三种拟青霉对何首乌的微生物转化

摘要

本发明涉及一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法。该方法主要包括：（1）三种拟青霉的制备；（2）三种拟青霉固体发酵培养基的制备；（3）三种拟青霉固体发酵培养；（4）三种拟青霉固体发酵培养物后处理。本发明所提出的利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法，培养物同时含有药用多糖、甘露醇、3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚，其中何首乌中主要成分二苯乙烯苷含量提高了20%。本发明操作简便，效果良好，可进行大规模推广应用。

说明书

技术领域

 本发明属微生物技术领域，具体是利用三种拟青霉对中药何首乌进行微生物转化的方法。 

  

背景技术

蝉拟青霉Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson、蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang、蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen & Dai是三种重要的药用真菌，其主要发酵产物是多糖、甘露醇、3ˊ-脱氧腺苷和腺苷等，具有免疫调节、治疗肾衰、抗肿瘤、抗炎症、调节内分泌、抗心律失常、延缓衰老、耐缺氧等方面的作用。 

    何首乌是一味传统的中药，为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的块根，性味苦、甘、涩、微温，为补益类中药，入肝、心和肾经。《本草纲目》记载何首乌“养血益肝，固精益肾，健筋骨，乌须发，为滋补良药，不寒不燥，功在地黄、天门冬诸药之上”。何首乌含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、磷脂类、糖类、多种氨基酸、多种维生素及微量元素等，具有抗衰老、增强免疫、降血脂、抗心肌缺血、改善脑缺血、神经保护、抗骨质疏松等作用。 

临床应用有生首乌和制首乌之别。生首乌因含有结合型蒽醌而具有轻度泻下作用，制首乌是生首乌炮制而成，在此过程中，结合型蒽醌可转变为游离型（彭晓波，中国现代药物应用，2008，2（19）：117)。所以，生首乌有小毒，而制首乌毒性甚微。杜晨晖等人利用毛霉和米根霉对何首乌进行微生物发酵，其目的主要是降低何首乌的毒性（杜晨晖等，天然产物研发与开发，2008，20：540-544）。本发明选用的材料是制首乌，应用三种药用真菌进行发酵，使培养物兼具微生物和中药的功效成分，提高治疗和保健的功效，是颇具发展潜力的研发领域。该发明主要是利用蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen & Dai、蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang和蝉拟青霉Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson对何首乌进行生物转化，一次发酵可同时获得药用多糖、甘露醇、3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚，其中何首乌中主要成分二苯乙烯苷含量提高20%。 

  

发明内容

    本发明提供一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌，同时获得拟青霉和何首乌活性成分，且提高何首乌主要成分二苯乙烯苷含量的方法。 

该方法的操作步骤如下： 

（1）生产菌株为蝉拟青霉Paecilomyces cicadae (Miquel.)Samson；蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang；蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen & Dai。

（2） 菌种制备：将步骤（1）所述菌株蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel.) Samson；蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang；蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen & Dai分别接种到PPDA斜面培养基，于20~25℃恒温培养7~10d，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5×10⁷个/毫升。 

（3）固体发酵培养基制备：固体培养基配方为何首乌粉30~40 g（制首乌粉碎获得）；蔗糖2 g；蛋白胨1 g；洋芋粉5 g；粗麸皮10~20 g，混匀，装入1000 ml三角瓶中，加入去离子水，使最终培养基的水料比为1.2 ：1，121 ℃高压灭菌30 min。 

（4）固体发酵培养：将步骤（2）中制备好的菌种分别按2.5 ml/瓶的量接入步骤（3）三角瓶固体培养基中，于10~25 ℃，静置培养20~30天。 

（5）固体发酵物后处理：将步骤（4）中培养好的固体发酵物取出，55 ℃恒温干燥至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量；HPLC法测定3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量。 

   本发明关键点在于：使用三种拟青霉对植物药材何首乌进行微生物转化，一次发酵过程同时获得药用真菌药效成分和何首乌药效成分，且明显提高何首乌中二苯乙烯苷含量。 

  

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。 

实施例1：不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响 

（1）菌种制备：将蝉拟青霉Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson；蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang；蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen & Dai接种到PDA斜面培养基，于23℃恒温培养10d，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5×10⁷个/毫升。

（2）固体共发酵培养基的制备：固体培养基的配方为何首乌40 g；蔗糖2 g；蛋白胨1 g；洋芋粉5 g；粗麸皮10 g，装入1000ml三角瓶中，水料比为1.2 ：1，121℃灭菌30min。 

（3）固体共发酵培养：将制备好的菌种分别按2ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于10℃和30 ℃，静置培养25天，（注：空白对照未接菌，其余条件相同）。 

（4）固体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的固体发酵物取出，55 ℃恒温干燥至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量；采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量；HPLC法测定 3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量，其结果见表1。 

表1不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响 

实施例2：不同培养时间对发酵产物有效成分种类和含量的影响

（1）菌种制备：将蝉拟青霉Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson；蛹草拟青霉Paecilomyces militaris Liang；蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen & Dai接种到PDA斜面培养基，于25℃恒温培养10d，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5×10⁷个/毫升。

（2）固体共发酵培养基的制备：固体培养基的配方为：何首乌30 g；蔗糖2 g；蛋白胨1 g；洋芋粉5 g；粗麸皮20 g，装入1000 ml三角瓶中，水料比为1.2：1，121 ℃灭菌30 min。 

（3）固体共发酵培养：将制备好的菌种分别按2ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于25℃，静置培养10~30天。 

（4）固体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的固体发酵物取出，55 ℃恒温干燥至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量；HPLC法测定腺苷、3ˊ-脱氧腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量，其结果见表2。 

        

表2不同培养时间对发酵产物有效成分种类和含量的影响