤(a) 和步骤(b)进行说明。
步骤(a)可以表示如下。
步骤(a)：在碱性条件下，使糖链天冬酰胺水解酶与具有下述式(2)所 表示的糖链天冬酰胺结构的化合物发生作用，得到下述式(3)所表示的化合 物。
G-Asn
(2)
(其中，G表示糖链，Asn表示天冬酰胺，G与Asn结合，使上述天冬 酰胺侧链的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结 合。
G-NH2
(3)
(其中，G表示糖链，NH2表示氨基，G与NH2结合，使来自上述天冬 酰胺侧链的氮原子的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方 式进行结合)。
步骤(a)是指，使糖链天冬酰胺水解酶与具有上述式(2)所表示的糖 链天冬酰胺结构的化合物发生作用，得到上述式(3)所表示的化合物(还称 作糖链胺化合物)。
本发明的制备方法中的糖链天冬酰胺水解酶，只要是不切断糖链的还原 末端与天冬酰胺侧链的氮原子的键、而是水解天冬酰胺侧链中的氮原子和与 该氮原子相邻的羰基碳原子之间的键的酶，则没有特别限定。通过该反应， 由糖链天冬酰胺生成糖链胺化合物和天冬氨酸。
作为本发明的糖链天冬酰胺水解酶的例子，可以列举糖基天冬酰胺酶 (GA)或肽：N-聚糖酶(PNGase)。PNGase根据其来源已知有例如PNGase-F、 PNGase-A等。糖基天冬酰胺酶(GA)或肽：N-聚糖酶(PNGase)除了可以 利用表达并纯化这些酶的方法等来制备以外，还可以从BioLabs Inc.等获取。
在本发明的一个方面中，当使用糖基天冬酰胺酶(GA)作为糖链天冬酰 胺水解酶时，优选使用在式(2a)中n和m均为0的糖链天冬酰胺作为底物。
在本发明的一个方面中，当使用肽：N-聚糖酶(PNGase)作为糖链天冬 酰胺水解酶时，优选使用在式(2a)中n和m均不为0的含糖链天冬酰胺的 肽作为底物。在使用肽：N-聚糖酶(PNGase)时，作为底物，可以使用被称 作唾液酸糖肽(SGP)的糖肽。
唾液酸糖肽(SGP)是在糖链天冬酰胺的N末端侧结合有3个残基的氨基 酸、而在C末端侧结合有2个残基的氨基酸的共计6个残基的糖肽，序列可 以以Lys-Val-Ala-Asn(糖链)-Lys-Thr的形式显示。唾液酸糖肽(SGP)除了可 以从株式会社伏见制药所购入以外，还可以通过从肽部分更长的糖蛋白或糖 肽中切断肽部分来制备。
在本发明的制备方法中，在碱性条件下进行步骤(a)。这里，在由具有 式(2)所表示的糖链天冬酰胺结构的化合物得到式(3)所表示的化合物(糖 链胺化合物)的步骤中，碱性条件是指能够实现高β选择性的程度的碱性。 看过本说明书的本领域技术人员将能理解为了实现作为本发明的高β选择性 所必需的pH的程度。在本发明的一个方面中，碱性条件可以是弱碱性条件。 在本发明的一个方面中，碱性条件是指pH8～11，优选pH8～10，更优选pH8～ 9。这样的碱性条件可以使用显示出上述pH的溶剂、调整成上述pH的溶剂 来实现。作为具体例子，可以使用碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸钾 水溶液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)缓冲溶液等普通的缓冲溶液。上述 碱性条件除了在反应开始前先调整好以外，还可以在反应中监测pH等来进 一步调整。在本发明中，可以利用通常使用的pH计(株式会社堀场制作所 pH测定仪D-51S)等来测定pH。例如，在本发明的实施例中，使用碳酸氢 钠水溶液，使用上述pH计来测定pH时，pH为约8.5。在本发明的一个实施 方式中，碱性条件可以通过向反应系统内加入实现上述碱性条件的量的碱性 物质(碳酸氢钠等)并进行搅拌的方法等来实现，只要必然能够实现上述碱 性条件，未必需要使用pH计等来调节碱性条件的步骤。
在本发明的制备方法的一个方面中，优选在碱性条件下、且在短时间内 进行步骤(a)。“在短时间内”进行可以是指与作为现有方法的碳酸铵法相比 在更短时间内进行。在作为现有方法的碳酸铵法中，已知通常反应一周左右。 本发明人深入研究了利用糖链天冬酰胺水解酶进行的β选择性水解反应的条 件，结果发现了：通过将反应条件设为碱性条件、并且将反应时间设为短时 间，能够抑制位于糖链还原末端的糖的开环反应，能够进一步提高β选择性。
本发明的制备方法中的步骤(a)，能够在碱性条件下由具有式(2)所表 示的糖链天冬酰胺结构的化合物高效率地得到式(3)所表示的化合物(糖链 胺化合物)，能够进一步缩短反应时间。
这里，“在短时间内”是指与上述现有方法相比时间更短，此外还指10 分钟～3小时，优选10分钟～2小时，更优选10分钟～1小时。但是，只要 能够实现本发明的制备方法中的优异的β选择性，并不从本发明的范围中排 除“在上述的反应时间以上继续反应”。
在本发明的制备方法的一个方面中，优选在碱性条件下、且在低温下进 行步骤(a)。在作为现有方法的碳酸铵法中，已知通常在30℃～50℃下进行 反应。本发明人为了得到糖链胺化合物而深入研究了利用糖链天冬酰胺水解 酶进行的水解反应的条件，结果发现了：通过在低温下进行步骤(a)，能够 抑制位于糖链还原末端的糖的开环反应，能够进一步提高β选择性。
由于本发明的制备方法中的步骤(a)是酶反应，所以还预测37℃左右 是适宜温度，本发明人对此进行了深入研究的结果，令人惊奇的是，并不限 于通常的适合酶的37℃左右的温度，还采用4℃等特意比通常的酶反应低的 温度，成功地找到了β选择性优异、并且具有充分的反应性的实验条件。
而且，虽然本发明人预料到在低温下酶的反应速度会下降，但却发现： 尽管是低温、而且即使例如1小时以内的短时间内也能够实现充分的反应性。
这里，低温除了是指与上述的现有方法相比温度低以外，还指0℃～40℃， 在本发明的一个方面中，低温优选为0℃～20℃，更优选为0℃～10℃。在本 发明的一个方面中，低温进一步优选为2℃～6℃。
用于实现低温的温度调节方法只要是能够调节至上述温度的方法，则没 有特别限定。作为温度调节方法，可以采用通常的生物化学实验中使用的方 法来实现，例如，可以采用恒温槽、冰冷却等方法来进行。在本发明中，可 以利用通常使用的温度计(红液棒状温度计等)等来测定温度。
在本发明的制备方法中，步骤(b)可以表示如下。
步骤(b)：使步骤(a)中得到的上述式(3)所表示的化合物与下述式 (4)所表示的化合物反应。
L1-CO-CH2-Y1
(4)
(其中，L1为离去基团，Y1为活化基团)。
在本发明的制备方法中，步骤(b)是指使步骤(a)中得到的式(3)所 表示的化合物与式(4)所表示的化合物反应的步骤。
认为使式(4)所表示的化合物与式(3)所表示的化合物反应时，式(3) 中的NH2的氮原子亲核进攻式(4)中的羰基碳。其结果，认为氢原子从式(3) 中的NH2中脱离，而L1从式(4)的化合物中脱离，在式(3)中的氮原子与 式(4)中的羰基碳之间形成共价键。
在该步骤(b)中，其特征在于：糖链还原末端的、与糖链还原末端结合 的氮原子的立体构型为β型立体构型。
这里，式(4)所表示的化合物是指具有在步骤(b)中可以脱离的离去 基团L1和活化基团Y1的化合物。
这里，离去基团只要是在步骤(b)中在能够保持糖链还原末端的β型立 体结构的条件下能够脱离的离去基团，则没有特别限定。在本发明中，作为 离去基团，可以使用在针对羰基碳的亲核进攻中脱离的离去基团。作为这样 的离去基团，例如可以列举卤原子(溴原子、氯原子、碘原子等)。另外，例 如作为式(4)所表示的化合物，可以使用对称酸酐(Y1-CH2-CO-O-CO-CH2-Y1)， 这种情况下，离去基团是Y1-CH2-CO-O所表示的基团。另外，例如作为式(4) 所表示的化合物，还可以使用羟基琥珀酰亚胺酯，这种情况下，离去基团是 羟基琥珀酰亚胺部分(在琥珀酰亚胺的氮原子上结合有氧原子的部分)。在本 发明的一个方面中，离去基团优选为卤原子、Y1-CH2-CO-O所表示的基团， 更优选为溴原子、氯原子。
在本发明的制备方法中，活化基团只要是能够用作用于使本发明的式 (1a)、式(1b)所表示的化合物进一步与其他物质结合的反应基团的活化基 团，则没有特别限定。在本发明的一个方面中，其他物质优选在生物体内形 成复合糖质的生物体内物质。在本发明中，作为活化基团，例如只要是能够 与肽或脂质等生物体物质中存在的羧基、氨基、羟基、硫醇基等官能团反应 的基团即可，可以列举在活化基团与上述官能团之间形成键的基团。另外， 作为活化基团，除了上述的用于形成键的基团以外，还可以是在式(4)中在 与活化基团相邻的-CH2-的碳原子和上述的其他物质的官能团之间形成键的 基团，而活化基团本身可以是在结合时脱离的取代基。
在本发明的制备方法的一个方面中，步骤(b)中使用的活化基团可以使 用在用于与上述式(3)所表示的化合物反应的官能团部分以外的部分中被保 护基保护的基团。这种情况下，优选在步骤(b)之后或者之后经过适当步骤 后包括将上述保护基部分脱保护的步骤。例如，在打算制备Y2为SH的化合 物作为上述式(1a)所表示的化合物时，在步骤(b)中通过使用在式(4) 所表示的化合物中具有硫代乙酰基作为Y2来代替SH的化合物以导入硫代乙 酰基，之后将乙酰基脱保护来制备。
在本发明的制备方法中，作为这样的活化基团，例如可以列举卤原子、 氨基、羧基、硫醇基、叠氮基、肼基、二甲氧基甲基等。在本发明的一个方 面中，优选为溴原子、氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2和CH(OMe)2，更 优选为溴原子、碘原子。
除了实施例中记载的化合物的活化基团以外，即使是对其进行了某种修 饰的活化基团，也能够利用本发明的制备方法进行制备，看过本说明书的本 领域技术人员会理解这一点。
步骤(b)可以在弱碱性溶剂中进行。在本发明的一个方面中，作为溶剂， 优选可以使用碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸钾水溶液、N,N-双(2-羟 乙基)甘氨酸(BICINE)缓冲溶液等普通的缓冲溶液，更优选可以使用碳酸氢钠 水溶液。
在步骤(b)中，步骤(b)的pH只要能够实现优异的β选择性，则没 有特别限定。在本发明的一个方面中，步骤(b)的pH优选为pH8～11，更 优选为pH8～10，进一步优选为pH8～9。
在步骤(b)中，步骤(b)的反应时间只要能够实现优异的β选择性， 则没有特别限定。在本发明的一个方面中，步骤(b)的反应时间优选为10 分钟～20小时，更优选为10分钟～1小时。
在步骤(b)中，步骤(b)的反应温度只要能够实现优异的β选择性， 则没有特别限定。在本发明的一个方面中，步骤(b)的反应温度优选为0～ 40℃，更优选为0～10℃。
在本发明的一个方面中，步骤(b)优选可以在冰冷却下、或者与其等同 的温度条件下在1小时以内结束。
在本发明的一个方面中，当采用包括步骤(a)和(b)的制备方法时， 优选Y1选自由溴原子、氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2、SHCH2CH2NH2和CH(OMe)2所构成的组。
在本发明的一个方面中，当采用包括步骤(a)和(b)的制备方法时， 优选Y1选自由溴原子、氯原子、碘原子和CH(OMe)2所构成的组。
在本发明的一个方案中，本发明的具有活化基团的糖链化合物除了可以 利用上述的步骤(a)和步骤(b)的方法进行合成以外，根据活化基团的种 类，还可以通过在上述的步骤(a)和步骤(b)之后包括以下的步骤(c)的 方法来制备。
即，包括步骤(a)～(c)的方法可以如下记载。
下述式(1b)所表示的化合物的制备方法，其包括下述步骤(a)～(c)：
G-NH-CO-CH2-Y2
(1b)
(其中，G表示糖链，Y2表示活化基团，G与NH结合，使NH的氮原 子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结合)
步骤(a)：在碱性条件下，使糖链天冬酰胺水解酶与具有下述式(2)所 表示的糖链天冬酰胺结构的化合物发生作用，得到下述式(3)所表示的化合 物。
G-Asn
(2)
(其中，G表示糖链，Asn表示天冬酰胺，G与Asn结合，使上述天冬 酰胺侧链的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结 合)。
G-NH2
(3)
(其中，G表示糖链，NH2表示氨基，G与NH2结合，使来自上述天冬 酰胺侧链的氮原子的氮原子与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方 式进行结合)；
步骤(b)：使步骤(a)中得到的上述式(3)所表示的化合物与下述式 (5)所表示的化合物反应。
L1-CO-CH2-Z
(5)
(其中，L1为离去基团，Z为卤原子)；
步骤(c)：使步骤(b)中得到的化合物与下述式(6a)或式(6b)所表 示的化合物反应。
L2-Y2
(6a)
(其中，L2为离去基团，Y2为活化基团)。
L3Y3
(6b)
(其中，L3为阳离子，Y3为上述活化基团Y2的阴离子，L3Y3是L3与 Y3的盐)。
即，包括步骤(a)、(b)和(c)的制备方法是如下的反应：在步骤(b) 中，以活化基团为Z(卤原子)的式(5)所表示的化合物作为活化剂与式(3) 所表示的化合物反应，而且，作为步骤(c)，通过使具有活化基团Y2的化合 物进行反应，将上述的卤原子取代成Y2。
采用该方法时，通过步骤(b)的反应，得到了在式(1a)所表示的化合 物中活化基团Y1为卤原子的化合物。用化学式表示该化合物时，可以以下述 式(1d)的形式表示。
G-NH-CO-CH2-Z
(1d)
(其中，G表示糖链，Z表示卤原子，G与NH结合，使NH的氮原子 与上述糖链的还原末端以成为β型立体构型的方式进行结合)。
该式(1d)所表示的化合物也可以用作本发明的制备方法中的目的化合 物，但通过以该化合物作为中间体来再进行步骤(c)，可以得到式(1b)所 表示的化合物。
在步骤(c)中，使通过步骤(b)得到的化合物与式(6a)或式(6b) 所表示的化合物反应。
这里，式(6a)所表示的化合物如下。
L2-Y2
(6a)
(其中，L2为离去基团，Y2为活化基团)。
这里，L2只要是在步骤(c)中能够脱离的基团即可。在本发明的一个方 案中，L2优选为氢原子等。为了导入本说明书中记载的活化基团，除了实施 例中记载的离去基团以外，看过本说明书的本领域技术人员还将对能够同样 使用的离去基团进行适当研究。
这里，Y2只要是在已经阐述的活化基团Y1中、在步骤(c)中能够与通 过步骤(b)而得到的化合物中的Z(卤原子)进行取代的活化基团即可。在 本发明的一个方案中，Y2优选为从Y1的活化基团中除去了Z所表示的卤原 子而得到的基团。在本发明的一个方案中，当Z特别为卤原子中的溴原子时， Y2可以是除溴原子以外的卤原子，优选为从Y1的活化基团中除去了溴原子而 得到的基团。
作为式(6a)所表示的化合物，可以列举肼、硫代乙酸、半胱胺等。为 了导入本说明书中记载的活化基团，除了实施例中记载的化合物以外，看过 本说明书的本领域技术人员还将对可以同样使用的活化剂进行适当研究。
这里，式(6b)所表示的化合物如下。
L3Y3
(6b)
(其中，L3为阳离子，Y3为上述活化基团Y2的阴离子，L3Y3是L3与 Y3的盐)。
即，当活化基团为卤原子等时，可以使用卤离子(例如，氯离子、溴离 子、碘离子)与阳离子的盐作为式(6b)。另外，除卤原子以外，还可以使用 叠氮离子(N3-)这样的有机化合物离子与阳离子的盐等。
这里，作为阳离子，可以列举铵离子、碱金属离子(钠、钾等)、碱土金 属(镁、钙等)等。
作为式(6b)所表示的化合物，可以列举氯化钠、碘化钠、叠氮化钠、 硫代乙酸钾等。
通过采用该包括步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)的制备方法，制备活 化基团为卤原子、例如溴原子的化合物，从而能够以该化合物作为中间体， 制备各种具有活化基团的糖链化合物。利用该方法，具有能够将糖链与活化 基团之间的键固定在β配位子上不变而衍生成各种具有反应性的活化基团的 优点。活化基团为溴原子的化合物容易分离，所以能够有利地用作中间体。
在本发明的一个方案中，当采用包括步骤(a)、(b)和(c)的制备方法 时，优选Z为溴原子，而Y2选自由氯原子、碘原子、SH、N3、NHNH2和 SHCH2CH2NH2所构成的组。
在本发明的制备方法的一个方案中，步骤(c)中使用的活化基团可以使 用在用于与上述式(3)所表示的化合物反应的官能团部分以外的部分被保护 基保护的基团。这种情况下，优选在步骤(c)之后或者之后经过适当步骤后 包括对上述保护基部分进行脱保护的步骤。例如，在打算制备Y2为SH的化 合物作为上述式(1b)所表示的化合物时，在步骤(c)中通过使用在式(6a) 所表示的化合物中具有硫代乙酰基作为Y2来代替SH的化合物以导入硫代乙 酰基，之后将乙酰基脱保护来制备。
而且，本发明人对本发明的制备方法反复进行了深入研究，发现通过在 上述步骤(a)之后、进行步骤(b)之前进行下述步骤(d)，可以进一步提 高收率。
步骤(d)：从反应系统中分离被固定在载体上的上述糖链天冬酰胺水解 酶。
这里，从反应系统中分离是指，实质上分离反应系统和糖链天冬酰胺水 解酶，只要能够分离大部分的糖链天冬酰胺水解酶即可，并不是仅指完全分 离。另外，分离除了是指从反应系统中除去糖链天冬酰胺水解酶以外，还可 以是指从反应系统中取出除糖链天冬酰胺水解酶以外的物质，只要是能够实 质上分离两者的方法，则没有特别限定。
而且，本发明人对本发明的制备方法反复进行了深入研究，发现通过在 上述步骤(a)之后在短时间内进行步骤(b)，可以进一步提高β选择性。
这里，短时间是指1小时以内，优选为10分钟以内。
本发明人反复进行了深入研究，发现作为从反应系统中分离糖链天冬酰 胺水解酶的方法，通过使糖链天冬酰胺水解酶与载体结合，可以简便地进行 步骤(d)，而且，可以从步骤(a)起在短时间内进行步骤(b)。
即，在本发明的一个方案中，糖链天冬酰胺水解酶优选使用固定在载体 上的糖链天冬酰胺水解酶。
固定在载体上是指通过与载体形成共价键等而进行固定，对结合方式等 没有特别限定，只要能够同载体一样和载体一起处理即可。在本发明的一个 方面中，载体优选为固相树脂。用于酶的固定化的固相树脂可以列举： AminoLink(注册商标)Plus偶联树脂(Thermo公司制造，琼脂糖树脂)、 TOYOPEARL-AF-Tresyl-650M、TOYOPEARL-AF-Formyl-650M(Tosoh公司制 造，甲基丙烯酸聚合物树脂)等，不论树脂的种类、固定化的原理如何，只要 是能够维持酶活性的固定化载体即可，可以使用市售的树脂。另外，作为将 糖链天冬酰胺水解酶固定在载体上的方法，可以采用：在载体与酶之间形成 共价键的方法、形成离子对的方法、包埋(entrapping)酶的方法等。除了本 发明的实施例中使用的固相树脂以外，看过本说明书的本领域技术人员还将 对同种类固相树脂进行研究。
在本发明的制备方法中，通过使用固定在载体上的糖链天冬酰胺水解酶， 能够利用过滤等简便的方法从反应系统中分离糖链天冬酰胺水解酶。对从反 应系统中进行分离的方法没有特别限定，例如，根据载体的结构、性质，可 以采用过滤、离心操作等。
根据本发明的制备方法，能够得到各种具有活化基团的糖链化合物，这 样的糖链化合物能够适合用作用于使糖链与肽或蛋白质或脂质等生物体内物 质等结合的糖链衍生物。
而且，作为本发明的一个方案，本发明人提供作为β端基异构体的、新 的具有活化基团的糖链衍生物。作为具有活化基团的糖链化合物，为了使糖 链与目标生物体内物质等结合，本发明人对具有合适的反应性的活化基团进 行了深入研究，结果发现了至少式(1c)所表示的化合物特别适合。
特别是，通过本发明人对本发明进行了深入研究，结论如下：作为式(1c) 而具体例示的化合物具有适合作为用于制备添加有糖链的肽的糖链衍生物的 糖链结构，并且，对肽的天然侧链或者对导入到肽中的侧链具有合适的选择 性、反应性。
另外，作为式(1c)而具体例示的化合物还是利用已经阐述的、包括步 骤(a)和步骤(b)的制备方法能够适当制备的化合物。另外，作为式(1c) 而具体例示的化合物还是利用已经阐述的、包括步骤(a)、步骤(b)和步骤 (c)的制备方法能够适当制备的化合物。
然而，在本发明中，式(1c)所表示的化合物的发明并不限于利用上述 制备方法制备的化合物。
在本发明的制备方法中，看过本说明书的本领域技术人员能够理解特别 是还原末端附近的结构会对本发明的制备方法的β选择性产生强烈的影响， 因此他们也将理解：并不仅限于式(1c)中具体例示的化合物，即使是如式 (1a)或式(1b)所表示的、糖链部分的结构或活化基团部分的结构略有不 同的化合物，也能够按照本发明的制备方法同样地进行制备。
使用本发明中的具有活化基团的糖链化合物作为用于使糖链与生物体内 物质等靶向化合物结合的衍生物时，在式(1c)所表示的化合物中，目标糖 链的R及R’和合适的活化基团Y可以是从式(1c)所记载的选择项中任意组 合的基团。
需要说明的是，在生物体内物质等靶向化合物中，作为结合糖链的靶的 官能团并不限于目标生物体内物质等在天然状态下本来就具有的官能团，可 以是为了与本发明的具有活化基团的糖链化合物反应而导入的官能团。
在本发明的具有活化基团的糖链化合物中，例如，在活化基团为溴原子、 氯原子、碘原子、或SH时，可以以目标生物体内物质等中的硫醇基为靶进 行导入。例如，当活化基团为N3时，可以以目标生物体内物质等中的炔基为 靶进行导入。例如，当活化基团为NHNH2时，可以以目标生物体内物质等中 的、活化的酯基或醛基为靶进行导入。例如，当活化基团为CH(OMe)2时， 可以以目标生物体内物质等中的氨基为靶进行导入。活化基团与靶官能团的 这样的关系只是例示，能够与上述活化基团反应的其他官能团也同样会成为 靶官能团，看过本说明书的本领域技术人员将会对此进行适当研究。
在本说明书中，“糖链”除了包含两个以上的单元糖(单糖和/或其衍生物) 连接而成的化合物以外，还包含由一个单元糖(单糖和/或其衍生物)构成的 化合物。作为这样的糖链，例如除了生物体内含有的单糖类和多糖类(葡萄 糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾 液酸以及它们的复合物或衍生物)以外，还可以列举由分解的多糖、糖蛋白、 蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、糖脂(glycolipids)等复合生物体分子分解或衍生 的糖链等广泛的糖链，但并不限于这些。连接两个以上的单元糖时，各单元 糖通过脱水缩合而通过彼此之间的糖苷键进行结合。糖链可以是直链型也可 以是支链型。
在本说明书中，“糖链”还包含糖链衍生物，作为糖链衍生物，例如可以 列举构成糖链的糖是如下的糖的糖链：具有羧基的糖(例如，C-1位被氧化 形成羧酸的醛糖酸(例如D-葡萄糖被氧化的D-葡萄糖酸)、末端C原子形成了 羧酸的糖醛酸(D-葡萄糖被氧化的D-葡萄糖醛酸))、具有氨基或氨基衍生物 (例如乙酰化的氨基)的糖(例如，N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺 等)、具有氨基和羧基两者的糖(例如，N-乙酰神经氨酸(唾液酸),N-乙酰胞 壁酸等)、脱氧化的糖(例如，2-脱氧-D-核糖)、含硫酸基的硫酸化糖、含磷 酸基的磷酸化糖等，但并不限于这些。
在本说明书中，从化学合成生物体内存在的复合糖质(糖肽(或糖蛋白)、 蛋白聚糖、糖脂等)的观点考虑，“糖链”优选为在生物体内作为复合糖质(糖 肽(或糖蛋白)、蛋白聚糖、糖脂等)而存在的糖链。
在本说明的一个方案中，从化学合成生物体内存在的糖肽或糖蛋白的观 点考虑，优选作为与天冬酰胺结合的糖链而已知的N-结合型糖链(还称作天 冬酰胺结合型糖链、N型糖链。)。
N-结合型糖链作为与肽的天冬酰胺(Asn)的侧链结合的糖链而已知， 已知其具有下式所表示的五糖作为基本结构。
(Man)2-Man-GlcNAc-GlcNac-
(其中，“Man”表示甘露糖，“GlcNAc”表示N-乙酰葡糖胺，左端为非 还原末端，右端为还原末端，在还原末端与天冬酰胺侧链的氮原子结合。)
已知N-结合型糖链根据在上述五糖的非还原末端进一步结合的糖链的 结构进行分类，例如可以列举高甘露糖型、复合(complex)型、混成(hybrid) 型。在本发明的一个方案中，糖链优选为N-结合型的复合型糖链。
在本发明的制备方法中，从化学合成作为糖肽或糖蛋白的药品等的观点 考虑，作为优选的糖链，例如可以列举：和在人体内作为与蛋白结合的糖蛋 白而存在的糖链(例如FEBS LETTERS第50卷，No.3，Feb.1975中记载的 糖链)具有相同结构的糖链(所构成的糖的种类以及它们的结合方式相同的糖 链)或从其非还原末端失去了1个或多个糖的糖链。
作为N-结合型糖链的复合型糖链，已知有二分支型、三分支型、四分支 型的糖链等，对分支数没有特别限定。
在本发明的一个方案中，作为N-结合型糖链的复合型糖链，例如，作为 二分支型糖链，可以是用下述式(7)表示的糖链。
[化学式15]
(其中，R和R’各自独立地选自由下述式(8a)～式(8f)所表示的糖链所构 成的组)
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
[化合物21]
在本发明中，作为N-结合型糖链或复合型糖链，只要是具有作为这种糖 链而通常已知的糖链的基本骨架的糖链，即使其结合方式、是否存在岩藻糖、 是否存在对侧链取代基的修饰等不同，也均包括在内。
在本发明中，二唾液酸糖链是指具有作为N-结合型糖链、二分支型的复 合型糖链而已知的糖链的基本结构、且在二分支型的两个非还原末端均结合 有唾液酸的糖链。在本发明的一个方案中，作为二唾液酸糖链，优选使用在 上述式(7)的化合物中R和R’均为式(8a)所表示的糖链的化合物。即， 若用1个化学式来表示该化合物，则可以用下述式(9)来表示。
[化学式22]
上述化合物是唾液酸通过α2-6键结合的二唾液酸糖链的例子。在本发明 的一个方案中，还可以使用下述式(10)所表示的糖链，该糖链是唾液酸通 过α2-3键结合的二唾液酸糖链。
[化学式23]
在本发明中，去唾液酸糖链是指，具有作为N-结合型糖链、二分支型的 复合型糖链而已知的糖链的基本结构、且具有从上述的二唾液酸糖链中脱离 了二分支型的两个非还原末端的两个唾液酸的结构的糖链。在本发明的一个 方案中，作为去唾液酸糖链，优选使用在上述式(7)的化合物中R和R’均 为式(8d)所表示的糖链的化合物。
在本发明中，DiGlcNAc糖链是指，具有作为N-结合型糖链、二分支型 的复合型糖链而已知的糖链的基本结构、且具有从上述的二唾液酸糖链中脱 离了二分支型的两个非还原末端的两个唾液酸以及与该唾液酸的还原末端侧 结合的半乳糖的结构的糖链。在本发明的一个方案中，作为DiGlcNAc糖链， 优选使用在上述式(7)的化合物中R和R’均为式(8e)所表示的糖链的化 合物。
在本发明中，式(7)所表示的糖链除了包括上述具体例示的二唾液酸糖 链、去唾液酸糖链、DiGlcNAc糖链以外，还包括通过独立地选择R和R’来 表示的各种糖链。
在本发明的一个方案中，从提供在生物体内糖蛋白的识别性或血中滞留 性等方面发挥重要作用的糖链的活化体的观点考虑，糖链优选为二唾液酸糖 链。
在本发明的一个方案中，二唾液酸糖链的唾液酸中所含的羧酸在本发明 的制备方法的步骤中有可能与其他物质反应，因此优选先将二唾液酸糖链的 羧酸保护起来。
在本发明的一个方案中，作为对二唾液酸糖链的羧酸的保护，优选将羧 酸酯化或者酰胺化。
关于酯化，例如可以列举：苄基酯化、苯甲酰甲基酯化、甲基酯化、烯 丙基酯化等。
在本发明的一个方案中，作为通过酯化来保护二唾液酸糖链的羧酸的例 子，例如可以列举进行了苄酯化的二唾液酸糖链。在本发明中，还可以将这 样的糖链称作二苄基二唾液酸糖链或二Bn二唾液酸糖链。二苄基二唾液酸糖 链可以作为在上述式(7)中R和R’均由式(8b)表示的化合物来显示。
在本发明的一个方案中，作为通过酯化来保护二唾液酸糖链的羧酸的其 他例子，例如可以列举进行了苯甲酰甲基酯化的二唾液酸糖链。
作为将二唾液酸糖链的唾液酸中的羧基酯化的方法，例如可以通过使二 唾液酸糖链或其衍生物(二唾液酸糖链-Fmoc等)与苄基溴或苯甲酰甲基溴 等反应来制备。或者，可以通过与苄基重氮甲烷反应等方法来制备。另外， 甲基酯化、烯丙基酯化也可以根据目标酯化的结构，利用与苄基酯化或苯甲 酰甲基酯化相同的方法来制备。
在本发明的一个方案中，作为通过酰胺化来保护二唾液酸糖链的羧酸的 例子，例如，作为进行了酰胺化的二唾液酸糖链，可以列举在上述式(7)中 R和R’均用式(8c)表示的化合物。在本发明的一个方案中，作为酰胺化， 还可以是除上述式(8c)所表示的伯酰胺基以外、还将二唾液酸糖链的羧酸(用 -COOH显示的部分)转变成-CONR1R2的化合物(R1、R2表示烷基等能够形成 仲酰胺基或叔酰胺基的基团)。
作为将二唾液酸糖链的唾液酸中的羧基酰胺化的方法，例如可以通过使 将二唾液酸糖链或其衍生物(二唾液酸糖链-Fmoc等)酯化后的化合物与碳 酸氢铵水溶液、氨水等反应来制备。或者，还可以通过用包含伯胺或仲胺的 有机溶剂代替上述碳酸氢铵水溶液等进行反应，再将它们导入作为酰胺基的 方法等来制备。
关于唾液酸的羧酸的保护，作为现有技术，有人尝试着要使用通过酯化 等保护了唾液酸的糖链。但是，在采用以往使用的碳酸铵法来实施还原末端 的氨基化时，在该反应中作为保护基的酯基有一部分发生水解或酰胺化，因 此难以制备唾液酸的羧酸通过酯化而事先得到保护、且在糖链的还原末端具 有活化基团的二唾液酸糖链衍生物。相对于此，根据本发明的方法，不经过 利用碳酸铵进行的氨基化，只需在低温下、在碳酸氢钠水溶液中进行酶处理， 即可得到还原末端的氨基体，因此具有能够制备通过酯化保护了羧酸的二唾 液酸糖链衍生物的优点。
根据本发明的制备方法，能够提供β选择性优异的糖链衍生物的制备方 法。
在制备方法的发明中，在将制备方法中的产物视为糖链化合物的分子的 集合时，关于作为产物的糖链的还原末端的立体构型，β选择性优异是指β 端基异构体相对于为α端基异构体和β端基异构体的总和的糖链化合物总数 的比例(存在率)高。如果从相反的角度来表示，则还可以表述成：α端基 异构体相对于糖链化合物总数的存在率小。另外，还可以将β端基异构体的 存在率高说成β端基异构体的纯度高。
β选择性或α端基异构体和/或β端基异构体的存在率可以通过1H-NMR 分析作为产物的糖链化合物而求得。作为1H-NMR的分析条件，例如可以采 用本说明书的实施例中记载的条件。另外，本领域技术人员将会适当研究 1H-NMR的分析条件。除此之外，β选择性还可以通过HPLC等来求得。
在本发明的一个方案中，当称作具有高β选择性、或者β选择性优异时， 是指在通过制备方法得到的化合物中α端基异构体存在率在6％以下。在本发 明的一个方案中，α端基异构体存在率优选为2％以下，更优选为1％以下。
在本发明中，优选收率也高。在本发明的一个方案中，收率优选为80％ 以上，更优选为90％以上。
根据本发明的制备方法，由于β选择性高，所以可以说作为β端基异构 体的糖链衍生物的收率高。
在现有方法中，在利用β选择性低的制备方法得到糖链衍生物时，在能 够分离纯化α端基异构体和β端基异构体的情况下，认为也只能分离纯化β 端基异构体。但根据本发明的方法，与包括这样的分离纯化步骤的方法相比， 能够高收率地制备作为β端基异构体的糖链衍生物。
而且，在难以分离纯化糖链化合物的α端基异构体和β端基异构体的情 况下，根据本发明的方法，也能够制备β端基异构体率极高的糖链衍生物。
将本发明的具有活化基团的糖链化合物用作用于制备复合糖质的作为与 生物体内物质反应的糖链衍生物的中间体、即作为多个分子的集合体的中间 体组合物时，如果采用本发明的制备方法来制备，则能够以糖链的结构均一、 且β端基异构体率极高的组合物的形式得到。这里，在多个分子的集合体中， 糖链的结构均一是指在糖链衍生物之间进行比较时，构成糖链的各糖的种类、 结合顺序、以及糖间的结合方式相同，至少90％以上、优选95％以上、更优 选99％以上的糖链的结构是均一的。另外，β端基异构体率极高是指，β端基 异构体存在率为94％以上、优选为99％以上。糖链均一、且β端基异构体率 极高的糖链衍生物品质恒定，特别是在药品的制造或测定等领域是优选的。
即使不存在本说明书中没有明示公开的任意的构成要素，也能够实施在 本说明书中作为例示而公开的本发明的方案。
本说明书中特定的所有专利和其他出版物，通过参照而将其整体明确地 引用到本说明书中。提供这些文件只是为了公开本申请的申请日之前的相关 技术，不能解释成本发明人由于现有发明或任意的其他理由而自认不具有所 公开的现有权利。这些文件的内容所涉及的日期和表示所涉及的全部记述都 基于申请人能够获取的信息，并不构成任何的这些文件的日期和内容是正确 的自认。
本说明书中使用的用语用于说明特定的实施方式，并非想要限定本发明。
本说明书中使用的“含有”或“包含”的用语，除了在文脉上是明确不同的 理解以外，意思是指存在所记载的事项(部件、步骤、要素或数字等)，不排 除还存在除此以外的事项(部件、步骤、要素或数字等)。在可以排除存在上 述除此以外的事项(部件、步骤、要素或数字等)的情况下，可以采用“由… 构成(consist of)”的用语。用语“含有”或“包含”的概念包含用语“由…构成” 的概念。
只要没有不同的定义，则这里使用的所有用语(包括技术用语和科学用 语)均具有与本发明所属技术的技术人员广泛理解的意义相同的意义。这里 使用的用语只要没有明示不同的定义，就应该解释成具有与本说明书和相关 技术领域中的意义一致的意义，而不该解释成理想化或过度形式上的意义。
有时会参照模式图来说明本发明的实施方式，但当为模式图时，为了明 确地进行说明，有时会夸张地表述。
第1、第2等用语是用于表达各种要素，而不应理解为这些要素受到这 些用语的限定。这些用语只是用于区别一个要素和其他要素。例如，将第1 要素记作第2要素，同样将第2要素记作第1要素，这不会脱离本发明的范 围。
在本说明书中，只要没有特别明示，则用于显示成分含量或数值范围等 的数值应该理解为被用语“约”修饰的数值。例如，只要没有特别明示，则 “30mL”被理解为“约30mL”。
除了在文脉上明白地显示其他意义的情形以外，在本说明书和权利要求 内使用时，只要在技术上不矛盾，则以单数形式表示的各方案被理解为可以 是复数形式，反之亦然。
本说明书中引用的文献，其所有的公开内容均应视为引用到本说明书中， 本领域技术人员根据本说明书的文脉，在不脱离本发明的精神和范围的情况 下，将这些现有技术文献中的相关的公开内容作为本说明书的一部分进行引 用和理解。
下面，参照实施例来更详细地说明本发明。但本发明可以通过各种方案 来具体展示，不应解释为本发明受这里记载的实施例的限定。相关领域的技 术人员在不改变本发明的精神或范围的情况下，可以伴有各种改变、添加、 缺失、置换等来实施本发明。
实施例
在以下的实施例中，“二唾液酸糖链”化合物是在下述式(7)中R和R’均 使用了下述式(8a)所表示的糖链的化合物：
[化学式24]
[化学式25]
“去唾液酸糖链”化合物是在上述式(7)中R和R’均使用了下述式(8d) 所表示的糖链的化合物：
[化学式26]
“DiGlcNAc糖链”化合物是在上述式(7)中R和R’均使用了下述式(8e) 所表示的糖链的化合物：
[化学式27]
但是，除了使用这些糖链的情况以外，在使用本发明的其他糖链的情况 下，与下述实施例一样，通过根据需要增加适当的研究也可以进行制备，看 过本说明书的本领域技术人员将能理解这一点。另外，在下述实施例中， “-NH-AC-”是指“-NH-CO-CH2-”。
[参考例]
(参考例1)二唾液酸糖链天冬酰胺混合物的合成
在搅拌67mL乙醇(EtOH)时打入一个蛋黄。搅拌约5小时后进行过滤， 再用30mL EtOH清洗。向所得晶体中再次加入83mL EtOH，搅拌一夜后过滤， 接着，用30mL EtOH清洗。然后，将晶体干燥后，得到了约3g脱脂蛋黄。
将得到的脱脂蛋黄溶解于30mL磷酸缓冲液(pH＝7.0)中，之后加入10mg NaN3。再加入1.0g Orientase ONS(HBI公司制造)，在50℃下静置约24小时。 利用薄层色谱法(TLC)确认反应的结束，之后用硅藻土(Celite)(注册商标) (Celite公司)过滤反应液。通过浓缩来减少滤液后，通过凝胶过滤柱层析进行 纯化(Sephadex G-25，2.5×100cm，水)。回收并浓缩含有目标糖的组分，接着 进行冷冻干燥。
向得到的约430mg残余物中加入43mL Tris-HCl·氯化钙缓冲液(pH＝7.5) 和21mg叠氮化钠(NaN3)，使该残余物溶解。再加入43mg链丝菌蛋白酶E， 每12小时检查pH同时静置24小时。静置24小时后，向反应液中再次添加 21.5mg链丝菌蛋白酶E，再次边检查pH边反应约48小时。通过TLC确认 反应结束，之后进行硅藻土过滤。通过浓缩减少滤液，之后通过凝胶过滤柱 层析(Sephadex G-25，2.5×100cm，水)进行纯化。回收并浓缩含目标二唾液酸 糖链天冬酰胺的组分，然后进行冷冻干燥，得到包含二唾液酸糖链天冬酰胺 的混合物。
(参考例2)天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc的合成
将参考例1中得到的约120mg二唾液酸糖链天冬酰胺混合物溶解于 1.5mL水中，加入26mg碳酸氢钠。再加入溶解于二甲基甲酰胺(DMF，2.5mL) 的68mg Fmoc-Osu[N-(9-芴基甲氧羰基)氧基琥珀酰亚胺]，之后在室温下反应 2小时。通过TLC确认原料消失后，用蒸发仪进行浓缩。向残余物中加入15mL 水和25mL二乙醚，搅拌10分钟。接着，进行分液操作，之后用15mL二乙 醚清洗水层，再进行浓缩和冷冻干燥。然后，使用ODS柱(Wakogel 100C18) 对得到的残余物进行梯度纯化。回收包含糖链的组分，浓缩后进行冷冻干燥。 利用HPLC制备柱(YMC-Pack R&D ODS，D-ODS-5-A，20×250mm，AN/25 mM AcONH4缓冲液＝20/80，7.5ml/分钟)纯化得到的残余物。分离收集(aliquoted) 约15分钟后出来的主峰后进行浓缩。然后，利用ODS柱进行脱盐处理。冷 冻干燥后，得到了约13.3mg目标二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc，该化合物是 天冬酰胺的氨基氮被Fmoc基保护的糖链天冬酰胺化合物。
(参考例3)唾液酸中的羧酸被苄基酯化的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc的合成
使参考例2中得到的20mg(7.8μmol)二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc的冷 水溶液流过已冷却至4℃的Dowex-50W×8(H+)柱(φ0.5cm×5cm)，再将洗脱出 的水溶液冷冻干燥。
将得到的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶解于4℃的冷水中，向其中加 入2.5mg/1mL的Cs2CO3水溶液，调整水溶液的pH使其达到5～6。之后，将 该糖链水溶液冷冻干燥。将冷冻干燥后的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc样品 溶解于1.3mL干燥DMF中，加入5.1μL苄基溴，在氩气流下、在室温下搅拌 45小时。通过TCL确认反应结束后，将反应液加入到已冷却至0℃的10mL 二乙醚中，使目标物析出，对其用滤纸过滤。在剩下的目标物中加入蒸馏水， 使其以滤液的形式洗脱，之后接着对其进行减压浓缩。将所得残余物载入ODS 柱进行纯化，得到18.2mg(6.6μmol)作为目标化合物的、唾液酸中的羧酸已被 酯化的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc(收率为85％)。
(参考例4)唾液酸中的羧酸被苯甲酰甲基酯基保护的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc的合成
将参考例2中得到的153mg(59.8μmol)二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶 解于1.9mL DMF中，向其中加入51.9mg(598.0μmol)LiBr和119.0mg (598.0μmol)苯甲酰甲基溴，在37℃下搅拌18小时。通过HPLC确认反应结 束后，将反应溶液加入到20mL甲苯中，使糖链成分以浆液的形式析出。使 用离心分离机对该浆液进行离心操作，回收包含目标糖链的残余物。将所回 收的残余物载入ODS柱进行纯化，得到100.4mg(35.9μmol)作为目标化合 物的、唾液酸中的羧酸已被苯甲酰甲基酯化的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc (收率为60％)。
(参考例5)固定化GA酶的制备
通过PCR由革兰氏阴性杆菌脑膜败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)的基因组DNA获得编码糖基天冬酰胺酶(GA)的区。为了使 GA酶的纯化简便易行，在GA基因的C末端添加His×6标签基因，再使用 蛋白表达用载体pET24a(Novagen)构建融合了C末端His标签的GA表达载体。 利用融合了C末端His标签的GA表达载体来转化宿主大肠杆菌株 Rosetta2(DE3)pLysS(Novagen)。用2×YT培养基培养该菌，使目标蛋白在菌体 内作为可溶性蛋白来表达。对菌体进行超声波粉碎，洗脱目标蛋白，再使用 Ni2+柱(GE Healthcare)来纯化目标蛋白。
将纯化后的100mL蛋白溶液(蛋白浓度：17.5mg/mL，比活性：69.6单位 /mL)加入到事先用0.1M的磷酸缓冲液(pH＝7.4)清洗过的30g固相树脂 (TOYOPEARL AF-Tresyl)中，在20℃下搅拌4小时。4小时后进行过滤操作， 回收的树脂用1M的NaCl清洗。为了覆盖(cap)固相树脂上的残留活性基 团，加入0.5M的NaCl和200mL的0.5M的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)，在20℃ 下搅拌1小时。1小时后进行过滤，回收的固相树脂用1M的NaCl水溶液清 洗，接着用水清洗，得到了120mL在树脂表面固定有GA酶的固相树脂(含固 定化GA酶的固相树脂，以下，还称作固定化GA酶)(比活性为5.8单位/mL)。
[实施例]
(实施例1)在37℃的温度条件下进行步骤(a)的、唾液酸中的羧酸已被苄基酯化的二唾液酸糖链-NH-AcBr的合成
将参考例3中得到的1.0g(0.4mmol)唾液酸中的羧酸已被苄基酯化的二唾 液酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶解于10.0mL二甲基甲酰胺(DMF)中，之后加入 144.2μL(1.5mmol)哌啶，在室温下反应。30分钟后，在HPLC分析(下述分析 条件(1))中，根据20分钟时洗脱的原料峰的消失、并确认到13分钟时洗脱的 新峰，确认反应结束。这里，认为被确认为新峰的化合物是唾液酸中的羧酸 已被苄基酯化的二唾液酸糖链天冬酰胺。在确认反应结束后，将反应溶液加 入到50mL二氯甲烷(DCM)中，使糖链化合物沉淀。为了溶解沉淀在DCM中 的糖链化合物，加入10mL 4.6％的溴乙酸水溶液，将DCM分相除去，水相 用DCM清洗后回收。在回收的水相中加入874.0mg NaHCO3和约10mL参考 例5中制备的固定化GA酶，在37℃的温度条件下搅拌。反应开始1小时后， 在HPLC分析(分析条件(2))中，根据14分钟时洗脱的原料峰的消失、并确认 到16分钟时洗脱的新峰，确认反应结束，之后通过过滤除去固定化酶。这里， 认为被确认为新峰的化合物是唾液酸中的羧酸已被苄基酯化的二唾液酸糖链 -NH2。在得到的滤液中加入537.6mg(6.4mmol)NaHCO3，之后加入溶解于 10mL乙腈中的1.1mL(12.7mmol)溴乙酰溴，在冰冷却下搅拌。在HPLC分析 (分析条件(2))中，根据16分钟时洗脱的原料峰的消失、并确认到27分钟时 洗脱的新峰，确认反应结束。需要说明的是，与溴乙酰溴的反应在1小时以 内结束。这里，认为被确认为新峰的化合物是唾液酸中的羧酸已被苄基酯化 的二唾液酸糖链-NH-AcBr。在确认反应结束后，用30mL 5％的HBr水溶液稀 释反应溶液，使用ODS载体(Nacalaitesque，ODS-140C18OPN，以水、5％乙 腈水溶液、50％乙腈水溶液的顺序置换溶剂来洗脱糖链)进行纯化，从而以89％ 的收率得到了产量为816.0mg的进行了苄基酯化的二唾液酸糖链溴乙酰胺。 所得糖链的分析结果为：α异构体的存在率为5.1％。需要说明的是，α异构 体存在率是在下述1H-NMR条件下使用1H-NMR进行分析，根据1H-NMR中 的面积百分率算出的。需要说明的是，在实施例和比较例中，关于α异构体 存在率的分析方法与以下相同。
HPLC分析条件(1)：(UG-120250×4.6mm展开溶剂A：25mM的氨醋酸 盐水溶液，B：乙腈梯度A 90％0.70mL/分钟→A 40％0.70ml/分钟，30分钟)
HPLC分析条件(2)：(UG-120250×4.6mm展开溶剂25mM的氨醋酸盐 水溶液：乙腈＝86:14，0.70ml/分钟，0.70ml/分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准：丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.42(m,10H,Ar),5.68(d,GlcNAc1-H-1(α异构体))5.31(d,1H,Bn-CH2), 5.24(d,1H,Bn-CH2),5.05(s,1H,Man4-H-1),5.00(d,1H,GlcNAc1-H-1(β异构 体)),4.87(s,1H,Man4’-H-1),4.53(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.26(d,2H, Gal6,6’-H-1),4.18(bs,1H,Man3-H-2),4.12(bd,1H,Man4-H-2),4.04(bd,1H, Man4’-H-2),2.61(m,2H,NeuAc7,7’-H-3eq),2.01,1.97,1.95,1.94(m,18H,Ac x 6),1.77(dd,2H,NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS：C100H152BrN7O62[M+Na]+的计算值2544.804,实测值 2544.470
(实施例2)在4℃以下的温度条件下进行步骤(a)的、唾液酸的羧酸已被苄基酯化的二唾液酸糖链-NH-AcBr的合成
将参考例3中得到的29.8g(10.9mmol)唾液酸中的羧酸已被苄基酯化的 二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶解于297.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入 4.3mL(43.4mmol)哌啶，在室温下反应。30分钟后，在HPLC分析(分析条件 (1))中，根据20分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到13分钟时洗脱的新 峰，确认反应结束。这里，认为被确认为新峰的化合物是唾液酸中的羧酸已 被苄基酯化的二唾液酸糖链天冬酰胺。在确认反应结束后，将该反应溶液加 入到900mL DCM中，使糖链沉淀。为了溶解沉淀在DCM中的糖链，加入 312mL 4.6％的溴乙酸水溶液，将DCM分相除去，用DCM清洗水相后回收。 向回收的水相中加入26.0g NaHCO3，在4℃下冷却1小时。1小时后，加入 约100mL的固定化GA酶，在4℃的温度条件下搅拌。反应开始1小时后， 在HPLC分析(分析条件(2))中根据14分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认 到16分钟时洗脱的新峰，确认反应结束，之后通过过滤除去固定化酶。这里， 认为被确认为新峰的化合物是唾液酸中的羧酸已被苄基酯化的二唾液酸糖链 -NH2。在得到的滤液中加入63.8g(760.0mmol)NaHCO3后，再加入溶解于 110mL乙腈中的32.9mL(380.0mmol)溴乙酰溴，在冰冷却下搅拌。在HPLC 分析(分析条件(2))中，根据16分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到27 分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。需要说明的是，该与溴乙酰溴的反应在 1小时以内结束。这里，认为被确认为新峰的化合物是唾液酸的羧酸已被苄 基酯化的二唾液酸糖链-NH-AcBr。在确认反应结束后，用450mL 5％的HBr 水溶液稀释反应液，使用ODS载体(Nacalaitesque，ODS-140C18OPN，以水、 5％乙腈水溶液、50％乙腈水溶液的顺序置换溶剂来洗脱糖链)进行纯化，由 此以97％的收率得到了26.6g苄基酯化的二唾液酸糖链溴乙酰胺(以下，还称 作“二Bn二唾液酸糖链-NH-AcBr”)。所得糖链的分析结果为：其α异构体 存在率为0.8％以下(均以n＝2进行实验)。
HPLC分析条件(1)：(UG-120250×4.6mm展开溶剂A：25mM的氨醋酸 盐水溶液，B：乙腈梯度A 90％0.70mL/分钟→A 40％0.70ml/分钟，30分钟)
HPLC分析条件(2)：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂25mM的氨醋酸盐 水溶液：乙腈＝86:14，0.70ml/分钟，0.70ml/分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.39(m,10H,Ar),5.29(d,1H,Bn-CH2),5.22(d,1H,Bn-CH2),5.03(s,1H, Man4-H-1),4.98(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H,Man4’-H-1),4.68(s,1H, Man3-H-1),4.51(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.24(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.16(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),2.59(m,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),1.98,1.95,1.92,1.91(m,18H,Ac x 6),1.75(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C100H152BrN7O62[M+Na]+的计算值2544.804,实测值 2545.509
(实施例3)二唾液酸糖链天冬酰胺的合成
将参考例2中得到的15.5g(6.1mmol)二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶解 于100mL水中，加入125mL 25％的氨水，在37℃下搅拌。4小时后，在HPLC 分析中根据7分钟时洗脱的原料峰的消失，确认反应结束。在确认反应结束 后，通过过滤除去反应中产生的不溶物，再将滤液冷冻干燥，从而以99％的 收率得到了产量为14.1g的二唾液酸糖链天冬酰胺。
HPLC分析条件：(UG-120(250×4.6mm)，展开溶剂：25mM的氨醋酸盐 水溶液：乙腈＝80:20,0.70mL/分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.04(s,1H,Man4-H-1),4.98(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.86(s,1H, Man4’-H-1),4.52(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.35(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.16(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.03(bd,1H,Man4’-H-2),2.83(dd,1H, Asn(CH2)),2.74(dd,1H,Asn(CH2)),2.58(bdd,2H,NeuAc7,7’-H-3eq),1.99,1.98, 1.97,1.94,1.92(m,12H,Ac x 3),1.63(dd,2H,NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C88H141BrN8Na3O64[M+Na]+的计算值2425.762,实测值 2425.480
(实施例4)二唾液酸糖链-NH-AcBr的合成
将实施例3中合成的0.9g(0.4mmol)二唾液酸糖链天冬酰胺溶解于10mL 1M的NaHCO3水溶液中，在4℃下冷却1小时。1小时后，加入约4mL的固 定化GA酶，在4℃的温度条件下搅拌。反应开始1小时后，在HPLC分析 中，根据13分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到16分钟时洗脱的新峰， 确认反应结束，之后通过过滤除去固定化酶。这里，认为被确认为新峰的化 合物是二唾液酸糖链-NH2。在得到的滤液中加入3.1g(37.0mmol)NaHCO3， 之后加入1.6mL(18.5mmol)溶解于5.6mL二氯甲烷(DCM)中的溴乙酰溴，在 冰冷却下搅拌。在HPLC分析中，根据16分钟时洗脱的原料峰的消失、以及 确认到20分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。需要说明的是，该与溴乙酰溴 的反应在1小时以内结束。这里，认为被确认为新峰的化合物是二唾液酸糖 链-NH-AcBr。接着，通过分离除去DCM相，通过凝胶过滤柱层析(Sephadex G25,2.3cm×100cm，水，流速为1.0ml/分钟)纯化水相。将含糖链的组分浓缩 后，进行冷冻干燥，以46％的收率得到了产量为0.4g的二唾液酸糖链溴乙酰 胺(二唾液酸糖链-NH-AcBr)。所得糖链的分析结果为：其α异构体存在率为 0.2％。
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.04(s,1H,Man4-H-1),4.98(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.85(s,1H, Man4’-H-1),4.52(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.35(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.16(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),2.57(bdd,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),1.99,1.98,1.93,1.91(m,12H,Ac x 3),1.65(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C86H138BrN7Na2O62[M+Na]+的计算值2408.674,实测值 2408.620
(实施例5)去唾液酸糖链天冬酰胺的合成
将7.2g(3.6mmol)的去唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc(Glytech.Inc.制造)溶 解于36mL水中，加入60mL 25％的氨水，在37℃下搅拌。4小时后，在HPLC 分析中，根据12分钟时洗脱的原料峰的消失，确认反应结束。在确认反应结 束后，通过过滤除去反应中产生的不溶物，将滤液冷冻干燥，从而以97％的 收率得到了产量为6.2g的去唾液酸糖链天冬酰胺。
HPLC分析条件：(Kromasil(250×4.6mm),展开溶剂：25mM的氨醋酸盐 水溶液：乙腈＝80:20，0.70mL/分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.04(s,1H,Man4-H-1),4.99(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H, Man4’-H-1),4.52(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.39(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.17(bs, 1H,Man3-H-2),4.11(bd,1H,Man4-H-2),4.03(bd,1H,Man4’-H-2),2.81(dd,1H, Asn(CH2)),2.70(dd,1H,Asn(CH2)),2.00,1.97,1.96,1.93(m,12H,Ac x 3)
MALDI-MS:C66H110N6O48[M+Na]+的计算值1777.625,实测值 1777.675
(实施例6)去唾液酸糖链-NH-AcBr的合成
将实施例5中合成的2.5g(1.4mmol)去唾液酸糖链天冬酰胺溶解于 31.5mL 0.5M的NaHCO3水溶液中，在4℃下冷却1小时。1小时后，加入约 12mL的固定化GA酶，在4℃下搅拌。反应开始1小时后，在HPLC分析中， 根据13分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到21分钟时洗脱的新峰，确 认反应结束，之后通过过滤除去固定化酶。在得到的滤液中加入8.5g (98.0mmol)NaHCO3后，加入4.4mL(49.0mmol)溶解于16.7mL DCM中的溴 乙酰溴，在冰冷却下搅拌。在HPLC分析中，根据21分钟时洗脱的原料峰的 消失、以及确认到24分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。需要说明的是，该 与溴乙酰溴的反应在1小时以内结束。在确认反应结束后，通过分离除去DCM 相，利用凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，2.3cm×100cm，水，流速为1.0ml/ 分钟)纯化水相。浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以80％的收率得到了产 量为2.0g的去唾液酸糖链溴乙酰胺(去唾液酸糖链-NH-AcBr)。所得糖链的分 析结果为：其α异构体存在率为1.0％。该1H-NMR谱见图4。如图4所示， 根据本发明的方法，除了作为主产物的β端基异构体以外，几乎完全确认不 到来自原料的杂质等的信号。
HPLC分析条件：(Hydrosphere 250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋 酸盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 100％0.70ml/分钟→A 90％0.70ml/分钟，30 分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.03(s,1H,Man4-H-1),4.97(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H, Man4’-H-1),4.51(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.38(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.17(bs, 1H,Man3-H-2),4.11(bd,1H,Man4-H-2),4.03(bd,1H,Man4’-H-2),1.99,1.97, 1.96,1.92(m,18H,Ac×6)
MALDI-MS：C64H106BrN5O46[M+Na]+的计算值1782.519,实测值 1782.462
(实施例7)DiGlcNAc糖链天冬酰胺的合成
将1.0g(0.6mmol)DiGlcNAc糖链天冬酰胺-Fmoc(Glytech.Inc.制造) 溶解于5.1mL水中，加入8.5mL 25％的氨水，在37℃下搅拌。4小时后，在 HPLC分析中，根据17分钟时洗脱的原料峰的消失，确认反应结束。在确认 反应结束后，通过过滤除去反应中产生的不溶物，将滤液冷冻干燥，从而以 95％的收率得到了产量为0.8g的DiGlcNAc糖链天冬酰胺。
HPLC分析条件：(UG-120(250×4.6mm)，展开溶剂：25mM的氨醋酸盐 水溶液：乙腈＝78:22，0.70mL/分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.03(s,1H,Man4-H-1),4.99(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.53(d,1H, GlcNAc2-H-1),4.47(d,2H,GlcNAc5,5’-H-1),4.16(bs,1H,Man3-H-2),4.10(bd, 1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),2.83(dd,1H,Asn(CH2)),2.75(dd,1H, Asn(CH2)),1.99,1.97,1.93(s,12H,Ac×4)
MALDI-MS:C54H90N6O38[M+Na]+的计算值1453.519,实测值1453.384
(实施例8)DiGlcNAc糖链-NH-AcBr的合成
将实施例7中合成的0.7g(0.5mmol)DiGlcNAc糖链天冬酰胺溶解于 17.4mL 0.5M的NaHCO3水溶液中，在4℃下冷却1小时。1小时后，加入约 5mL的固定化GA酶，在4℃下搅拌。反应开始1小时后，在HPLC分析中， 根据12分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到21分钟时洗脱的新峰，确 认反应结束，之后通过过滤除去固定化酶。向所得滤液中加入2.0g(33.4mmol) NaHCO3，之后加入1.1mL(16.7mmol)溶解于16.7mL DCM中的溴乙酰溴，在 冰冷却下搅拌。在HPLC分析中，根据21分钟时洗脱的原料峰的消失、以及 确认到29分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。需要说明的是，该与溴乙酰溴 的反应在1小时以内结束。在确认反应结束后，通过分离除去DCM相，利 用凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，2.3cm×100cm，水，流速为1.0ml/分钟)纯 化水相。浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以88％的收率得到了产量为0.6g 的DiGlcNAc糖链溴乙酰胺。所得糖链化合物的分析结果为：其α异构体存 在率为1.0％以下(均以n＝2进行实验)。.
HPLC分析条件：(Hydrosphere 250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋 酸盐水水溶液，B：乙腈,梯度：A 100％0.70ml/分钟→A 90％0.70ml/分钟， 30分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.03(s,1H,Man4-H-1),4.99(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.83(s,1H, Man4’-H-1),4.53(d,1H,GlcNAc2-H-1),4.47(d,2H,GlcNAc5,5’-H-1),4.17(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),1.99,1.97, 1.92(s,18H,Ac×6)
MALDI-MS:C52H86BrN5O36[M+Na]+的计算值1458.413,实测值 1458.575
(实施例9)唾液酸中的羧酸发生了酰胺化的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc的合成
将参考例4中合成的3.0g(1.1mmol)唾液酸中的羧酸被苯甲酰甲基酯基 保护的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶解于30mL饱和碳酸氢铵水溶液中， 搅拌3小时。通过离心操作除去反应中产生的沉淀，上清液通过凝胶过滤柱 层析(Sephadex G25，2.3cm×100cm，水，流速为1.0ml/分钟)进行脱盐，收集 含糖链的组分，进行浓缩、冷冻干燥。将冷冻干燥后的糖链化合物溶解于60mL 水中，在冰冷却下加入900mg NaHCO3和1.8g溶解于30mL DMF中的 Fmoc-OSu，在室温下搅拌。反应开始12小时后，将反应溶液加入到500mL 丙酮中，使糖链沉淀。通过离心操作回收沉淀，在常温、常压下进行干燥。 干燥后，将得到的残余物溶解于水中，通过HPLC进行纯化，以40.0％的收 率得到了产量为1.1g的唾液酸中的羧酸发生了酰胺化(将“-COOH”变成 “-CONH2”)的二唾液酸糖链天冬酰胺-Fmoc。
(Hipersep LC200 Kromasil 13C18200×250mm，展开溶剂：25mM的 NH4OAc水溶液：乙腈＝85:15，1.883L/分钟)
MALDI-MS:C103H156N10O64[M+Na]+的计算值2579.916,实测值 2580.103
需要说明的是，实施例9中使用的、唾液酸中的羧酸被苯甲酰甲基酯基 保护时的唾液酸部分的化学结构可以用下式表示(下式只表示被保护的唾液 酸部分。)。
[化学式28]
(实施例10)唾液酸中的羧酸被酰胺化的二唾液酸糖链-NH-AcBr的合成
将实施例9中得到的1.0g(0.4mmol)唾液酸中的羧酸被酰胺化的二唾液 酸糖链天冬酰胺-Fmoc溶解于15mL 25％的氨水中，在37℃下搅拌。4小时后， 在HPLC分析中，根据11分钟时洗脱的原料峰的消失，确认反应结束。通过 过滤除去反应中产生的不溶物，将滤液冷冻干燥。冷冻干燥后，将其溶解于 0.5M的NaHCO3水溶液中，在4℃下冷却1小时。1小时后，加入约5.0mL 的固定化GA酶，在4℃下搅拌。反应开始1小时后，通过HPLC确认反应 结束，通过过滤除去固定化酶。向得到的滤液中加入3.6g(41.6mmol)NaHCO3， 之后加入1.8mL(20.8mmol)溶解于6.5mL DCM中的溴乙酰溴，在冰冷却下搅 拌。需要说明的是。该与溴乙酰溴的反应在1小时以内结束。确认反应结束 后，通过分离除去DCM相，利用凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，2.3cm×100cm， 水，流速为1.0ml/分钟)纯化水相，进行浓缩、冷冻干燥，以52％的收率得到 了产量为0.5g的唾液酸中的羧酸发生了酰胺化的二唾液酸糖链溴乙酰胺(将 唾液酸中的羧酸进行了酰胺化的二唾液酸糖链-NH-AcBr)。所得糖链的分析结 果为：其α异构体存在率为0.8％。
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.07(s,1H,Man4-H-1),5.01(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.88(s,1H, Man4’-H-1),4.55(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.39(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.20(bs, 1H,Man3-H-2),4.14(bd,1H,Man4-H-2),4.06(bd,1H,Man4’-H-2),2.62((bdd, 2H,NeuAc7,7’-H-3eq),2.04,2.04,2.00,1.98,1.95(m,18H,Ac x 6),1.78(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C86H142BrN9O60[M+Na]+的计算值2362.742,实测值 2362.484
接下来，以实施例2中合成的苄基酯化的二唾液酸糖链溴乙酰胺(二Bn 二唾液酸糖链-NH-AcBr)和实施例4中合成的二唾液酸糖链-NH-AcBr为原料， 进行各种衍生物的合成。
(实施例11)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcCl的合成
将实施例2中合成的30.8mg(12.2μmol)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcBr溶 解于950μL水中，加入60.0mg(1.0mmol)氯化钠(NaCl)，在室温下搅拌。 96小时后，在HPLC分析中，根据28分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确 认到26分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束后，通过凝胶过 滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为0.7mL/分钟)纯化反应溶 液。浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以74％的收率得到了产量为22.3g 的二Bn-二唾液酸-AcCl。
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.40(m,10H,Ar),5.28(d,1H,Bn-CH2),5.21(d,1H,Bn-CH2),5.02(s,1H, Man4-H-1),4.99(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H,Man4’-H-1),4.67(s,1H, Man3-H-1),4.51(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.23(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.15(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),2.59(m,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),1.98,1.94,1.92,1.91(m,18H,Ac x 6),1.75(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C100H152ClN7O62[M+Na]+的计算值2502.729,实测值 2501.034
(实施例12)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcI的合成
将实施例2中合成的30.9mg(12.2μmol)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcBr溶 解于900μL水中，加入150.0mg(1.0mmol)碘化钠(NaI)，在室温下搅拌。2 小时后，在HPLC分析中，根据28分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到 31分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束后，通过凝胶过滤柱 层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为0.7mL/分钟)纯化反应溶液。 浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以91％的收率得到了产量为28.5mg的二 Bn-二唾液酸糖链-NH-AcI。
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.41(m,10H,Ar),5.29(d,1H,Bn-CH2),5.22(d,1H,Bn-CH2),5.04(s,1H, Man4-H-1),4.96(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.85(s,1H,Man4’-H-1),4.68(s,1H, Man3-H-1),4.51(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.24(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.16(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),2.59(m,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),1.99,1.95,1.93,(m,18H,Ac x 6),1.75(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:Calcd for C100H152ClN7O62[M+Na]+2592.790,实测值 2592.929
(实施例13)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcN3
将实施例2中合成的51.9mg(20.6μmol)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcBr溶 解于1mL DMF中，加入64.4mg(990.4μmol)叠氮化钠(NaN3)，在37℃下搅 拌。6小时后，在HPLC分析中，根据26分钟时洗脱的原料峰的消失、以及 确认到28分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束后，将反应溶 液加入到4mL乙酸乙酯(EtOAc)中，使糖链成分沉淀。通过使用离心分离器 进行的离心操作回收沉淀物，通过HPLC分离收集回收的残余物，以69％的 收率得到了产量为35.3mg的二Bn二唾液酸糖链-NH-AcN3。
HPLC分析条件：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂：水：乙腈＝86:14， 0.70mL/分钟)
HPLC分离收集条件：(UG-120250×20mm，展开溶剂：水：乙腈＝86:14, 7.0mL/分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.40(m,10H,Ar),5.28(d,1H,Bn-CH2),5.21(d,1H,Bn-CH2),5.03(s,1H, Man4-H-1),4.99(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H,Man4’-H-1),4.67(s,1H, Man3-H-1),4.51(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.23(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.15(bs, 1H,Man3-H-2),4.10(bd,1H,Man4-H-2),4.02(bd,1H,Man4’-H-2),2.58(m,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),1.98,1.94,1.92,1.91(m,18H,Ac x 6),1.79(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C100H152N10O62[M+Na]+的计算值2507.895,实测值 2507.702
(实施例14)二唾液酸糖链-NH-AcNHNH2
将实施例4中合成的90.9mg(38.8μmol)二唾液酸糖链-AcBr溶解于0.1M 的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中，加入10μL一水合肼，在室温下搅拌。7小时后， 在HPLC分析中，根据12分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到10分钟 时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束后，加入20μL乙酸进行中和， 通过凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为0.7mL/分钟) 进行纯化。浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以93％的收率得到了产量为 82.5mg的二唾液酸糖链-NH-AcNHNH2。
HPLC分析条件：(Hydrosphere 250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋 酸盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 98％0.70ml/分钟→A 65％0.70ml/分钟，30 分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ5.06(s,1H,Man4-H-1),5.03(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.88(s,1H, Man4’-H-1),4.54(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),4.38(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.18(bs, 1H,Man3-H-2),4.12(bd,1H,Man4-H-2),4.05(bd,1H,Man4’-H-2),2.60(m,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),2.01,2.00,1.96,1.93(m,18H,Ac x 6),1.66(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
ESI-MS:计算的C86H143N9O62[M+2H]2+1147.916,[M+3H]3+765.610,实 测值1147.930,765.620
(实施例15)二Bn二唾液酸糖链-NH-Ac-SH
将实施例2中合成的97.2mg(38.5μmol)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcBr溶 解于2mL 0.1M的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中，加入5μL(61.4μmol)硫代乙酸， 在室温下搅拌。1小时后，在HPLC分析中，根据23分钟时洗脱的原料峰的 消失、以及确认到24分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。接着，向反应溶液 中加入162.0mg(986.7μmol)2-巯基乙磺酸钠(MESNA)，在室温下搅拌。44 小时后，在HPLC分析中，根据24分钟时洗脱的原料峰的减弱、以及确认到 22分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束后，通过HPLC进行 分离收集，利用凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为 0.4mL/分钟)进行含目标糖链的组分的脱盐，浓缩含糖链的组分并进行冷冻干 燥，从而以50％的收率得到了产量为48mg的二Bn二唾液酸糖链-NH-Ac-SH。
HPLC分析条件：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋酸 盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 90％0.70mL/分钟→A 70％0.70mL/分钟，30 分钟)
HPLC分离收集条件：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨 醋酸盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 90％0.70mL/分钟→A 70％7.00mL/分钟， 30分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.40(m,10H,Ar),5.29(d,1H,Bn-CH2),5.22(d,1H,Bn-CH2),5.03(s,1H, Man4-H-1),4.96(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H,Man4’-H-1),4.51(m,3H, GlcNAc2,5,5’-H-1),4.24(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.15(bs,1H,Man3-H-2),4.09(bd, 1H,Man4-H-2),4.01(bd,1H,Man4’-H-2),3.13(dd,2H,-COCH2SH),2.58(m,2H, NeuAc7,7’-H-3eq),1.98,1.94,1.92,1.91(m,18H,Ac x 6),1.75(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C100H153N7O62S[M+Na]+的计算值2498.865,实测值 2499.051
(实施例16)二Bn二唾液酸糖链-NH-Ac-SCH2CH2NH2
将实施例2中合成的106.4mg(42.2μmol)二Bn二唾液酸糖链-NH-AcBr 溶解于含有61mM的半胱胺和20mM的三-2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)的4mL 0.1M的磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)中，在室温下搅拌。20小时后，在HPLC分 析中，根据23分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到19分钟时洗脱的新 峰，确认反应结束。在确认反应结束后，通过HPLC进行分离收集，利用凝 胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为0.4mL/分钟)进行含 目标糖链的组分的脱盐，浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，从而以59％的 收率得到了产量为63mg的二Bn二唾液酸糖链-NH-Ac-SCH2CH2NH2。
HPLC分析条件：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋酸 盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 90％0.70mL/分钟→A 70％0.70mL/分钟，30 分钟)
HPLC分离收集条件：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂：25mM的氨醋酸 盐水溶液：乙腈＝85:15，7.00mL/分钟，30分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.40(m,10H,Ar),5.29(d,1H,Bn-CH2),5.22(d,1H,Bn-CH2),5.03(s,1H, Man4-H-1),4.98(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H,Man4’-H-1),4.50(m,3H, GlcNAc2,5,5’-H-1),4.24(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.15(bs,1H,Man3-H-2),4.09(bd, 1H,Man4-H-2),4.01(bd,1H,Man4’-H-2),3.23(bs,2H,-COCH2S-),3.12(m,2H, -SCH2CH2NH2-),2.78(m,2H,-SCH2CH2NH2-),2.58(m,2H,NeuAc7,7’-H-3eq), 1.98,1.94,1.92,1.91(m,18H,Ac x 6),1.75(dd,2H,NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C102H158N8O62S[M+Na]+的计算值2541.907,实测值 2542.020
(实施例17)二Bn二唾液酸糖链-NH-Ac-CH(OMe)2
将参考例3的109.6mg(40.0μmol)进行了苄基酯化的二唾液酸糖链天冬 酰胺-Fmoc溶解于1.1mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入16μL(160.1μmol)哌啶， 在室温下反应。30分钟后，在HPLC分析(分析条件(1))中，根据20分钟时洗 脱的原料峰的消失、以及确认到13分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确 认反应结束后，将反应溶液加入到10.0mL乙酸乙酯中，使糖链沉淀。通过离 心操作回收沉淀的糖链成分。在常温、常压下干燥所得的残余物，之后将其 溶解于3mL 1M的乙酸钠水溶液(pH＝5.0)中，通过凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为0.4mL/分钟)进行纯化，浓缩含糖链的组分并 进行冷冻干燥，从而以100％的收率得到产量为100.8mg的二Bn二唾液酸糖 链-Asn。将得到的二Bn二唾液酸糖链-Asn溶解于1mL 0.5M的NaHCO3水溶 液中，在冰冷下冷却1小时。1小时后，加入约500μL的固定化GA酶，在 冰冷下搅拌。反应开始1.5小时后，在HPLC分析(分析条件(2))中，根据11 分钟时洗脱的原料峰的消失、以及确认到13分钟时洗脱的新峰，确认反应结 束，之后通过过滤除去固定化酶。在得到的滤液中加入38.0mg(452.4μmol) NaHCO3，之后加入200.5mg(867.2μmol)溶解于1.5mL DMF中的3,3-二甲氧 基丙酸-羟基琥珀酰亚胺酯，在冰冷下搅拌。30分钟后升至室温，继续搅拌。 20小时后，在HPLC分析(分析条件(2))中，根据13分钟时洗脱的原料峰的消 失、以及确认到20分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束后， 通过凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×45cm，水，流速为0.4mL/分钟) 进行纯化。浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以79％的收率得到了产量为 79mg的二Bn二唾液酸糖链-NH-Ac-CH(OMe)2。所得糖链的分析结果为：其 α异构体存在率为0.1％以下。
HPLC分析条件(1)：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋 酸盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 90％0.70mL/分钟→A 40％0.70ml/分钟，30 分钟)
HPLC分析条件(2)：(UG-120250×4.6mm，展开溶剂A：25mM的氨醋 酸盐水溶液，B：乙腈，梯度：A 90％0.70mL/分钟→A 70％0.70ml/分钟，30 分钟)
1H-NMR(400MHz,D2O,外部标准:丙酮(1H:2.61ppm)
δ7.40(m,10H,Ar),5.28(d,1H,Bn-CH2),5.22(d,1H,Bn-CH2),5.03(s,1H, Man4-H-1),4.97(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.84(s,1H,Man4’-H-1),4.50(m,3H, GlcNAc2,5,5’-H-1),4.23(d,2H,Gal6,6’-H-1),4.15(bs,1H,Man3-H-2),4.09(bd, 1H,Man4-H-2),4.01(bd,1H,Man4’-H-2),2.58(m,2H,NeuAc7,7’-H-3eq), 2.55(m,2H,CH2(OMe)2),1.98,1.94,1.92(m,18H,Ac x 6),1.75(dd,2H, NeuAc7,7’-H-3ax)
MALDI-MS:C103H159N7O64[M+Na]+的计算值2540.930,实测值 2541.123
[比较例]
(比较例1)利用现有方法制备活化的糖链
将100mg的唾液酸糖肽(SGP)溶解于pH7.0的50mM磷酸缓冲液中，加 入1U的PNGase F(BioLabs Inc.)。在37℃下培养24小时，通过TLC确认反 应结束后，进行冷冻干燥。通过凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×30cm， 水，流速为1.0mL/分钟)纯化冷冻干燥品，得到了产量为74mg的二唾液酸糖 链-OH。
将得到的10mg二唾液酸糖链-OH溶解于饱和碳酸氢铵水溶液中，制备 成30mM。在室温下反应，始终保持在饱和状态。反应7天，通过TLC确认 反应基本结束后，将反应溶液直接冷冻干燥。为了除去碳酸氢铵，重复冷冻 干燥3次，得到了9mg含胺化二唾液酸糖链的粉末。
将得到的5mg含胺化二唾液酸糖链的粉末溶解于100μL水中，加入2mg 碳酸氢钠。向其中加入8.0μL(92.5μmol)溶解于100μL二氯甲烷(DCM)中的溴 乙酰溴，在冰冷下搅拌。1.5小时后，通过TLC确认反应结束，用碳酸氢钠 中和，过滤，之后进行减压浓缩。接着，通过凝胶过滤柱层析(Sephadex G25， 1.5cm×30cm，水，流速为1.0mL/分钟)进行纯化。浓缩含糖链的组分并进行 冷冻干燥，以77％的收率得到了产量为4mg的二唾液酸糖链溴乙酰胺。所得 糖链的分析结果为：其α异构体存在率为9.1％。需要说明的是，在该反应中， 虽然推测还残留有原料，但难以算出原料的残留量。
(比较例2)利用现有方法制备活化的糖链
将500.0mg(304.6μmol)去唾液酸糖链-OH(Glytech.Inc.制造)溶解于5mL 水中，加入碳酸氢铵使形成饱和水溶液，在30℃下搅拌。反应6天，通过TLC 确认反应基本结束后，通过将反应溶液浓缩、共沸、冷冻干燥，除去剩余的 碳酸氢铵。冷冻干燥后，将得到的含胺化去唾液酸糖链的250mg(152.1μmol) 粉末溶解于2mL水中，加入269.6mg(3.2mmol)NaHCO3，在冰冷下搅拌。20 分钟后，加入溶解于1.5mL DCM中的140.2μL(1.6mmol)溴乙酰溴，在冰冷 下搅拌。2小时后，在HPLC分析中，根据大约14分钟时洗脱的原料峰的消 失、以及确认到大约21分钟时洗脱的新峰，确认反应结束。在确认反应结束 后，通过分离除去DCM相，利用凝胶过滤柱层析(Sephadex G25，1.5cm×30cm， 水，流速为0.4mL/分钟)只纯化水层。浓缩含糖链的组分并进行冷冻干燥，以 88％的收率得到了产量为235.0mg的含去唾液酸糖链溴乙酰胺的混合物。根 据1H-NMR分析所得混合物，结果作为目标糖链的去唾液酸糖链溴乙酰胺占 68.5％，其α异构体存在率为6.5％，掺杂约25％的原料。该1H-NMR谱见图 3。如图3所示，当采用现有方法时，除了确认到来自主产物β端基异构体的 信号以外，还确认到了来自α端基异构体和原料的信号。
如上所述，按照现有方法进行合成时，虽然确认到了原料的残留，但如 在实施例6中已经说明的那样，在本发明的合成方法中，没有确认到原料的 掺杂(参照图4)。
通过该对比显示：与现有方法相比，本发明的方法是在短时间内不仅β 选择性优异、就连收率也优异的制备方法。
(比较例3)利用现有方法制备二Bn二唾液酸糖链-NH2
将98.7mg(41.1μmol)二Bn二唾液酸糖链-OH(Glytech.Inc.制造)溶解于 1.0mL水中，加入碳酸氢铵使形成饱和水溶液，在30℃下搅拌。通过TLC 追踪该反应，确认22小时后制造了多个产物。通过浓缩、共沸、冷冻干燥除 去剩余的碳酸氢铵。冷冻干燥后，通过NMR和ESI-MS能够确认苄酯的脱保 护。根据NMR的积分强度比，暗示有约30％的苄酯基被脱保护。由以上的 结果认为：难以采用现有方法来高效率地制备二Bn二唾液酸-NH2。因此， 认为也难以将其作为中间体来合成苄酯化的二唾液酸糖链溴乙酰胺。
ESI-MS：
二Bn二唾液酸-OH；C98H150N6O62[M+2H]+的计算值1202.44,实测值 1201.96
一Bn二唾液酸-OH；C91H144N6O62[M+2H]+的计算值1157.42,实测值 1156.95
机译： 活化糖链衍生物的制备方法及活化糖链衍生物
机译： 三支糖链天冬酰胺衍生物，糖链天冬酰胺，糖链及其制备方法
机译： 三种分支的糖链天冬酰胺衍生物，糖链天冬酰胺，糖链及其制备方法
