基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法

摘要

一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，属于河口生态需水量计算领域，选择当地一种分布范围较广的贝类生物作为实验对象，按照当地实际盐度范围，设定不同盐度区域，以河口正常盐度为对照盐度区域；分别向设定的不同盐度区域投放等量的贝类，测定不同时间点所取样品的抗氧化系统酶活力值，筛选对盐度变化有显著响应的酶活指标；然后，利用新型耦合生物标志物响应法将优选的抗氧化酶活力值标准化后进行耦合，确定出现显著性差异的盐度区域为生物的响应阈值范围；最后，利用生物的响应阈值范围与正常盐度浓度的差值进行生物生态需水量的估算。本发明选择贝类这种游动性不强的物种，降低干扰风险。同时，将研究水平推进到分子水平，提高了河口生态需水量计算的准确性。

说明书

技术领域

本发明属于河口生态需水量计算领域，具体涉及一种基于贝类耦合生物标 志物响应的河口生态需水量估算方法。

背景技术

河口是海陆交界、咸淡水交汇的地带，其特有的自然环境特征和生态调节 功能在维持全球生态平衡方面具有十分重要的地位。河口地区的盐度受上游河 流径流量等的影响经常处于波动状态，在正常生态状况下河口生物能够通过自 身的调控作用适应这种盐度变化。然而，近年来，河口地带由于气候因素、环 境因素以及各种人为因素等的影响，尤其是在干旱季节径流量逐年减少甚至出 现断流，河口盐度急剧升高，河口生态环境的自我调节功能越来越弱，生物多 样性也逐年降低，这使得河口生态与环境的负面效应日益凸显。目前生态环境 比较脆弱的河口地区很多，包括黄河流域、海河流域等的河口地带，几乎每年 都会出现断流现象，盐度等水质指标发生较大波动，盐度是影响生物生长、发 育、繁殖的重要指标，它的变化对河口地区生物的分布和生存起到至关重要的 作用，甚至会破坏该地区的整个生态系统的平衡。因此，选择合适的河口生物 作为研究对象，计算维持其正常生活状态下的生态需水量显得尤为重要，同时 也为河流水资源生态调度的合理配置以及维护河口生态环境生物资源多样性提 供了技术支撑和科学依据。

河口生态需水是在一定生态目标下维持河口相应时空范围内生态系统健康 所需要的水量。多年来，国内外学者对河口生态需水进行了大量研究，却因为 生态需水计算涉及的研究点太多而未形成统一的计算方法体系。本发明主要是 选取其中总生态需水量中的一个研究点(河口生物的生态需水量)进行研究， 目前对河口生物的生态需水量主要是通过分析生物种群数量以及分布等对盐 度、温度等的适应能力来计算，这种计算方式精确度往往不高。当生物受到一 定的环境胁迫后，首先在自身抗氧化系统各种抗氧化酶的调控作用下进行一系 列的生理生化反应来适应外界的变化，当自我调控能力不足以应对外界的胁迫 时，便会产生逃逸、死亡等一系列的外在行为，因而及早的发现生物的受胁迫 状态，及时的为其改善生存环境显得尤为重要。目前已经有大量研究利用抗氧 化系统酶活变化来检测海洋或河流污染物对生物的影响。

“耦合生物标志物响应法”(IBRv2)由Wilfried Sanchez等(Wilfried  Sanchez,Thierry Burgeot,Jean-Marc Porcher.A novel“Integrated  Biomarker Response”calculation based on reference deviation concept. Environ Sci Pollut Res,2012)研究而成，在此之前也有人用Beliaeff等 (Beliaeff B,Burgeot T.Integrated biomarker response:A useful tool  for ecological risk assessment.Environmental Toxicology and Chemistry, 2002,21(6):1316-1322)所研究的耦合生物标志物响应法(IBR)进行生态环境 污染评估，然而IBR在使用中存在一定的局限性。IBRv2相对于IBR的适用范围 更广，计算方式更加便捷，而且在其星状图中可以清楚的显示胁迫因子对单一 指标的抑制或者诱导作用，能够更好的展示耦合效果。利用IBRv2获得耦合数 据后，对数据进行显著差异性分析，获得盐度胁迫阈值范围。然后，利用所确 定的盐度阈值范围与实际环境盐度的差值来估算生物的生态需水量，该方法在 河口生物生态需水量计算方面尚未见到报道。

目前关于生物生态需水研究，主要是针对鱼类的种群数量和分布变化从群 体水平来计算生物的生态需水量，但此方法精确度不高。另外，鱼类的游动性 也增加了研究的干扰风险，使研究的真实性降低。所以，对河口贝类生物盐度 胁迫阈值范围的确定以及贝类生物生态需水量的估算方法的建立是本发明的关 键所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口 生态需水量估算方法。

本发明选择贝类这种游动性不强的物种，降低干扰风险。同时，将研究水 平推进到分子水平，提高了河口生态需水量计算的准确性。

本发明是由如下技术方案实现的：

一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，它的步骤： 首先，选择当地一种分布范围较广的贝类生物作为实验对象，按照当地实际盐 度范围，设定不同盐度区域，以河口正常盐度为对照盐度区域；分别向设定的 盐度区域投放等量的贝类，在实验过程中设置不同的取样时间点，测定不同时 间点所取样品的抗氧化系统酶活力值，研究酶活指标与盐度因子之间的时间-效 应关系，利用SPASS中的一维方差分析法进行显著差异性分析，筛选对盐度变 化有显著响应的酶活指标；然后，利用新型耦合生物标志物响应法将优选的抗 氧化酶活力值标准化后耦合，获得新型耦合生物标志物响应，建立新型耦合生 物标志物响应与盐度因子之间的剂量-效应关系模型，再次进行显著差异性分 析，确定出现显著性差异的盐度区域为生物的响应阈值范围；最后，利用生物 的响应阈值范围与正常盐度浓度的差值进行贝类生态需水量的估算。

一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，具体步骤 包括如下：

⑴实验对象的选择:从正常盐度区域选取当地分布广泛、容易采集、体 积适中的一种贝类生物，采集后用于后续实验；

⑵试验区域的选择：按照当地实际盐度范围，设定不同盐度区域，以河 口正常盐度为对照盐度区域；分别向设定的盐度区域投放等量的贝类，整个实 验进行14d，分别在第0、1、2、4、8、15d取样用于后续酶活测定实验；

⑶抗氧化系统酶活测定：测定不同时间点取样贝类的超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶、谷胱甘肽-S转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶(、过氧化物酶、7-乙氧 基-3-同吩嗯唑酮·脱乙基酶酶活性；

⑷筛选抗氧化系统敏感酶指标：用SPASSR中的ANOVA进行显著差异性 分析，选取不同盐度下活力有显著差异性变化的酶进行酶活分析；

⑸绘制IBRv2与盐度的剂量-效应关系，获得生物的响应阈值范围，

a首先将数据计算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均_值X_i；

b降低数值差异性：Y_i＝log(X_i/X₀)，X₀为相应取样时间点下每一个生物标 志物所有试验水平的X_i的平均值；

c数据标准化：X标准化得到Y，Y_i＝(X-u)/s，其中u和s是计算每一个生 物标志物所有试验水平的总体平均值和标准偏差；

d确定一个生物标志物偏差指数A＝Z_i-Z₀；Z₀为相应取样时间点下每一个生 物标志物所有试验水平的Z_i的平均值；

e将所有偏差指数相加即为新型耦合生物标志物响应值，也即IBRv2， $\mathrm{IBRv}2=\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\left|A_i\right|;$

绘制IBRv2与盐度的剂量-效应关系，出现显著性差异的盐度区域为生物的 响应阈值范围，由此判断，高于这个盐度范围便会对生物构成破坏效应；

⑹生物生态需水量估算公式：IF＝|Sa-Tv|V＝|Sa–Tv₁|V～|Sa–Tv₂| V；其中Tv₁～Tv₂为响应阈值范围，Sa为河口实际盐度，V为整个目标区域的 水量，IF为生物生态需水量。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明是建立在以河口贝类生物为研究对象，以生物体抗氧化系统酶活变 化为研究指标的基础之上，以盐度指标表征河口栖息地质量，利用新型耦合生 物标志物响应法将各个指标整合到一起，从分子、细胞水平上更精细地计算河 口生物的生态需水量，这对于河口的科学管理以及保障河口生态安全具有重要 意义。

本发明首先在计算方法上有所改进，本发明技术方案选用向河口高盐水域 和正常水域移植样本的方法，克服了野外取样的背景差异；选取的检测对象为 同一批次、规格大小一致的双壳贝类，具有样本规格一致、背景水平相似、环 境特征明晰等优势。

其次，在监测指标上，选择双壳贝类抗氧化系统中的敏感酶从分子水平上 确定盐度对贝类的生物响应阈值，使研究结果更为准确、可靠；目前，酶活测 定方法已经成熟，可以运用市场化的试剂盒进行规范化操作，测定结果稳定性 好、可重复性高、可比性强。

再次，在计算方法上，采用新型的耦合生物标志物响应法，该方法计算方 法十分简洁、容易操作，系统误差小。

附图说明

图1黄河口四角蛤蜊采样站位图，其中z0为对照站位，z1、z2、z3、z4和 z5是分别代表盐度20～22、22～24、24～26、26～28和28～30的区域。

图2四角蛤蜊消化腺生物标志物对不同盐度的响应指数(IBRv2)，可以看出 贝类IBR与盐度梯度之间呈现显著的相关性。其中，a表示呈显著差异(P＜0.05)， b表示呈极显著差异(P＜0.01)。可以看出z4站位的IBRv2与对照呈现显著性 差异，因而将四角蛤蜊的生物响应阈值范围定为盐度26～28。

具体实施方式：

以下仅示例性描述本发明，以明确该发明能够重复实现并可达到突出的实质 性效果，但不构成对本发明的限制。

本发明提供一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法， 包括如下步骤：

(1)贝类采集:根据调查河口地区的常年水质指标，选择盐度正常较稳定 的区域采集一定量的贝类。选择贝类应当具备分布广泛、大小适中、易于采取 的特点。首先，对采集到的贝类进行简单的冲洗，然后选取规格大小一致、活 动自如、外壳完好无损的贝类用于后续试验。

(2)盐度区域设置：按照河口调查区域实际盐度范围，设定不同盐度区域， 以河口盐度较稳定的区域为对照盐度区域。分别向设定的盐度区域投放等量的 贝类，整个实验进行14d，分别在第0、1、2、4、8、15d取回一定量投放的贝 类，冰上取其消化腺，然后立即放于液氮中研磨(如果条件不允许，也可以用 组织匀浆法，即加入9倍体积预冷的生理盐水，冰浴匀浆后于4℃条件下离心， 3000r/min,10min，然后取上清用预冷的生理盐水配成10％组织匀浆液)， 然后分装样品，冻存于-80℃冰箱中用于后续实验。

(3)抗氧化酶活性的测定：将液氮研磨好的消化腺迅速称取适量，然后加入 9倍体积的生理盐水进行酶活测定，如果用的是均浆液则可以直接用于GSH-Px、 GST、SOD、CAT、EROD和POD活性的测定。肝脏中蛋白含量的测定采用考马斯亮 蓝法。肝脏GSH-Px、GST、SOD、CAT、EROD和POD活性的测定均采用南京建成 生物公司提供的检测试剂盒，仪器为BIO-RAD美国伯乐imark酶标仪，相应操 作按照说明书进行。其中GSH-Px活性定义每毫克蛋白质每分钟扣除非酶反应的 作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活性单位；GST活性定义每 毫克组织蛋白在37℃反应1分钟扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓度降低 1μmol/L为一个酶活性单位(U/mg-prot)；SOD活性定义每毫克组织蛋白在1mL 反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个酶活性单位(U/mg-prot)。 CAT活性定义每毫克组织蛋白每秒钟分解1pmol的H₂O₂的量为一个酶活性单位 (U/mg-prot)。POD活性定义25℃条件下每毫克组织蛋白每分钟催化产生1μg 的底物的酶量为一个酶活性单位(U/mg-prot)。POD活性定义37℃条件下每毫 克组织蛋白每分钟催化产生1μg的底物的酶量为一个酶活性单位(U/mg-prot)。 筛选抗氧化系统敏感酶指标：用SPASSR软件中的ANOVA方法进行显著差异性分 析，选取不同盐度下活力随时间呈现显著差异性变化的酶进行后续酶活分析；

(4)生物标志物整体响应与不同盐度的剂量-效应关系：首先，根据数据计 算每个试验水平生物标志物3次重复样的平均值X_i，为了降低数值差异性，进 一步对数据进行log化处理，即Y_i＝log(X_i/X₀)，X₀为相应取样时间点下每一 个生物标志物所有试验水平的X_i的平均值；然后，将数据进行标准化处理：X 标准化得到Y，Y_i＝(X-u)/s，其中u和s是计算每一个生物标志物所有试验水 平的总体平均值和标准偏差；其次，确定一个生物标志物偏差指数A＝Z_i-Z₀； Z₀为相应取样时间点下每一个生物标志物所有试验水平的Zi的平均值；再次，将 所有偏差指数相加即为新型耦合生物标志物响应指数(IBRv2)，最后，绘制IBRv2与盐度的剂量-效应关系，结果呈现出显著的线性关系；出现 显著性差异的盐度为生物的响应阈值范围，由此判断，高于这个盐度阈值范围 便会对生物构成破坏生理效应。

(5)生物生态需水量的估算：利用上述方法确定的盐度阈值范围与正常环境 盐度差值来计算目标区域内的河口生物的生物生态需水量，具体算法表现为： IF＝|Sa-Tv|V＝|Sa–Tv₁|V～|Sa–Tv₂|V；其中Tv为响应阈值范围(Tv₁～ Tv₂)，Sa为河口实际盐度，V整个目标区域的水量，IF生物生态需水量。

下面本发明将结合实施例作进一步描述：

在本发明中，优选采用目标区域中的当地贝类，自身对河口环境具有一定 的适应性，可更加准确响应环境盐度变化，降低系统误差，可以使评估结果更 为准确。以下做详细描述。

实施例1

一种基于贝类耦合生物标志物响应的河口生态需水量估算方法，采用以下 工艺步骤：

实验受试生物四角蛤蜊取自处于黄河入海口的滩涂地区(山东省垦利县)， 采样点的水温为19.23℃，盐度为20.02。投放前先将蛤蜊简单冲洗一下，选取 大小规格一致(壳长：2.4～2.6cm；壳高：1.68～1.49cm；壳宽：2.1～2.3cm， 带壳重：5.2～6.1g)、结构完好、活动自如的四角蛤蜊1200个。

黄河入海口在干旱季节遇到入海径流量减少后，盐度急剧升高，根据该海 域的水动力状况，在盐度波动区域(56Km³)内设置5个站位(z1、z2、z3、z4 和z5，见图1)，站位盐度范围分别为20～22、22～24、24～26、26～28和28～ 30，同时根据河口盐度常年较稳定的海域设定对照站位z0(盐度20～22)，迅 速移植四角蛤蜊至z0、z1、z2、z3、z4和z5站位，每个站位投放200个，分 别在第0、1、2、4、8、15d取回四角蛤蜊，存放到液氮罐中保存(-80℃)， 立即返回实验室测定。取出消化腺，于液氮中研磨后称重，然后4℃条件下离心 (3000r/min,10min)，取上清用生理盐水配成体积比10％组织匀浆，直接用 于GST、SOD、EROD和POD活性的测定，然后分别稀释成体积比5％组织匀浆用于 GSH-Px和CAT活性的测定；体积比1％组织匀浆用于蛋白含量的测定。四角蛤蜊 消化腺GSH-Px、GST、SOD、CAT、EROD和POD活性的测定均采用南京建成生物 公司提供的检测试剂盒，仪器为BIO-RAD美国伯乐imark酶标仪，相应操作按 照说明书进行。用SPASSR软件中的ANOVA方法进行显著差异性分析，结果发现 EROD和POD的酶活在整个实验过程中都没有呈现显著性差异，因而我们最终选 定GSH-Px、GST、SOD和CAT用于后续酶活分析；然后将处理第15d的GSH-Px、 GST、SOD和CAT酶活进行耦合形成生物标志物响应值(IBRv2)，再次运用SPSS 软件进行方差分析(ANOVA)，并用均值多重比较分析法(LSD法)分析对照组(z0) 与盐度波动站位(z1，z2，….zt)贝类IBRv2的差异显著性(图2)，确定最 先出现显著性差异的盐度26～28为该贝类的盐度生物响应阈值范围，超过这个 盐度范围贝类的就会发生显著破坏性的生理反应，这一结果对于河口生态状态 评价会起到一定的预警作用。最后，根据调查区域面积为56Km³，正常盐度为20， 计算本发明中的生物生态需水量为IF＝|26-20|×56～|28-20|×56Km³＝336～448Km³， 这一数据将为黄河口水资源生态调度的合理配置提供了基础资料。因此利用本 发明规格大小一致的四角蛤蜊为指示生物，通过抗氧化酶活性的测定以及新型 耦合生物标志物响应(IBRv2)的计算方法的运用，本发明可以作为一种河口贝 类生物的生态需水量的估算方法。