一种玉米籽粒中伏马毒素的快速测定方法

摘要

本发明公开了一种玉米籽粒中伏马毒素的快速测定方法，属于分析检测技术领域。它包括以下步骤：(1)玉米籽粒中伏马毒素的提取；(2)提取液的净化；(3)玉米中伏马毒素的分析测定。本发明可以更快速、更充分的提取玉米中的伏马毒素，以更准确地测出伏马毒素的含量，对于提高玉米质量安全具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体的说是一种玉米籽粒中伏马毒素的快速测定方法。

背景技术

伏马毒素是一种由镰孢菌种(主要包括层出镰刀菌、拟轮生镰刀菌等，我国的伏马毒素主要由拟轮生镰刀菌产生)产生的次级代谢产物，此类代谢产物易溶于水。目前发现的伏马毒素主要有11种，包括FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FC1、FC2等，其中FB1的危害最大。研究发现，玉米中天然存在的伏马毒素主要为FB1、FB2、FB3。伏马毒素在较低浓度范围内便会危害作物生长。国际癌症研究中心把伏马毒素划分为人类可能的致癌物。1990年，Sydenham EW等发现伏马毒素可致癌，并可能与人类的食道癌有密切关系。虽然伏马毒素在人体内吸收较少，但它可以通过影响鞘脂类物质的代谢，进而干扰神经酰胺合成，从而致癌。孙桂菊等调查了伏马毒素与人类食道癌和肝癌的关系，结果表明食道癌和肝癌的发生与伏马毒素有关系。伏马毒素具有致病性和神经毒性，主要表现为可引起马大脑白质软化、运动失调、猪肺水肿、肝脏损伤等，甚至死亡。近年来研究发现，伏马毒素还可导致儿童发育不良。

目前，我国对伏马毒素限量标准还未做出明确规定，美国FDA规定玉米中伏马毒素最大限量值为2mg/kg，瑞士规定玉米中伏马毒素最大限量值为1mg/kg。伏马毒素在较低浓度范围内便会对人体健康存在很大威胁，为此，FAO/WHO提出伏马毒素对人体的安全限量为每天摄入量按人体体重计算FB1、FB2、FB3量不超过2μg/kg。被污染的玉米中伏马毒素的含量一般低于几十mg/kg，属于痕量组分，所以需采用仪器分析等适用于微量、痕量组分的方法来定量。

痕量分析一般被用于测定微克数量级甚至更低的物质。鉴于色谱分析可以很好地从复杂的混合物中将被测痕量组分分离出来，广泛的用于痕量分析。

目前，伏马毒素的检测方法主要是化学检测方法和免疫学方法。免疫学方法主要是酶联免疫吸附测定法；化学检测方法包括薄层色谱、液相色谱、气相色谱和液相色谱-质谱联用技术等。现在研究较多的是液相色谱和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术。高效液相色谱法(HPLC)可以实现对伏马毒素的同时定性与定量，但是用HPLC检测时需要衍生，这就很难实现多种真菌毒素的同时检测。LC-MS方法具有高灵敏度、高分辨率等优点，且检测时不需要衍生，可以实现伏马毒素的准确定性与定量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米籽粒中伏马毒素的快速测定方法，是基于QuEChERS提取并利用UPLC/Q-TOF快速筛查确证玉米籽粒中伏马毒素。本发明操作简单、快速且免去了 免疫亲和柱或固相萃取柱净化步骤，不仅简化了实验，而且降低了成本。此外，本发明可以更快速、更充分的提取玉米中的伏马毒素，以更准确地测出三种伏马毒素含量，对于提高玉米质量安全具有重要意义。

本发明所采用的技术方案为：

一种玉米籽粒中伏马毒素的快速测定方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)玉米籽粒中伏马毒素的提取

称取磨好的玉米样品于离心管中，加入提取液，涡旋振荡，混匀后超声，然后离心，

所述提取液为乙腈、水、冰乙酸体积比为84：15：1的混合液；

(2)玉米籽粒中伏马毒素提取液的净化

取上清液至净化管中，加入C18，涡旋振荡后再离心5min，收集全部上清液，在45℃下氮吹至近干，残余物用甲醇/水溶液复溶，然后过0.22μm两相滤膜，即得待测溶液；

所述甲醇/水溶液中甲醇与水的体积比为5：5；

(3)检测：待步骤(2)得到的待测溶液用UPLC/Q–TOF进行测定。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中离心转速为3000-7000r/min。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中离心转速为5000r/min。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中涡旋振荡时间为0.5-5min。

优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中涡旋振荡时间为1min。

优选的，包括以下步骤：

(1)玉米籽粒中伏马毒素的提取

准确称取2.0000g磨好的玉米样品于50ml离心管中，加入20ml提取液，涡旋振荡1min，混匀后超声20min，然后在5000r/min的转速下离心5min，

(2)玉米籽粒中伏马毒素提取液的净化

取2ml上清液至净化管中，加入30mg C18，涡旋振荡1min后在5000r/min的转速下离心5min，收集全部上清液，在45℃下氮吹至近干，残余物用2ml甲醇/水溶液复溶，然后过0.22μm两相滤膜，即得待测溶液；

(3)检测：待步骤(2)得到的待测溶液用UPLC/Q–TOF进行测定。

优选的，所述步骤(3)的检测条件为：

色谱条件： 

色谱柱：Thermo Hypersll GOLD C18，1.9μm,2.1×100mm；流动相：A相为含0.1％甲酸的1mM乙酸铵，B相为甲醇，梯度洗脱；流速：0.3ml/min；进样量：2μL；柱温：35℃；

梯度洗脱条件如下：

0～1min，A相为98％；

1～2min，A相线性下降为80％；

2～4.5min，A相为80％，保持2.5min；

4.5～8min，A相线性下降为2％；

8～10min，A相2％，保持2min；

10～10.5min，A相线性上升为98％；

10.5～12min，A相为98％，保持1.5min，平衡色谱柱。

质谱条件： 

离子源：ESI；检测模式：正离子[M+H]⁺；锥孔电压(Cone energy)：40kv；离子源温度(Source temperature)：120℃；脱溶剂温度(Desolvation gas temperature)：400℃；扫描范围M/Z：1001000；碰撞能量(Collision energy)：4ev；锥孔气流量(Cone gas flow)：50L/h；脱溶剂气流量(Desolvation gas flow)：700L/h。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用基于QuECHERS提取方法结合液相色谱-飞行时间质谱建立了玉米中的伏马毒素(FB1、FB2、FB3)检测方法，本方法操作简单、快速且免去了免疫亲和柱或固相萃取柱净化步骤，不仅简化了实验，而且降低了成本。实现了玉米中伏马毒素的快速定性及定量，对于提高玉米质量安全具有重要意义。

(2)利用C18粉末作为净化剂，可有效去除基质中的淀粉、脂肪类和糖类等物质，免去了传统的较繁琐的净化步骤，使定性更准确。

(3)采用乙腈/水/冰乙酸＝84/15/1乙腈水溶液作为伏马毒素的提取溶液，以涡旋和超声的混合提取方式，可以更充分、更快速地提取玉米中的伏马毒素。

(4)利用UPLC/Q-TOF精确质量数可以精确到千分之一的性能使得伏马毒素定性更准确。

(5)采用Thermo Hypersll GOLD C18(1.9μm,2.1×100mm)色谱柱可使同分异构体FB2和FB3分开，使定量更加准确。

附图说明

附图1为C18和PSA处理后的回收率对比；

附图2为不同剂量C18处理后的回收率对比；

附图3为玉米中伏马毒素(FB1、FB2、FB3)的MS全扫描图；

附图4为玉米中伏马毒素(FB1、FB2、FB3)的选择离子流图；

附图5为玉米中FB₁的选择离子流图和质谱图；

附图6为玉米中FB₃的选择离子流图和质谱图；

附图7为玉米中FB₂的选择离子流图和质谱图；

附图8为阳性玉米样品的选择离子流图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

1仪器与样品 

1.1仪器：

超高效液相色谱系统(ACQUITY Ultra Performance LC Waters公司)配以质谱(G2-Q TOF飞行时间质谱仪Waters公司)、N-EVAPTM112氮吹仪、Thermo Hypersll GOLD C18(1.9μm,2.1×100mm)色谱柱。

1.2样品：玉米 

2方法与结果 

2.1玉米籽粒中伏马毒素的提取

准确称取2.0000g(精确至0.0001g)磨好的样品于50ml离心管中。加入20ml提取液(乙腈+水+冰乙酸＝84+15+1)，剧烈涡旋振荡1min，混匀后超声20min。然后在5000r/min的转速下离心5min。

高体积比的乙腈/水混合溶剂适合提取大多数的真菌毒素，研究表明，当溶剂为乙腈/水且体积比在80/20～90/10时，多种毒素的提取效率均达到较高水平。伏马毒素是一种酸性毒素，在提取液中加入少量的冰乙酸可显著提高伏马毒素的提取效率。

2.2玉米籽粒中伏马毒素提取液的净化

取2ml上清液至净化管中(含30mg C18)，剧烈涡旋振荡1min后在5000r/min的转速下离心5min，收集全部上清液，在45℃下氮吹至近干。残余物用2ml甲醇/水(5/5，V/V)溶液复溶，然后过0.22μm两相滤膜，即得待测溶液；

为了降低基质效应，延长色谱柱寿命，需要采用一定的净化手段去除色素、脂质、蛋白、淀粉等杂质，目前净化方法主要为免疫亲和柱净化、固相萃取净化和凝胶渗透(GPC)净化等方法，这些方法不仅费时而且成本较高，这就亟需建立一种新的净化方法。

近年来，QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)技术(QuEChERS方法的步骤可以简单归纳为：(1)样品粉碎；(2)单一溶剂乙腈提取分离；(3)加入MgSO₄等盐类除水；(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附剂除杂；(5)上清液进行GC-MS、LC-MS检测)作为一项新兴的高效提取净化技术，广泛应用于农药残留的分析检测中，其高效、简便 和绿色的技术理念正逐渐在生物毒素等分析检测领域得到应用。QuEChERS方法中较常用到的净化剂主要有PSA和C18等。用PSA对“2.1”中提取液净化时发现，伏马毒素回收率很低(如图1)，这可能是因为PSA上的氨基与伏马毒素上的羧基发生反应，若用PSA作吸附剂还需解吸伏马毒素。C18可以有效去除基质中的淀粉、脂肪类和糖类等物质，对待研究的3种伏马毒素也没有明显的吸附作用。因此，实验选择用C18作为净化剂。

2.3玉米中伏马毒素的测定

FB₁、FB₂、FB₃的分离与鉴定应用UPLC/Q–TOF。采用Thermo Hypersll GOLD C18(1.9μm,2.1×100mm)色谱柱，柱温35℃；流动相A：1mM乙酸铵(含0.1％甲酸)，流动相B：甲醇，梯度洗脱，流速为0.3mL/min，梯度洗脱条件为：

0～1min，A相为98％；

1～2min，A相线性下降为80％；

2～4.5min，A相为80％，保持2.5min；

4.5～8min，A相线性下降为2％；

8～10min，A相2％，保持2min；

10～10.5min，A相线性上升为98％；

10.5～12min，A相为98％，保持1.5min，平衡色谱柱；

进样体积2μL。

离子源：ESI；检测模式：正离子[M+H]⁺；锥孔电压(Cone energy)：40kv；离子源温度(Source temperature)：120℃；脱溶剂温度(Desolvation gas temperature)：400℃；扫描范围M/Z：100/1000；碰撞能量(Collision energy)：4ev；锥孔气流量(Cone gas flow)：50L/h；脱溶剂气流量(Desolvation gas flow)：700L/h。采用全扫描对三种伏马毒素进行测定。

按照2.3中实验条件，注入2.2中所述待测溶液，进行UPLC/Q–TOF分析测定。

2.4玉米籽粒中伏马毒素的全扫描

对玉米提取液进行MS全扫描，如图3所示。提取出质谱选择离子共3种(如图4)，分别为M/Z＝722.3963(8.66min)、706.4014(8.86min)、706.4014(9.03min)。

FB₁最先出峰，保留时间为8.66min(如图5)，其次是FB₃，保留时间为8.86min(如图7)，最后出峰的是FB₂，保留时间为9.03min(如图6)。

2.5玉米籽粒中伏马毒素的回收率及基质效应实验

取阴性玉米样品，加入三个水平的伏马毒素混合标准溶液，按上述实验方法进行处理。每个添加水平做5次重复，计算回收率和相对标准偏差。结果(表2)显示，平均回收率在80.8％～99.0％，相对标准偏差在1.99％～3.54％。表明有良好的重复性和精密度。

取不含有目标真菌毒素的玉米样品，完全按照上述前处理方法处理后作为空白基质。向空白基质中加入一定浓度的标准溶液，然后上机检测，制作基质匹配标准曲线。本研究采用SSE(Signal Suppression/Enhancement)来评价基质效应。

结果显示，SSE在110％左右，表明没有明显的基质效应。表明采用该方法筛查确证玉米中的伏马毒素是能够满足日常需求的。

表1伏马毒素结构式及母离子理论值

表2FB₁、FB₂、FB₃的方法回收率和精密度(n＝5)