青葙子中新的三萜皂苷类化合物青葙苷L及其医疗用途

摘要

本发明涉及的是从中药青葙子中分离得到的1个结构新颖的三萜皂苷类化合物青葙苷L及其医疗用途。从苋科(Amaranthaceae)植物青葙(Celosia argentea L.)的干燥成熟种子中经过提取、精制、结构鉴定分离得到的具有保肝作用的新化合物，采用红外光谱、高分辨质谱、一维/二维核磁共振波谱以及理化分析鉴定其结构。

说明书

技术领域

本发明涉及青葙子中新的三萜皂苷类化合物及其用途，属于天然药物医药技术领域。

背景技术

青葙子是中医常用中药，又名草决明、野鸡冠花子、狗尾巴子、牛尾巴花子。为苋科 (Amaranthacea)一年生草本植物青葙(Celosia argentea L.)的成熟种子，中国大部分地区 均有野生或栽培。其味苦、性微寒，归肝经，具有清肝，明目，退翳之功效。常用于目赤肿 痛、角膜炎、角膜云翳、虹膜睫状体炎、眩晕、皮肤风热瘙痒、疥癣的治疗。青葙子所含化 学成分较多，现报道的主要有甾醇类、环肽类、皂苷类、有机酸类等。林文群等研究发现青 葙子中含有丰富的氨基酸和脂肪油(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、和亚麻酸等)，并含烟 酸及丰富的硝酸钾^[1，2]。薛芊等从青葙子中分出β-谷甾醇、棕榈酸、豆甾醇、胡萝卜苷、齐墩 果酸^[3]。Morita等分离出一系列环肽类物质(moroidin，celogentin A-K)^[4-6]。郭美丽等分离 出三萜皂苷类成分(包括青葙苷A、B、C、D、C1、D1、E、F、G、鸡冠花苷)，研究发现 这些皂苷类成分具有保肝、抗肿瘤等药理活性^[7-11]。临床上也有以青葙子为主要药味的中成药， 如青葙丸来源于《医宗金鉴》卷七十八，是传统的中药方剂，其组成为菟丝子1两，茺蔚子1 两，生地黄2两，青葙子2两，防风1两，五味子3钱，黑参1两，柴胡1两，泽泻1两， 细辛3钱，车前子1两，茯苓1两，主要用于肝虚积热，眼目起初红肿疼痛羞明，涩泪难开， 久则渐生翳膜，视物昏暗；绿风还睛丸来源于《金鉴》卷七十七，其组成为甘草1两，白术1 两，人参1两，茯苓1两，羌活1两，防风1两，菊花1两，生地黄1两，蒺藜1两，肉苁蓉1 两，山药1两，牛膝1两，青葙子1两，密蒙花1两，菟丝子1两，木贼1两，川芎1两。主治 内障，已成绿风不足证。

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，由各 种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合 征，也是一种临床常见病症。随着社会的发展，人们生活方式和饮食结构的改变，NAFLD的 发病率有上升趋势，正严重威胁人类的健康。

发明内容

本发明的目的是提供两种从苋科(Amaranthacea)植物青葙(Celosia argentea L.)中分离 得到的具有保肝作用的化合物，并采用光谱技术，包括红外、高分辨质谱、核磁共振以及酸 水解-衍生化-高效液相色谱法鉴定其结构。命名为：青葙苷K(celosin K)，青葙苷L(celosin L)。 其化学结构如下：

青葙苷K提取、分离的优选方法

青葙子中新的三萜皂苷类化合物青葙苷K的制备方法如下：

1、提取：将干燥青葙子药材粉碎后，加入药材重量5～10倍体积量的40～70％乙醇溶液冷浸 过夜，40～80℃加热回流提取2～4次，合并乙醇提取液，浓缩得总提取物。

2、粗分：将上述提取所得总提取物，加入总提取物重量5～15倍量的水溶解后，按青葙子药 材与树脂质量比1∶(1～10)，经大孔吸附树脂，分别以水、10～20％乙醇溶液、40～80％乙醇 溶液、85～95％乙醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱2～6个保留体积，收集40～80％乙醇溶液洗 脱部位，于60℃减压浓缩得粗提物。

3、精制：上述粗提物以粗硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱(100∶1～1∶1)。将二氯甲烷-甲醇(1∶4)～(4∶1)洗脱部分经反相ODS色谱分离(分离条 件：色谱柱内径2cm，柱内填料高40cm；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱)，50％-55％的 甲醇洗脱部位经冷冻干燥，得到目标化合物青葙苷K。

青葙苷L提取、分离的优选方法

青葙子中新的三萜皂苷类化合物青葙苷L的制备方法如下：

1、提取：将干燥青葙子药材粉碎后，加入药材重量8～12倍体积量的40～70％乙醇溶液冷浸 过夜，40～80℃加热回流提取2～4次，合并乙醇提取液，浓缩得总提取物。

2、粗分：将上述提取所得总提取物，加入总提取物重量8～12倍量的水溶解后，按青葙子药 材与树脂质量比1∶(1～10)，经大孔吸附树脂，分别以水、10～20％乙醇溶液、40～80％乙醇 溶液、85～95％乙醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱2～6个保留体积，收集40～80％乙醇溶液洗 脱部位，于60℃减压浓缩得粗提物。

3、精制：上述粗提物以粗硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱(100∶1～1∶1)。将二氯甲烷-甲醇(1∶4)～(4∶1)洗脱部分经反相ODS色谱分离(分离条 件：色谱柱内径2cm，柱内填料高40cm；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱)，收集60％～70％ 的甲醇洗脱部位，再经Sephadex LH-20分离(分离条件：色谱柱直径3cm，长0.8m；湿法上 样；上样体积占柱总体积的1％；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱；洗脱液流速1ml/min)， 收集50％甲醇洗脱馏分，回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得青葙苷L化合物单 体成分。

结构鉴定的方法

利用光谱技术，包括红外、高分辨质谱、核磁共振以及酸水解-衍生化-高效液相色谱法 鉴定其结构。

青葙子中两种新的三萜皂苷类化合物

该新的三萜皂苷类化合物波谱数据如下：

(1)化合物为白色粉末，[α]_D²⁰+38.2°(c0.130，MeOH)。IRv _max3899，3444，2950，2310， 1638，1400，1153，1072，545和518em^-1。ESI-QTOF-MS m/z：941.4739[M-H]^-(计算值为 941.4752)，可推知其分子式为C₄₇H₇₄O₁₉。

¹HNMR(C₅D₅N，500MHz)谱高场区出现7个角甲基信号：δ_H1.01(s，H₃-23)、1.02(s， H₃-24)、1.07(s，H₃-25)、0.75(s，H₃-26)、0.96(s，H₃-27)、0.74(s，H₃-29)、0.71(s，H₃-30)； 低场区有一个烯氢信号δ_H5.16(br s，H-12)；及两个连氧碳上的质子信号δ_H4.36(d，J＝3.5Hz， H-2)、3.09(d，J＝3.5Hz，H-3)；¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)显示7个甲基碳信号：δ_C28.8 (C-23)、17.6(C-24)、15.7(C-25)、16.6(C-26)、25.3(C-27)、32.3(C-29)、22.8(C-30)；两个 烯碳信号δ_C 122.4(C-12)、143.2(C-13)；一个连氧的仲碳信号δ_C 89.3(C-3)；及一个羧基信号 δ_C177.4(C-28)。确定该化合物的苷元为2β-羟基-齐墩果酸。

经酸水解检出D-葡萄糖醛酸、D-木糖和D-葡萄糖。¹H NMR(C₅D₅N，500MHz)显示 相应端基氢信号：δ_H4.66(d，J＝7.5Hz)、δ_H4.99(d，J＝7.5Hz)、δ_H5.73(d，J＝8.5Hz)；相 应端基碳信号：δ_C 104.5(C-1″′)、δ_C 103.8(C-1″)、δ_C94.4(C-1″′)。根据各糖端基质子信号耦合 常数的大小可以确定该化合物糖链中葡萄糖醛酸、木糖和葡萄糖均为β构型。在HMBC谱中， δ_H4.99与C-2′(δ_C 84.1)有相关，可推测出该化合物有两个糖1→2连接，δ_H4.66与δ_C 89.3 (C-3)，δ_H5.73与δ_C 177.4(C-28)有相关，可推测出糖链分别连在C-3和C-28上(表1)。

表1化合物的NMR数据和关键的HMBC相关性

综合以上信息，确定该化合物结构为2β-羟基3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄 糖醛酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸(图1)。经检索为一新化合物，命名为青葙苷K (celosin K)。

(2)化合物为白色粉末，[α]_D²⁰+84°(c 0.016，MeOH)。IRv _max3423，2946，2319，1751，1631， 1400，1259，1146，1074，1000，904，625，518，458，443和419cm^-1。ESI-QTOF-MS m/z：793.4074 [M-H]^-(计算值为793.4016)，可推知其分子式为C₄₁H₆₂O₂₀。

结合¹H、¹³C NMR信息，该化合物具有6个甲基单峰信号：δ_H1.25(s，H₃-24)、1.05(s， H₃-25)、0.66(s，H₃-26)、0.88(s，H₃-27)、0.66(s，H₃-29)、0.79(s，H₃-30)；一个烯氢信号δ_H5.15(br s，H-12)及两个羟基取代碳上的质子信号δ_H4.37(m，H-2)、3.73(d，J＝4.0Hz，H-3)； ¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)显示六个甲基信号：δ_C 10.4(C-24)、15.8(C-25)、16.6(C-26)、25.4 (C-27)、32.5(C-29)、22.9(C-30)；两个烯碳信号δ_C 121.1(C-12)、144.6(C-13)；两个连氧碳 信号δ_C68.5(C-2)、82.3(C-3)；及两个羰基信号δ_C 176.7(C-28)、209.7(C-23)。综上可知该化 合物的苷元为2β-羟基-23-醛基-齐墩果酸。

经酸水解检出D-葡萄糖醛酸和D-木糖。结合1D，2D-NMR可推知相应的端基氢信号为 δ_H4.49(d，J＝8Hz，H-1′)、4.84(d，J＝8Hz)，相应的碳信号为δ_C 102.9(C-1′)、103.4(C-1″)。 由耦合常数的大小可推断出葡萄糖醛酸和木糖均为β构型。在HMBC谱中，δ_H4.84与δ_C 83.4 (C-2″)相关，可推测出该化合物的两个糖1→2连接；δ_H4.49与δ_C82.3(C-3)相关，可推测出糖 链连在C-3上(表2)。

表2化合物的NMR数据和关键的HMBC相关

综合以上信息，鉴定该化合物结构为2β-羟基-23-醛基-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D- 吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸((图2)。经检索为一新化合物，命名为青葙苷L(celosin L)。

上述制备出的化合物命名为：青葙苷K(celosin K)，青葙苷L(celosin L)，其波谱数据如 下：

(1)化合物为白色粉末，[α]_D²⁰+38.2°(c 0.130，MeOH)。IRv _max3899，3444，2950，2310，1638， 1400，1153，1072，545和518cm^-1。ESI-QTOF-MS m/z：941.4739[M-H]^-(计算值为941.4752)， 可推知其分子式为C₄₇H₇₄O₁₉。

¹HNMR(C₅D₅N，500MHz)谱高场区出现7个角甲基信号：δ_H1.01(s，H₃-23)、1.02(s， H₃-24)、1.07(s，H₃-25)、0.75(s，H₃-26)、0.96(s，H₃-27)、0.74(s，H₃-29)、0.71(s，H₃-30)； 低场区有一个烯氢信号δ_H5.16(br s，H-12)；及两个连氧碳上的质子信号δ_H4.36(d，J＝3.5Hz， H-2)、3.09(d，J＝3.5Hz，H-3)；¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)显示7个甲基碳信号：δ_C28.8 (C-23)、17.6(C-24)、15.7(C-25)、16.6(C-26)、25.3(C-27)、32.3(C-29)、22.8(C-30)；两个 烯碳信号δ_C 122.4(C-12)、143.2(C-13)；一个连氧的仲碳信号δ_C 89.3(C-3)；及一个羧基信号 δ_C 177.4(C-28)。确定该化合物的苷元为2β-羟基-齐墩果酸。

经酸水解检出D-葡萄糖醛酸、D-木糖和D-葡萄糖。¹H NMR(C₅D₅N，500MHz)显示相 应端基氢信号：δ_H4.66(d，J＝7.5Hz)、δ_H4.99(d，J＝7.5Hz)、δ_H5.73(d，J＝8.5Hz)；相应 端基碳信号：δ_C 104.5(C-1″′)、δ_C 103.8(C-1″)、δ_C94.4(C-1″′)。根据各糖端基质子信号耦合常 数的大小可以确定该化合物糖链中葡萄糖醛酸、木糖和葡萄糖均为β构型。在HMBC谱中， δ_H4.99与C-2′(δ_C 84.1)有相关，可推测出该化合物有两个糖1→2连接，δ_H4.66与δ_C 89.3 (C-3)，δ_H5.73与δ_C 177.4(C-28)有相关，可推测出糖链分别连在C-3和C-28上。

综合以上信息，确定该化合物结构为2β-羟基-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡 萄糖醛酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸。经检索为一新化合物，命名为青葙苷K(celosin  K)。

(2)化合物为白色粉末，[α]D20+84°(c 0.016，MeOH)。IRv_max3423，2946，2319，1751，1631， 1400，1259，1146，1074，1000，904，625，518，458，443和419cm^-1。ESI-QTOF-MS m/z：793.4074 [M-H]^-(计算值为793.4016)，可推知其分子式为C₄₁H₆₂O₂₀。

结合¹H，¹³C NMR信息，该化合物具有6个甲基单峰信号：δ_H1.25(s，H₃-24)、1.05(s， H₃-25)、0.66(s，H₃-26)、0.88(s，H₃-27)、0.66(s，H₃-29)、0.79(s，H₃-30)；一个烯氢信号δ_H5.15(br s，H-12)及两个羟基取代碳上的质子信号δ_H4.37(m，H-2)、3.73(d，J＝4.0Hz，H-3)； ¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)显示六个甲基信号：δ_C10.4(C-24)、15.8(C-25)、16.6(C-26)、25.4 (C-27)、32.5(C-29)、22.9(C-30)；两个烯碳信号δ_C 121.1(C-12)、144.6(C-13)；两个连氧碳 信号δ_C68.5(C-2)、82.3(C-3)；及两个羰基信号δ_C 176.7(C-28)、209.7(C-23)。综上可知该化 合物的苷元为2β-羟基-23-醛基-齐墩果酸。

经酸水解检出D-葡萄糖醛酸和D-木糖，结合1D，2D-NMR可推知相应的端基氢信号为 δ_H4.49(d，J＝8Hz，H-1′)、4.84(d，J＝8Hz)，相应的碳信号为δ_C 102.9(C-1′)、103.4(C-1″)。 由耦合常数的大小可推断出葡萄糖醛酸和木糖均为β构型。在HMBC谱中，δ_H4.84与δ_C 83.4 (C-2″)相关，可推测出该化合物的两个糖1→2连接；δ_H4.49与δ_C82.3(C-3)相关，可推测出糖 链连在C-3上。

综合以上信息，鉴定该化合物结构为2β-羟基-23-醛基-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)-β-D- 吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸。经检索为一新化合物，命名为青葙苷L(celosin L)。

本发明所述的青葙子中新的三萜皂苷类化合物在制备治疗或预防脂肪肝变性的组合物上 的应用。

本发明所述的青葙子中新的三萜皂苷类化合物在制备治疗或预防肝功能损害的组合物上 的应用。

药效实验

对非酒精性脂肪肝的治疗作用

1、实验动物及方法：

C57BL小鼠，SPF级，雄性，体重(20+2)g，随机分成两组，第一组12只，为正常组，给与 正常饲料，其余小鼠(44只)分为第二组，给与高脂饲料(50％正常饲料、15％猪油、10％蛋黄 粉、15％奶粉、5％蔗糖、3％胆固醇、2％胆酸钠)自由摄食、饮水。连续喂养5周后，从正 常对照组和脂肪肝模型组分别处死4只小鼠，比较两组小鼠的血清和肝脏生化指标，以及肝 脏组织病理切片，判断非酒精性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。将造模成功小鼠40只随机分 为5组，每组8只，分别为模型对照组、阳性药物壳脂胶囊组(100mg/kg，1次/d)、青葙苷K (2mg/kg，1次/d)、青葙苷L治疗组(2mg/kg，1次/d)，连续灌胃给药6周，正常对照组(8只)和模 型对照组给予等量生理盐水。给药期间，除正常对照组标准鼠料饲养外，其余各组继续给予 高脂饮食，直到实验结束。

2、观察指标：

a动物的一般情况

b肝功能相关指标：血清ALT、AST，SOD、肝脏指数、体脂指数

c血脂相关指标：TC、TG、HDL、LDL

d病理学检查：石蜡切片、HE染色，观察病理变化

3、实验结果：

结果表明：青葙苷K和青葙苷L均可明显降低血浆中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)，升 高高密度脂蛋白(HDL)，降低低密度脂蛋白(LDL)，有效缓解高脂饲料引起的非酒精性脂 肪肝变性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。结果见表1和表2。

表1各组小鼠血脂指标的变化

与对照组比较：^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01^▲▲▲P＜0.001；与模型组比较：^*P＜0.05^**P＜0.01，^***P＜0.001下同

表2各组小鼠肝功能相关指标的变化

附图说明

图1青葙苷L的¹H-NMR谱(500MHz，C₅D₅N)

图2青葙苷L的¹³C-NMR谱(125MHz，C₅D₅N)

图3青葙苷L的DEPT谱(125MHz，C₅D₅N)

图4青葙苷L的HSQC谱(500MHz，C₅D₅N)

图5青葙苷L的HMBC谱(500MHz，C₅D₅N)

图6青葙苷L的¹H-¹H COSY谱(500MHz，C₅D₅N)

图7青葙苷L的HR-ESI-MS谱

图8AST

图9ALT

图10TC

图11TG

图12HDL

图13LDL

图14体脂指数

图15病理学检查

具体实施方式：

实施例1：青葙苷L的制备方法1

1、提取：将2000g干燥青葙子药材粉碎后，加入药材重量12倍体积量的50％乙醇溶液冷浸 过夜，65℃加热回流提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得总提取物156g；

2、粗分：将上述提取所得总提取物，加入总提取物重量10倍量的水溶解后，按青葙子药材 与树脂质量比1∶1，经D-101型大孔吸附树脂，分别以水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液、 95％乙醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱4个保留体积，收集70％乙醇溶液洗脱部位，于60℃ 减压浓缩得粗提物34g；

3、精制：上述粗提物以粗硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱(100∶1～1∶1)。将二氯甲烷-甲醇(6∶4)洗脱部分经反相ODS色谱分离(分离条件：色谱 柱内径2cm，柱内填料高40cm；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱)，收集65％的甲醇洗脱 部位，再经Sephadex LH-20分离(分离条件：色谱柱直径3cm，长0.8m；湿法上样；上样体 积占柱总体积的1％；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱；洗脱液流速1ml/min)，收集50％ 甲醇洗脱馏分，回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得化合物青葙苷L单体成分 0.18g；

4、结构鉴定：利用光谱技术，包括红外、高分辨质谱、核磁共振以及酸水解-衍生化-高效液 相色谱法鉴定其结构。

实施例2：青葙苷L的制备方法2

1、提取：将6000g干燥青葙子药材粉碎后，加入药材重量12倍体积量的50％乙醇溶液冷浸 过夜，70℃加热回流提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得总提取物438g；

2、粗分：将上述提取所得总提取物，加入总提取物重量12倍量的水溶解后，按青葙子药材 与树脂质量比1∶1，经D-101型大孔吸附树脂，分别以水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液、 95％乙醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱4个保留体积，收集70％乙醇溶液洗脱部位，于60℃ 减压浓缩得粗提物127g；

3、精制：上述粗提物以粗硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱(100∶1～1∶1)。将二氯甲烷-甲醇(6∶4)洗脱部分经反相ODS色谱分离(分离条件：色谱 柱内径2cm，柱内填料高40cm；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱)，收集65％的甲醇洗脱 部位，再经Sephadex LH-20分离(分离条件：色谱柱直径3cm，长0.8m；湿法上样；上样体 积占柱总体积的1％；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱；洗脱液流速1ml/min)，收集50％ 甲醇洗脱馏分，回收溶剂后溶解于甲醇溶液中，-4℃重结晶得化合物青葙苷L单体成分 0.61g；

4、结构鉴定：利用光谱技术，包括红外、高分辨质谱、核磁共振以及酸水解-衍生化-高效液 相色谱法鉴定其结构；

5、活性测试：青葙苷L均可明显降低血浆中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)，升高高密 度脂蛋白(HDL)，降低低密度脂蛋白(LDL)，有效缓解高脂饲料引起的非酒精性脂肪肝变 性，改善因脂肪变性而导致的肝功能损害。

实施例3：青葙苷K的制备方法1

1、提取：将1500g干燥青葙子药材粉碎后，加入药材重量10倍体积量的50％乙醇溶液冷浸 过夜，65℃加热回流提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得总提取物165g；

2、粗分：将上述提取所得总提取物，加入总提取物重量10倍量的水溶解后，按青葙子药材 与树脂质量比1∶1，经D-101型大孔吸附树脂，分别以水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液、 95％乙醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱4个保留体积，收集70％乙醇溶液洗脱部位，于60℃ 减压浓缩得粗提物32g；

3、精制：上述粗提物以粗硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱(100∶1～1∶1)。将二氯甲烷-甲醇(6∶4)洗脱部分经反相ODS色谱分离(分离条件：色谱 柱内径2cm，柱内填料高40cm；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱)，53％的(甲醇-水)洗脱 部位经冷冻干燥，得到青葙苷K化合物0.13g；

4、结构鉴定：利用光谱技术，包括红外、高分辨质谱、核磁共振以及酸水解-衍生化-高效液 相色谱法鉴定其结构。

实施例4：青葙苷K的制备方法2

1、提取：将5600g干燥青葙子药材粉碎后，加入药材重量10倍体积量的50％乙醇溶液冷浸 过夜，70℃加热回流提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得总提取物484g；

2、粗分：将上述提取所得总提取物，加入总提取物重量10倍量的水溶解后，按青葙子药材 与树脂质量比1∶1，经D-101型大孔吸附树脂，分别以水、20％乙醇溶液、70％乙醇溶液、 95％乙醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱4个保留体积，收集70％乙醇溶液洗脱部位，于60℃ 减压浓缩得粗提物114g；

3、精制：上述粗提物以粗硅胶(100～200目)拌样，经硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱(100∶1～1∶1)。将二氯甲烷-甲醇(6∶4)洗脱部分经反相ODS色谱分离(分离条件：色谱 柱内径2cm，柱内填料高40cm；以甲醇-水(10％～100％)梯度洗脱)，53％的(甲醇-水)洗脱 部位经冷冻干燥，得到青葙苷K化合物0.62g；

4、结构鉴定：利用光谱技术，包括红外、高分辨质谱、核磁共振以及酸水解-衍生化-高效液 相色谱法鉴定其结构。

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