一种达沙替尼中间体的分析检测方法

摘要

本发明公开了一种达沙替尼中间体的分析检测方法，用于达沙替尼中间体的质量控制，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（C18，4.6×250mm，5μm），以缓冲盐溶液、乙腈和三氟乙酸混合体系为流动相，以检测波长为320nm，柱温为20～30℃，进行高效液相色谱法分析检测。本发明的分析检测方法选用普通的色谱柱及液相色谱系统，价格低廉，实用性高，可以有效的将达沙替尼中间体及其杂质分开，而且该方法具有分析时间短，灵敏度高，线性关系良好，操作简单，重复性及耐用性好，结果稳定可靠的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，尤其是一种达沙替尼中间体的分析 检测方法。

背景技术

达沙替尼是一种口服酪氨酸激酶抑制剂，于2006年经FDA批准，用于治疗 由BCR-ABL激酶突变引起的白血病，其疗效优于伊马替尼，且未发现耐药性。

N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[(6-氯-2-甲基-4-嘧啶基)氨基]-5-噻唑甲酰胺是达沙 替尼的重要中间体，其化学式为C₁₆H₁₃Cl₂N₅OS，结构式为：

达沙替尼中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也 直接影响着终产品的质量，Alban J.Allentoff等人的文献（Synthesis of¹⁴C-labeled  and¹³C-,¹⁵N-labeled dasatinib and its piperazine N-dealkyl metabolite，J.Label  Compd.Radiopharm2008,51：41–47）中公开了该中间体的一种HPLC分析方法， 但该方法较为繁琐，分析时间长，且使用的色谱柱价格较贵，在研发及生产中普 遍应用的实用性低，不适合推广使用，所以建立一种成本低廉、使用普通色谱柱 及液相系统且操作简单，但稳定有效的分析检测方法对达沙替尼中间体进行分析 检测是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用普通色谱柱及液相系统且操作简单，但稳定 有效的达沙替尼中间体的高效液相色谱分析检测方法，用于达沙替尼中间体的质 量控制。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：

一种达沙替尼中间体的分析检测方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的 色谱柱（C18，4.6×250mm，5μm），以缓冲盐溶液、乙腈和三氟乙酸混合体系为 流动相，以检测波长为320nm，柱温为20～30℃，进行高效液相色谱法分析检测。

所述的缓冲盐溶液选自醋酸钠溶液或醋酸铵溶液，浓度为0.01～0.05mol/L， 优选为醋酸钠溶液。

所述流动相中缓冲盐溶液：乙腈的体积比为45～65:55～35，三氟乙酸体积为 前两者体积和的0.2%。

进一步地，流动相中缓冲盐溶液：乙腈：三氟乙酸的体积比优选为 50～60:50～40，最优选为55:45，三氟乙酸体积为前两者体积和的0.2%。

所述的柱温优选为25℃。

本发明所述的分析检测方法，可通过以下步骤实现：

A、取达沙替尼中间体适量，加流动相溶解，配制成每1mL含达沙替尼中 间体0.04～0.32mg的样品溶液；

B、设置流动相流速为0.5～1.2mL/min，检测波长320nm，柱温为20～30℃；

C、取A的样品溶液10μL注入液相色谱仪，完成达沙替尼中间体的分析检 测；

其中：

高效液相色谱仪：Agilent1100液相色谱系统，DAD检测器；

色谱柱：Boston Boschrom ODS C18（4.6×250mm，5μm）；

流动相：0.05mol/L的醋酸钠溶液：乙腈=55:45，三氟乙酸体积为前两者体 积和的0.2%；

检测波长：320nm；

柱温：25℃；

流速：1.0mL/min。

与现有技术相比，本发明涉及的分析检测方法，选用普通的色谱柱及液相色 谱系统，价格低廉，实用性高，可以有效的将达沙替尼中间体及其杂质分开，所 得峰形对称性较好，分析时间短，主峰保留时间在12.7min左右（Alban J.Allentoff 等人的文献中的方法在15.1min左右），而且本发明分析方法及仪器的灵敏度高 （检测限为0.4859ng），操作简单，重复性及耐用性好，结果稳定可靠，即本发 明虽采用成本低廉的普通色谱柱及液相色谱系统，却取得了意想不到的更好的分 析检测效果，从而可以用于达沙替尼中间体的质量控制，为最终成品的质量提供 有效保障。

附图说明

图1实施例1的达沙替尼中间体HPLC图谱。

图2实施例2的达沙替尼中间体HPLC图谱。

图3实施例3的达沙替尼中间体HPLC图谱。

图4实施例4的达沙替尼中间体HPLC图谱。

图5实施例9的达沙替尼中间体线性工作曲线。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本 发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代 均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Boston  Boschrom ODS C18（4.6×250mm，5μm），检测波长320nm，柱温25℃，流速 1.0mL/min，流动相：0.05mol/L的醋酸钠溶液：乙腈=55:45，三氟乙酸体积为 前两者体积和的0.2%。

实验步骤：将达沙替尼中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含达 沙替尼中间体0.2mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10μL注入 液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。

附图1表明，在该色谱条件下，达沙替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离， 且峰形较好，其中达沙替尼中间体峰的保留时间在12.706min，对称因子0.969。

实施例2

仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Boston  Boschrom ODS C18（4.6×250mm，5μm），检测波长320nm，柱温25℃，流速 0.5mL/min，流动相：0.01mol/L的醋酸钠溶液：乙腈=65:35，三氟乙酸体积为 前两者体积和的0.2%。

实验步骤：将达沙替尼中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含达 沙替尼中间体0.2mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10μL注入 液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。

附图2表明，在该色谱条件下，达沙替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离， 且峰形较好，其中达沙替尼中间体峰的保留时间在18.667min，对称因子1.001。

实施例3

仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Boston  Boschrom ODS C18（4.6×250mm，5μm），检测波长320nm，柱温25℃，流速 1.2mL/min，流动相：0.03mol/L的醋酸钠溶液：乙腈=45:55，三氟乙酸体积为 前两者体积和的0.2%。

实验步骤：将达沙替尼中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含达 沙替尼中间体0.2mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10μL注入 液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。

附图3表明，在该色谱条件下，达沙替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离， 且峰形较好，其中达沙替尼中间体峰的保留时间在11.537min左右，对称因子 0.939。

实施例4

仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Boston  Boschrom ODS C18（4.6×250mm，5μm），检测波长320nm，柱温25℃，流速 1.0mL/min，流动相：0.05mol/L的醋酸铵溶液：乙腈=55:45，三氟乙酸体积为 前两者体积和的0.2%。

实验步骤：将达沙替尼中间体用流动相溶解并定量稀释制成每1mL中含达 沙替尼中间体0.2mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液10μL注入 液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图4。

附图4表明，在该色谱条件下，达沙替尼中间体峰和杂质峰可以完全分离， 且峰形较好，其中达沙替尼中间体峰的保留时间在14.038min，对称因子0.944。

实施例5

系统适应性实验

仪器与条件：同实施例1。

实验步骤：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含 0.2mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算达沙 替尼中间体峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。

表1达沙替尼中间体系统适用性实验结果

由表1可知，达沙替尼中间体峰的对称因子为0.96左右，理论板数较高， 峰面积的相对标准偏差为0.11%，保留时间的相对标准偏差为0.035%。可见， 该色谱条件下，达沙替尼中间体峰峰形较好，而且相对标准偏差较小，所得结果 稳定可靠。

实施例6

重复性实验

仪器与条件：同实施例1。

实验步骤：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含 0.2mg的溶液，作为供试品溶液，同法配制6份供试品溶液。取供试品溶液，连 续进样六次，按面积归一化法计算达沙替尼中间体含量，并计算其相对标准偏差， 实验结果见表2。

表2达沙替尼中间体重复性实验结果

由表2可知，各供试品溶液中达沙替尼中间体的含量没有明显差异，相对标 准偏差为0.0072％，可见本分析检测方法的重复性良好。

实施例7

耐用性实验

仪器与条件：Agilent1100液相色谱系统，DAD检测器，色谱柱：Boston  Boschrom ODS C18（4.6×250mm，5μm），检测波长320nm。

实验步骤：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含 0.2mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和流动相配比（三氟 乙酸含量保持0.2％），记录达沙替尼中间体含量的变化情况（按面积归一化法计 算），实验结果见表3。

表3达沙替尼中间体耐用性实验结果

由表3可知，改变柱温、流速和流动相配比后，达沙替尼中间体含量的测定 结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。

实施例8

检测限

仪器与条件：同实施例1。

实验步骤：取达沙替尼中间体约10mg，精密称定，置50ml量瓶中作为储备 液。加溶剂采用逐步稀释法，以S/N≈3时的浓度作为检测限浓度，此时达沙替尼 中间体的浓度为0.04859μg/ml，检测限为0.4859ng。可见本方法及仪器的灵敏度 较高。

实施例9

线性与范围

仪器与条件：同实施例1。

实验步骤：取达沙替尼中间体52.52mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶 剂超声溶解并稀释至刻度，即得线性储备液。精密量取线性储备液1.0ml，2.0ml， 3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，7.5ml分别置25ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度， 摇匀，依法测定。以供试品溶液的浓度为横坐标，以达沙替尼中间体峰峰面积为 纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为y=43197x+167.77，工作曲线见附图5。

由附图5可知，图中趋势线的相关系数R²=0.9991，可见在该色谱条件下， 达沙替尼中间体在0.04～0.32mg/mL的浓度范围内线性关系良好。