一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法

摘要

本发明涉及一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，属于生物标志物检测领域；首先建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型，利用得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，首先通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白；然后对筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算。本发明的方法检测的是生物体内实际生理变化，能起到提前预防的作用；筛选出的小鼠血清中一些差异基因表达变化情况稳定、显著、灵敏度高的特点；在二维电泳筛选结果的基础上结合Realtime-PCR技术，在蛋白水平和RNA水平上对基因的表达进行检测，大大提高了检测的可靠性和灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，属于生物体镉中毒的生 物标志物检测领域。

背景知识

近年来，随着我国采矿、冶炼、陶瓷、电镀、及电子工业的迅猛发展，使镉、砷、汞等 有害重金属通过废水、废气、废渣大量排放到自然界中，对耕地等土壤环境造成污染，同时 也通过地表进入水体，流入海洋，导致了水体的严重污染。2014年4月我国公布最新的土壤 污染调查公报显示，约16％的土壤遭受污染，其中重金属镉的污染约占7％，在过去的20年 内增加了一倍，且有继续增加的趋势。这些镉在生物体内不易分解排放，蓄积在生物体内损 伤机体并且中毒后难以发现，严重的威胁到人类的健康问题。因此，重金属镉的污染已经引 起了全社会的关注，也是国内外学者面临的重要研究命题之一。

镉(Cd)的原子量为112.41，处于周期表ⅡB副族。镉溶于酸但不溶于碱，有Cd²⁺和 Cd¹⁺两种氧化态。镉对动植物的危害较大，被镉污染的空气对人体危害严重。在上个世纪五 十年代，日本富山县出现的“痛痛病”事件就是由于当地的冶炼厂排放的镉物质污染了水体 和土壤，通过食物进入人体，使镉在体内蓄积而中毒致病的，患者出现了腰、背、手、脚等 关节刺痛，骨骼变形易骨折的现象。根据美国国立卫生研究院(NIH)有毒物质数据库(HSDB) 公布的信息可知，体内的镉大部分集中在肝脏及肾脏中，在骨骼和肌肉中也有相当量积累。 体内和体外实验表明镉可以导致染色体损伤，还会影响基因的表达以及信号传导，目前研究 表明过量的镉可以增加乳腺癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌和肾癌的发生几率。世界卫生组织 (WHO)的国际癌症研究所(IRAC)把镉列为人类已知的致癌物，美国环保局把镉列为B1组 人类致癌物。我国也是镉污染的重灾区，近年来不断的出现镉污染、镉中毒的事件，自2011 年以来，中国多地市场发现大米镉含量超过国家规定的标准，引起了食品卫生部门的高度重 视，这些食物中的镉通过食物链进入牲畜，最终进入人体，危害人体健康。这也使得对镉的 研究显得尤为重要。

目前，世界各国也都十分重视重金属镉污染的检测和研究。现有检测镉的方法主要是通 过化学反应以及紫外-可见光分光光度法、原子吸收光谱法等测定生物体中组织或者器官中镉 的含量，对于哺乳动物主要是血液和尿液中镉的含量。但是镉在进入机体后经过血液进入肝 脏，再进入肾脏，其会在器官中不断的迁移，所以在不同的时期、不同的器官中镉的含量都 不稳定；在检测过程中还容易被外界环境污染，误差较大。另外，尿液中的β₂-微球蛋白、尿 α₁-微球蛋白也是现有的检测镉中毒的一些指标，但是这些蛋白的变化都出现在肾脏受到损伤 之后。因此这些传统的方法存在着操作麻烦费时、检出灵敏度低、特异性差和稳定性差的缺 点，且不能及时的反应出生物体在镉诱导下生理、生化反应及代谢等方面的变化。本发明就 是基于重金属镉对小鼠产生毒害的情况下，引起小鼠相关基因的变化而建立起来的一种快速、 灵敏的人体镉中毒的有效检测方法，为镉中毒的防治提供了科学有效的检测依据。

本发明通过二维电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现了一组镉 诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白载脂蛋白A-Ⅳ (Apolipoprotein A-IV，妊娠带蛋白(Pregnancy zone protein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体 (Apolipoprotein A-I precursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)和4个上调蛋白淀 粉体P成分前体(amyloid P-component precursor)，载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，载脂蛋 白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)。这组蛋 白的变化或者其中某些蛋白的变化可以反应体内镉的情况，被认为可以作为检测机体内镉的 生物标志物。这类标志物能实际的反映生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢等方面的 变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，且样品容易获取，能起到提前 防治的作用。另外，利用血清中表达差异的蛋白作为重金属镉检测指标的研究还比较少。

发明内容

本发明的目的在于克服传统检测手段中存在的缺点和不足，提供一种快速、灵敏、高效 的生物体重金属镉的分子生物学检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术法案如下：

(1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型：

将不同浓度的镉加入小鼠食物，根据小鼠的存活率确定致死剂量；然后在远低于致死剂 量的前提下，选取一个安全的镉剂量作为研究对象。

(2)利用步骤(1)得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，具体步骤如下：

A.通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白：

A-1.小鼠血清和肝脏组织的的获取：通过眼球取血的方法获取试验小鼠的全血，静置 离心得到小鼠血清；然后解剖小鼠，获取肝脏组织。

A-2.血清蛋白中差异蛋白的筛选：去除血清白蛋白，测定蛋白浓度后，通过二维电泳 (2-DE)筛选出生物体内蓄积镉诱导的差异蛋白。

A-3.差异蛋白的鉴定：抠取二维电泳胶上的蛋白点，质谱鉴定差异蛋白。

B.筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算：

为了确保二维电泳筛选出的差异蛋白表达变化的结果的准确性，进一步从mRNA水平 上验证这些蛋白的表达变化情况。由于镉通过血液首先进入肝脏，血液和肝脏中的变化很相 似，且肝脏RNA容易提取，故选用小鼠肝脏验证差异蛋白在mRNA水平上的变化情况。

B-1.提取小鼠肝脏总RNA。

B-2.小鼠肝脏中差异蛋白基因表达量的测定：

首先以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR合成cDNA第一链；然后以合成的cDNA 为模版，根据差异基因的cDNA序列设计特异性引物和内参引物，进行Real time-PCR反应， 并得到每个基因的Ct值：最后根据PCR得到的Ct值，计算出筛选到的差异蛋白在小鼠肝脏 中的相对表达量，利用下面公式计算：

基因相对表达量＝2^-ΔΔCt

ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(β-actin)

ΔΔCt＝(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))实验组-(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))对照组

2^-ΔΔCt计算的结果即为差异基因相对于对照组的变化量，称为相对表达量。β-actin是管家 基因，在所有类型的细胞中都有表达，受环境因素影响很小，具有比较稳定的表达，因此常 用来作为测定目标基因表达量的参照基因。本发明中2^-ΔΔCt数值变化越大，表明在镉的作用下 该基因表达量变化越大，待测样品中镉含量就越大。

其中，步骤A-3通过二维电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现 了一组镉诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白：载脂蛋白A- Ⅳ(Apolipoprotein A-IV)，妊娠带蛋白(Pregnancy zone protein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体 (Apolipoprotein A-I precursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)；4个上调蛋白： 淀粉体P成分前体(amyloid P-component precursor)，载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，载脂 蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)。这组 蛋白的变化或者其中某些蛋白的变化可以反应体内镉的情况，被认为可以作为检测机体内镉 的生物标志物。这类标志物能实际的反映生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢等方面 的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，且样品容易获取，能起到提 前防治的作用。

步骤B-2中所述根据差异蛋白的cDNA序列，设计出符合Real time-PCR反应特点的特异 性引物如下所示：(总RNA反转录得到的cDNA包含差异蛋白的cDNA序列，通过设计特异 的差异蛋白基因的引物可以从总cDNA中扩增得到差异蛋白基因序列)。

本发明和已有的技术相比，具有以下优势：

(1)与传统的检测生物体内重金属蓄积量分析相比，本发明检测的是生物体内实际生 理变化，是个体免疫应激产生的相关指标的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生 的毒害作用，能起到提前预防的作用。

(2)本发明以小鼠血清中一些差异基因的相对表达量作为检测指标，实验表明这些基 因对镉非常敏感，在镉的胁迫下会先发生变化，经过多次重复实验，表明这些基因表达变化 情况稳定、显著，技术手段先进、灵敏度高的特点。

(3)本发明在二维电泳筛选结果的基础上结合Real time-PCR技术，在蛋白水平和RNA 水平上对基因的表达进行检测，大大提高了检测的可靠性和灵敏度。并且在Real time-PCR中， 采用的是全封闭的反应体系，有效避免了其他因素造成的试验误差，保证了结果的可靠性和 重复性。

附图说明

图1小鼠镉中毒模型的致死曲线。

图2差异蛋白基因在小鼠肝脏中相对表达变化情况。图中：1为对照组2为100ppm镉 处理组。

具体实施方式

结合下列实例进一步说明本发明的实施方案，但不应该当作本发明的限制。

实施例1：食物中镉离子(Cd²⁺)对小鼠血清蛋白变化的筛选

1.小鼠镉中毒模型实验

本实验通过Cd²⁺胁迫小鼠的毒性试验，得到重金属镉对小鼠的致死剂量(10000ppm)， 从而选取一个安全剂量(100ppm)作为Cd²⁺胁迫小鼠基因表达实验的离子浓度参数。

小鼠选取形态指标没有显著差异的成熟个体，在小鼠食物中加入浓度为10000ppm的镉 离子溶液，其终浓度为达到毒性实验中选取的镉离子安全剂量100ppm；每天添食一次，同时 设置空白对照组，每组喂养小鼠5只；一周后，对每组的小鼠取眼球放血，然后解剖后获取 小鼠肝脏，于液氮中冷冻备用。

2.血清蛋白的获取、纯化和二维电泳的筛选

将取到的小鼠血液4℃静置12-14h，12000rpm，4℃离心15-20分钟，抽取上清，通过 QIAGEN公司的Albumin Depletion Kit去除血清白蛋白，用BCA法测定蛋白含量，取一部分 进行二维电泳分离筛选差异蛋白，剩余部分分装之后于-80℃保存备用。

3.差异蛋白点的鉴定

将二维电泳筛选出来的蛋白点抠出，经过50％的乙腈脱色和100％的乙腈脱水之后，加

入15μL浓度为0.1μg/μL的胰酶，37℃过夜消化。消化好的蛋白通过MALDI-TOF-MS鉴定分 析，可以得到二维电泳筛选出的差异蛋白的具体信息，结果如下表所示。

实施例2：对二维电泳筛选出的差异蛋白基因进行Real time PCR测定

1.小鼠肝脏总RNA的提取和纯化(总RNA反转录得到的cDNA包含差异蛋白的cDNA 序列，通过设计特异的差异蛋白基因的引物可以从总cDNA中扩增得到差异蛋白基因 序列)

(1)取50-100mg小鼠肝脏组织，加入1mL 4℃预冷的Trizol，冰上充分研磨使细胞 裂解装入EP管中，震荡2min，室温放置3-5min。

(2)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，然后12000rpm，4℃离心10min。

(3)吸取上清至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，然后 12000rpm，4℃离心10min，弃上清。

(4)加入1mL的75％的乙醇洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10min，重复2-3次。

(5)弃上清，室温干燥5-10min，加入30-50μL的RNase-free水，充分溶解RNA。

2.Real time-PCR验证差异蛋白基因表达情况

(1)引物设计：根据差异蛋白的cDNA序列，设计出符合Real time-PCR反应特点的特 异性引物。

以及作为内参基因的小鼠β-actin基因特异性引物：

β-actin-F 5’CGTTGACATCCGTAAAGACC 3’

β-actin-R 5’AACAGTCCGCCTAGAAGCAC 3’

(2)cDNA的合成

Ⅰ.将1中提取的RNA用DNase消化残留的DNA；

37℃反应30min，加入1μL的DNA酶反应终止液，65℃，10min，灭活DNA酶。

Ⅱ.反转录

取消化好的RNA 2μg，加入：

Oligo dT            1μL

随机引物            1μL

DEPC水         加至12μL

混合物在65℃加热5min，迅速置于冰上，短暂离心后加入以下组分：

轻轻混匀后，37℃孵育2min，然后加入1μL的M-MLV逆转录酶，37℃孵育50min， 然后在70℃加热15min以终止反应。

Ⅲ.Real time-PCR检测

Real time-PCR反应试剂盒采用杭州博日公司的SYBR Green进行Real time-PCR扩增 反应，获得各管的Ct值(软件自动生成)。

Real time-PCR反应体系如下：

试剂 用量 2×SYBR Mix(荧光PCR混合物) 10μL Taq Polymerase(聚合酶) 0.12μL Forward Primer(10μM)正向引物 0.5μL Reverse Primer(10μM)反向引物 0.5μL cDNA(100ng)模板 1μL ddH2O灭菌水 7.98μL Total Volume总体积 20μL

Real time-PCR反应程序如下：

Dissociation(熔解曲线的制作)

(3)小鼠肝脏差异基因相对表达量的计算：根据PCR仪得到的Ct值(软件自动生成)， 利用下面公式计算：

基因相对表达量＝2^-ΔΔCt

ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(β-actin)

ΔΔCt＝(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))实验组-(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))对照组 使用2-ΔΔCt计算实验组模板中小鼠差异蛋白基因相对于对照组的表达倍数，取平均 值，即为小鼠肝脏差异蛋白基因的相对表达量，其表达变化情况如图2所示：A:载脂蛋白 A-Ⅳ(Apolipoprotein A-IV)，结果与对照组相比降低0.4倍；B:妊娠带蛋白(Pregnancy zone  protein)，降低0.69倍；C:载脂蛋白A-Ⅰ前体(Apolipoprotein A-I precursor)，降低0.35倍；D: 视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)，降低0.64倍；E:淀粉体P成分前体(amyloid  P-component precursor)，上升2.4倍；F:载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，降低0.63倍；G:载 脂蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，降低0.85倍；H:载脂蛋白A-Ⅱ (Apolipoprotein A-II)，降低0.82倍.β-actin作为内参基因。取3次重复的平均值，标准差 用误差线来指示，星号表示在统计学上有显著的差异(p<0.05)。

本发明中涉及的小鼠血清中差异蛋白基因定量表达技术，可以归属于第二代分子生物学 检测新技术，操作简单易学，对设备的要求不高且成本较低；另外，这组差异蛋白存在于血 清中，检测样品获取方便快捷；且对于重金属镉的敏感性较高，因而本发明具有检测方便快 捷、灵敏的特点。这在镉污染对于生物体的危害检测、预防方面有着重要的社会意义。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1176

<212>  DNA

<213>  Mus musculus

 

<400>  1

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<210>  2

<211>  863

<212>  DNA

<213>  Mus musculus

 

<400>  2

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<210>  3

<211>  675

<212>  DNA

<213>  Mus musculus

 

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<210>  4

<211>  4488

<212>  DNA

<213>  Mus musculus

 

<400>  4

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tccggggacg gtgaattggc ggtaaaggtc cccgacacca tcactgagtg gaaggccagt   2340

 

gcattctgct tgtctggaac cactggcctt ggcctctcct ccaccatctc ccttcaagcc   2400

 

ttccagccct tcttcttgga gctcactctc ccatactctg tggtgcgagg ggaagccttt   2460

 

accctcaaag ccaccgtgct caattacatg tctcactgca ttcagatccg agtggaccta   2520

 

gagatttctc ctgatttcct ggcagtccca gtggggggcc atgaaaactc tcattgcatc   2580

 

tgtggaaatg aaaggaaaac cgtgtcctgg gctgtgaccc caaagtcgct gggggaggtg   2640

 

aacttcacag ctaccgcaga agccttgcag tctccagaat tgtgtggcaa taagttgaca   2700

 

gaagtgccag cccttgtaca caaggacact gtggtgaagt ccgtaatagt tgagcctgaa   2760

 

ggaattgaga aggagcaaac gtacaacaca ctgttatgcc cacaagatac tgagttacaa   2820

 

gataattggt cactggagct tccacccaat gtggttgaag gatctgccag ggctacacat   2880

 

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tatctgaacg agacacagca gctgacagag gcgatcaagt ccaaagccat taactacctc   3060

 

atcagtgggt accagaggca gctgaactat cagcacagtg atggctcgta cagcacattc   3120

 

gggaaccatg gtggtggcaa cactccggga aatacttggc tcactgcgtt tgtgctcaag   3180

 

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aactcccacg ggggcttctc ctccactcag gatacagtgg tggctctcca agccctctcc   3840

 

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taccttcaga catctctaaa gtacaacatc ctcccagtgg cagatggaaa agcacccttc   4080

 

gctctgcaag tcaacactct cccactaaac tttgacaagg caggagatca cagaacattc   4140

 

cagattcgca tcaacgtaag ctacactgga gaacgaccca gctccaacat ggtcattgtt   4200

 

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gaatacagtg cccctttcag tgatggctct gaacaaggaa atgcttaa                4488

 

 

<210>  5

<211>  519

<212>  DNA

<213>  Rattus sp.

 

<400>  5

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gtgaggcagc gacaggagga gctgtgccta gagaggcagt acagatggat cgagcacaat    480

 

ggttactgtc aaagcagacc ctcaagaaac agtttgtag                           519

 

 

<210>  6

<211>  300

<212>  DNA

<213>  Mus musculus

 

<400>  6

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ttcaccggct tctgggattc taaccctgag gaccaaccaa ctccagctat tgagtcgtga    300

 

 

<210>  7

<211>  309

<212>  DNA

<213>  Mus musculus

 

<400>  7

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gctaagtga                                                            309

 

 

<210>  8

<211>  795

<212>  DNA

<213>  mouse

 

<400>  8

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ctgactgccc agtga                                                     795