基于NMR的代谢物筛选平台

摘要

描述了使人们能够特异性测量特定分子在相对较少的细胞(例如原代细胞)中的代谢产物的方法。该方法牵涉任选与标记底物(例如通过

说明书

关于联邦资助研究的声明

本发明在国家健康研究所授予的R21AI087431下在政府帮助下进行。政 府具有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及基于NMR的筛选平台。

发明背景

细胞的代谢输出是限定该细胞类型的功能性基因组，转录物组和蛋白质 组网络的总和。代谢物组学是代谢物组中的代谢物水平及其由于刺激物而随 时间变化的全面且同时的系统性测定。虽然其它领域可以提供关于例如给定 基因，mRNA或蛋白质的拷贝数的信息；但是牵涉代谢物的化学过程的此研 究提供了所有异常基因，RNA，和/或蛋白质的下游总和。此“代谢指纹”代表 特定细胞类型中所有运行或非运行途径的瞬象。

已经使用几种分析方法，包括质谱术，层析，和NMR分光术来量化细胞 代谢物。质谱术和层析两者需要较小的样品量，并且可以容易适合于高通量 分析；然而，这两种方法都通常牵涉至少一个(若不是几个)纯化步骤。此外， 在大多数情况中，要检查的代谢物必须推理预选择。非靶向质谱术(untargeted  mass spectrometry)方法是可能的，但是需要几轮纯化和进一步鉴定方法。另 外，不是所有代谢物，包括核苷酸类类似物和脂质是容易可电离的，因此不 能通过质谱术检测。此外，源自质谱术的片段化样式不总是适合于区别诸如 具有相等质量，但不同结构的糖等分子，因此限制分析。

发明概述

本文中描述了一种快速的，无偏爱的，超高分辨率，定量NMR筛选平台， 其利用任何组合的下列任一种，两种，三种，四种，或所有五种技术：底物 的稳定同位素标记，光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态 范围数据重建的数据扩展，以产生定制的“NMR代谢物阵列”，其中将给定细 胞样品的所有已知代谢物的共振分类，并用于简化统计学分析的比较。这是 第一次组合所有这些技术来提供稳健的，有效的且高通量的NMR代谢物筛选 方案。步骤的组合容许水溶性和基于脂质的代谢物两者的全局的，无偏爱的， 超高的分辨率。另外，本文中描述的新颖“NMR代谢物阵列”程序提供了以简 化方式分析较大的复杂NMR数据集的新方式。该新平台同时容许差异表达的 代谢物的快速鉴定，特定代谢物的量化，和分析给定前体的代谢流量的能力。

新方法使人们能够特异性追踪特定分子在相对较少的细胞(例如约 200-2000万个细胞)中的代谢分解。该方法牵涉与经标记前体底物(例如用 ¹³C，或¹⁵N，或³¹P标记)一起预先加载细胞，并使用多维NMR。该方法不需 要在分析前纯化感兴趣的各个代谢物，所述分析容许具有不同特性的细胞中 差别生成的代谢物的全局，无偏爱鉴定。

正常和疾病状态细胞中差异表达的代谢物的鉴定可以是临床上的一种 有力的工具。用于监测来自表型上不同的细胞的代谢物的差异表达的新方法 特别可用于鉴定可以用于调控表型的治疗性靶物。这包括存在于代谢物的生 物合成途径中的靶物，或代谢物自身。此外，鉴定差异表达的代谢物可以用 于区别正常对疾病状态的细胞。因此，它们具有充当与其关联的表型的生物 标志物的潜力，使本文中描述的方法可用于鉴定诊断标志物，例如用于诊断 疾病的标志物。

另外，本文中描述了我们鉴定N-乙酰神经氨酸(NANA)作为乳腺癌肿瘤 启动细胞的新颖生物标志物，并且监测其表达可以用于诊断和检测乳腺癌。 另外，显示了CMAS(NANA生物合成中的一种酶)的蛋白质水平在乳腺肿瘤 启动细胞中显著过表达。在此工作前，尚未探索CMAS在肿瘤启动和转移中 的作用。在本文中，我们提供了如下的证据，即CMAS表达对于肿瘤形成和 迁移是绝对重要的，且CMAS是乳腺癌的一种新颖的真正靶标。

对个别患者的细胞分析应用此方法还会为用于患者护理的“个人化医 学”方法提供基础。

因而，本公开内容描述了用于监测细胞群体，例如原代细胞群体，组织 细胞群体，或培养细胞(例如永生化细胞)内的给定底物前体的代谢的方法。 描述了使用本文中描述的方法鉴定具有不同表型的两种或更多种细胞群体 间的差异表达代谢物。还描述了用于鉴定潜在的治疗靶物和诊断标志物的方 法。

一般而言，在第一个方面，公开内容特征在于在样品中监测给定类型细 胞内的底物代谢的新方法。该新方法包括(a)用底物将第一样品的给定类型 细胞培养足够的时间段，使得容许所述底物代谢分解成底物代谢物，其中任 选地用核磁共振(NMR)稳定同位素标记所述底物的至少一部分；(b)从步骤(a) 的细胞收获所述底物代谢物以获得底物代谢物的第二样品；并(c)对步骤(b) 的所述第二样品实施多维NMR以测定代谢底物的共振谱(resonance  spectrum)，其中所述共振谱代表所述底物的代谢物，且其中所述多维NMR 包含下列任一种技术：光谱宽度折叠(spectral width folding)，随机相取样 (random phase sampling)，非均匀取样(non-uniform sampling)，和增强动态范 围数据重建的数据扩展(data extension for enhanced dynamic range data  reconstruction)。

在另一个方面，公开内容特征在于用于鉴定第一细胞群体和第二细胞群 体之间的差异表达的底物代谢物的方法。这些方法包括(a)任选地，与核磁 共振(NMR)稳定同位素标记底物一起加载第一和第二细胞群体；(b)将步骤 (a)的所述第一和第二细胞群体培养足够的时间段，使得容许所述底物向底物 代谢物的代谢分解；(c)从步骤(b)的所述第一和第二群体细胞收获所述底物 代谢物以从所述第一和第二细胞群体中每种获得底物代谢物的样品；(d)对 所述第一和第二细胞群体中每种的步骤(c)的样品实施多维NMR以测定所述 第一细胞群体和所述第二细胞群体的代谢底物的共振谱，其中所述共振谱代 表所述底物的代谢物；并(e)比较所述第一细胞群体的共振谱与所述第二细 胞群体的共振谱以测定哪些共振是差异表达的，其中差异表达的共振提供代 表差异表达的代谢物的共振标记。

在这些方法之任一种中，多维NMR可以包括任何组合的下列任两种，三 种，或所有四种技术：光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动 态范围数据重建的数据扩展。在这些方法之任一种中，底物可以用NMR稳定 同位素标记，且多维NMR可以包括任何组合的下列任两种，三种，或所有四 种技术：光谱宽度折叠，随机相取样，非均匀取样，和增强动态范围数据重 建的数据扩展。

在这些方法的一些实施方案中，没有将存在于所述样品中的所述底物代 谢物与所述样品中的其他分子分开。在一些实施方案中，在与NMR标记底物 一起加载细胞前将细胞群体内的底物浓度降低一段时间，并使用为所述底物 定制的NMR脉冲程序或过滤技术或两者测定经标记的底物的代谢物的共振。 细胞群体内的细胞数目可以小于2X 10⁶，并且细胞群体可以是原代细胞群 体。

这些方法之任一种可以进一步包括比较步骤(e)的共振标记与已知共振 标记的数据库以测定所述共振标记代表的分子结构，由此测定所述第一和第 二细胞群体之间差异表达的底物代谢物。

在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括鉴定底物代谢物生成中牵 涉的生物合成途径，并鉴定途径中可以被靶向以调控所述代谢物的差异表 达，由此调控细胞表型的蛋白质/酶。在一些实施方案中，所述第一细胞群体 和所述第二细胞群体是同基因群体和/或所述第一细胞群体和所述第二细胞 群体具有不同表型。在一些实施方案中，所述第一细胞群体是对照细胞群体， 且所述第二细胞群体已经与测试化合物或药剂接触。可以使用所述方法鉴定 在特定细胞类型中活性过度或活性不足的代谢途径。所述方法可以进一步包 括抑制或过表达所述第二细胞群体中的基因，并且使用所述方法鉴定在细胞 中过表达或抑制基因的代谢结果。

在另一个方面，公开内容的特征在于用于治疗受试者中的癌症的方法。 该方法基于使用本文中描述的新平台方法测定的结果。治疗癌症的方法包括 对有此需要的受试者施用有效量的N-酰基神经氨酸胞苷酰基(citidylyl)转移 酶(CMAS)抑制剂，N-乙酰神经氨酸合酶(NANS)抑制剂，或降低N-乙酰神经 氨酸表达的分子。例如，抑制剂可以是酶或者可以选自下组：小分子，核糖 核酸，脱氧核糖核酸，蛋白质，肽，和抗体。

如本文中使用的，术语“同基因的”指从相同组织类型(任何组织，例如相 同器官、皮肤、膀胱、肝、心脏等的组织)及从相同生物体类型(例如人，或 动物，或鱼)分离的相同遗传背景的细胞(任何细胞类型，例如上皮细胞，或 脂肪细胞，或干细胞，或肌肉细胞等)。

如本文中使用的，术语“代谢物”指代谢的中间体或终产物。“代谢物”具 有包括对酶的能源，结构，信号传导，刺激，和抑制影响的功能。代谢物还 可以自身具有催化活性。代谢物可以是底物-酶反应的终产物。

如本文中使用的，术语“代谢前体”指参与化学反应的化合物。该术语意 图包括作为得到终产物的酶促反应的起始化合物或中间体化合物的化合物。

术语“底物”指酶对其起作用并且导致底物转化成一种或多种终产物的 分子或化合物。终产物从酶的活性位点释放。

术语“酶”指在其活性位点中接受底物，并且将底物转化成一种或多种终 产物，随后该终产物从活性位点释放的分子。

如本文中使用的，术语“原代细胞”或“原代组织”指从正常个体或具有获 得性或遗传性疾病的个体的活组织直接采集并且为了在体外生长而建立的 细胞或组织。

术语“转移”指癌症从其作为原发性肿瘤出现的地方扩散到身体的远离 位置及新建立的肿瘤自身的过程，所述新建立的肿瘤又称为“转移性肿瘤”， 其可以源自许多原发性肿瘤类型，包括但不限于前列腺，结肠，肺，乳腺， 骨，和肝起源的。例如，当从原发性肿瘤脱落的肿瘤细胞粘着血管内皮，穿 透到周围组织中，并且在与原发性肿瘤分开的部位生长，从而形成独立肿瘤 时形成转移。

术语“癌症”指具有自主生长能力的细胞。例子包括具有以快速增值细胞 生长为特征的异常状态或状况的细胞。该术语意图包括癌性生长，例如肿瘤 (例如实体瘤)；致癌性过程，转移性组织，和恶性转化细胞，组织，或器官， 与侵入性的组织病理学类型或阶段无关。还包括各种器官系统，诸如呼吸， 心血管，肾，生殖，血液学，神经学，肝，胃肠，和内分泌系统的恶性；及 腺癌，其包括恶性，诸如大多数结肠癌，肾细胞癌，前列腺癌和/或睾丸肿瘤， 非小细胞肺癌，小肠癌，和食管癌。“天然发生的”癌症包括不是通过将癌细 胞植入受试者中凭实验诱导的任何癌症，并且包括例如自发发生的癌症，通 过将患者暴露于致癌物引起的癌症，源自转基因癌基因的插入或肿瘤抑制基 因的敲除的癌症，和由感染(例如病毒感染)引起的癌症。术语“癌”是本领域 公认的，并且指上皮或内分泌组织的恶性。该术语还包括癌肉瘤，其包括由 癌瘤性和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”指源自腺组织或其中肿瘤细胞形 成可认识的腺结构的癌症。

如本文中使用的，术语“治疗”或“处理”指为了赋予治疗效果，例如为了 治愈，减缓，改变，影响，改善，或减少病症，其症状，或素因，对受试者 施用一种或多种本文中描述的化合物，该受试者具有用此类化合物可治疗的 病症，和/或此类病症的症状，和/或此类病症的素因。

如本文中使用的，术语“有效量”指对治疗的患者赋予治疗效果需要的活 性化合物的量。有效剂量会随治疗疾病的类型，施用路径，赋形剂使用，和 与其它治疗性处理的共使用的可能性而变化，如本领域技术人员认可的。

治疗性化合物的剂量，毒性，和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物 中通过标准药学规程(例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50 (在50％群体中治疗有效的剂量))测定。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治 疗指数，并且其可以以比率LD50/ED50表示。展现出高治疗指数的化合物是 优选的。虽然可以使用展现出毒性副作用的化合物，应当注意设计投递系统， 其将此类化合物靶向到受累组织的部位，以使对未感染细胞的潜在损伤最小 化，由此降低副作用。

除非另有规定，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的 普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中所描述的方法和材 料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明，下文描述了合适的 方法和材料。本文中提及的所有出版物，专利申请，专利，或其它参考文献 通过提及完整收录。在冲突的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。另 外，材料，方法和例子仅仅是例示性，而非意图为限制性的。

本发明的其它特征和优点从以下详细描述及从权利要求书看会是显而 易见的。

附图简述

图1是流程图，其汇总了本文中描述的基于NMR的代谢物筛选平台的关 键步骤。

图2A-F详述了NMR方法中的采集和处理的每个步骤，所述NMR方法容 许快速的，无偏爱的，超高分辨率代谢物序型分析(profiling)。图2A-2D证明 了光谱宽度(sw)折叠策略，其中将sw从220pm降低至90ppm导致分辨率升高 2.5倍。图2E汇总了非均匀取样(NUS)策略，其容许时间缩短40％中分辨率升 高4倍或分辨率升高8倍。图2F显示了使用正向最大熵重建(forward maximum  entropy reconstruction)处理的NUS 13C-1H HSQC谱(左侧)和在重建中包括将 分辨率提高2倍的数据扩展步骤后的相同NUS 13C-1H HSQC谱(右侧)。

图3A和3B分别是展示来自相同p53缺陷小鼠肺肿瘤的水溶性(3A)和基于 脂质的(3B)代谢物的全代谢覆盖的¹³C-¹H HSQC谱。

图4是流程图，其汇总了用于创建用于快速分析的NMR阵列的定制NMR 分析程序。

图5A-C是来自2000万个未标记的(5A)，¹³C-谷氨酰胺温育的(5B)和¹³C- 葡萄糖温育的(5C)乳腺肿瘤启动细胞的水溶性代谢物的一组¹³C-¹H HSQC共 振谱。

图6突出显示了本文中描述的NMR阵列中可得到的信息。使用图5A-C中 的未标记的，谷氨酰胺，和葡萄糖谱，创建主查找(master look up)以为所有 可能共振代谢物产生代谢物ID，并将这些在X轴上列出。Y轴显示每个条件 下每个共振的相对强度，突出显示差别的葡萄糖和谷氨酰胺衍生的代谢物。

图7A-B是乳腺肿瘤启动BPLER细胞(图7A)和恶性较小的同基因HMLER 细胞(图7B)中的水溶性葡萄糖衍生代谢物的¹³C-¹H HSQC共振谱的代表性例 子。

图7C汇总了BPLER和HMLER ¹³C-¹H HSQC共振谱的NMR阵列，显示了 所有可能的代谢物共振(X轴)的强度(Y轴)在每个细胞类型中如何变化。 BPLER和HMLER细胞起源于相同正常乳腺组织，并且培养成两种细胞类型， 即化学成分确定的WIT培养基中培养的BPEC(乳腺原代上皮细胞)和MEGM 培养基中培养的HMEC(人乳腺上皮细胞)。将BPEC和HMEC细胞用hTERT (L)，SV40早期区(E)，和H-ras(R)转化以产生BPLER和HMLER细胞。

图7D是NMR阵列预测为仅具有BPLER共振的区域中BPLER(红色)和 HMLER(蓝色)¹³C-¹H HSQC谱覆盖的区域的图像放大。

图8A-C汇总了用于确认BPLER NMR阵列中过表达的差异表达的代谢 物是N-乙酰神经氨酸(NANA)的各种方法。图8A是纯NANA的¹³C-¹H HSQC。图8B显示了定制NMR HCN(氢-碳-氮)实验的结果，其确认BPLER 细胞具有差异表达的共振，与NANA具有相似的连接性。图8C显示了M/S结 果，其使用液相层析-质谱法多反应监测(LC/MS MRM)直接测量HMLER(左 侧)和BPLER(右侧)细胞中的NANA，其中报告的数目是NANA峰下的面积。

图9是罗丹明标记的麦芽凝集素(WGA)免疫-荧光显微术的显微镜照片 的一系列表示，其分别显示HMLER(上排)和BPLER细胞(下排)中的NANA表 达。WGA特异性结合NANA。

图10是示意图，其描绘了将葡萄糖转化成NANA的酶促步骤，其中N-乙 酰神经氨酸合酶(NANS)和N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶(CMAS)是关键 的酶。

图11是柱形图，其显示了通过经由siRNA下调CMAS，NANS，和PLKI 对增殖的影响，对HMLER和BPLER细胞的存活力。

图12A-C是一系列图像，其提供了NANA对BPLER和HMLER细胞的细胞 迁移的影响的概述。图12A和12B各是一系列免疫组织化学图像，其分别在 HMLER和BPLER细胞中显示了在缺乏NANS和CMAS的情况下对细胞迁移 的抑制和用NANA对迁移的挽救。图12C是柱形图，其量化在缺乏NANS和 CMAS的情况中迁移细胞的数目及在添加NANS后的随后迁移。

图13A-B是柱形图，其描绘了HMLER和BPLER细胞中CMAS和cMYC的 定量PCR(mRNA水平)(13A)和对NANS和CMAS表达的Western印迹分析 (13B)。

图14A和14B是CMAS表达对细胞迁移影响的免疫组织化学图像。图14A 是过表达CMAS后HMLER细胞迁移的一系列免疫组织化学图像。图14B是 BPLER细胞和稳定CMAS敲低BPLER细胞(BPLER-shCMAS1)的一系列免疫 组织化学图像。

图15A-B汇总了测定CMAS水平对体内肿瘤启动和转移的影响的策略。 图15A显示了免疫方案，且图15B显示了在注射500,000个BPLER(左侧)或 500,000个BPLER-shCMAS1细胞的NOD/SCIN小鼠中后每天的肿瘤体积生 长。

图16A,16B,16C和16D分别是CMAS(基于NANA结构的合成的基于底 物的CMAS抑制剂)的酶机制和免疫组织化学分析，其显示了用合成的氟 -NANA抑制剂抑制细胞迁移。

图17A和17C是(2R,3R,4S)-4-胍基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)-2-((1R,2R)-1,2,3- 三羟基丙基)-3,4-二氢-2H-吡喃-6-羧酸(其是扎那米韦(Zanamivir)，以瑞乐砂 (Relenza)销售)(图17A)和乙基(3R,4R,5S)-5-氨基-4-乙酰氨基-3-(戊烷-3-基 氧基)-环己-1-烯-1-羧酸酯(其是奥司他韦(oseltamivir)，以达菲(Tamiflu)销售) (图17C)的化学结构。

图17B和17D显示了瑞乐砂对BPLER细胞迁移(17D)和对照(17B)的影 响的免疫组织化学分析。这两种药物都是神经氨酸苷酶抑制剂。

图18A和18B是显示了在存在和缺乏神经氨酸苷酶的情况中HMLER和 BPLER细胞中NANA表达的免疫荧光显微术图像(18A)和在存在和缺乏神经 氨酸苷酶的情况中HMLER和BPLER细胞迁移的免疫组织化学图像(18B)。

发明详述

本公开内容描述了新颖的方法，该方法提供了相对于已知NMR数据采集 的多个方面的益处，并且容许快速的，无偏爱的，全局的，定量超高分辨率 NMR数据采集和定制NMR分析，其利用新颖的办法进行。本公开内容描述 了新的NMR筛选方法，其可以用于鉴定，追踪，和表征特定分子的代谢分解 及用于分析对于给定细胞类型至关重要的细胞代谢物组学。本文中描述的方 法绕过已知NMR方案呈现的障碍，即实施数据采集必需的样品大小降低，消 除对要分析的代谢物的纯化的需要，多维NMR需要的实验时间缩短及获得代 谢物鉴定必需的高分辨率。该方法需要相对较少的细胞(200-2000万个)，其 容许该方法用于研究来自原代细胞和组织，而非仅来自细胞培养基的代谢 物。另外，公开的方法不需要在分析前从其它细胞代谢物纯化个别感兴趣代 谢物。此外，新方法容许显现给定前体在任何细胞类型中的特定代谢命运， 因此提供利用本文中也描述的新数据分析方法对不同细胞类型中差别生成 的代谢物的简化鉴定。

为了突出显示新平台方法的能力和宽度，本公开内容描述了鉴定与恶性 较小的同基因系HMLER相比高度攻击性的三重阴性乳腺癌肿瘤启动BPLER 细胞中的差异表达的代谢物。本领域中公知的是，癌细胞依靠消耗葡萄糖而 生长。葡萄糖代谢物N-乙酰基-神经氨酸(NANA)在本文中已经鉴定为在乳腺 癌肿瘤启动BPLER细胞中差异表达(即升高的表达)。生成代谢物的生物合成 途径也已经得到鉴定，并且用于将代谢物合成需要的蛋白质/酶鉴定为途径内 调控升高的肿瘤启动和转移潜力的表型的候选靶物。

另外，将生成关键酶NANS和CMAS的基因沉默的敲低实验的结果证明 了降低这些酶的正常功能以生成NANA并将其附着于蛋白质对BPLER细胞 的增殖没有影响，但是大大降低其迁移。另一方面，相同酶在HMLER细胞 中受迫的过表达提高其迁移。在BPLER细胞中稳定敲低CMAS完全阻止小鼠 中的肿瘤形成。因此，新方法成功用于鉴定对致肿瘤性重要的代谢物(例如 NANA)并且证明NANA和NANA合成中涉及的蛋白质可以充当治疗性干预 的靶物以降低乳腺肿瘤形成和肿瘤启动细胞的转移。另外，NANS和CMAS 确认为用于在体外和在体内抑制肿瘤启动和转移的靶物。因此，这些酶的小 分子和其它抑制剂是现在的候选治疗剂，其可以用于特异性靶向乳腺肿瘤启 动细胞。此外，差异表达的代谢物(例如NANA)也可以充当与其关联的表型 的生物标志物，容许本文中描述的方法用于鉴定新的候选诊断标志物。

通用方法

一般地，用于监测给定细胞类型内给定前体分子(即底物)的代谢物的本 文中所述新方法包括下列步骤：(a)任选地，与经标记的底物，例如经¹³C- 标记的底物一起加载细胞群体，(b)将步骤(a)的细胞培养足够的时间段，使 得容许底物代谢分解成底物代谢物(例如根据实验问题，通常为5分钟至24小 时)；(c)从细胞中收获底物代谢物以获得底物代谢物的样品，例如底物代谢 物的水溶性样品和基于脂质的代谢物的有机样品；并(d)对步骤(c)的样品实施 多维NMR以测定代谢底物的共振谱，其中共振代表底物代谢物的共振。下文 更为详细描述了如何实施多维NMR。

在这些方法中，可以使用各种底物和各种稳定的自旋-1/2核同位素标记 那些底物。例如，葡萄糖，谷氨酰胺，脂肪酸，氨基酸，丙酮酸盐，药物化 合物，和其它分子可以用作底物，并且可以使用稳定同位素，诸如¹³C,¹⁵N,²⁹Si, ³¹P等标记底物。任何组织，原代细胞或培养的细胞系可以用于分析，诸如癌 细胞，肌肉细胞，脂肪细胞，内皮细胞，上皮细胞，神经元细胞，心脏细胞， 等等。一般地，会想要测试与特定疾病或病症有关的细胞，诸如癌细胞，以 及来自健康受试者的相同细胞类型，以提供差异代谢分析。还可以测试具有 单一基因突变的细胞(即突变体细胞对野生型)或用药物处理或不处理的细 胞，或与前体一起温育多个时间的相同细胞。每份样品的细胞群体可以是同 质细胞群体。在备选的实施方案中，每份样品的细胞群体可以是异质细胞群 体(例如源自组织样品)。虽然本文中描述的方法中可以使用任何细胞数目， 在多个实施方案中，每个细胞群体内的细胞数目可以小于1X 10⁸，小于8x 10⁷，小于7x 10⁷，小于6x 10⁷，小于5x 10⁷，小于2.5x 10⁷，或小于2.0X 10⁷， 或细胞数目的范围可以为约1x 10⁶至1x 10⁸个细胞，或1x 10⁶至5x 10⁷，或1x 10⁶至2.5x 10⁷，或1x 10⁶至2.0X 10⁷。

用于加载细胞的方法是本领域技术人员公知的，例如可以将经标记的底 物添加至细胞培养基一段时间(例如5分钟至24小时)，或者可以通过转染(例 如脂质体或磷酸钙)，转导(例如经标记底物的病毒投递)或注入(例如对肿瘤 的直接注射)加载。在一个实施方案中，对受试者施用经标记的前体，例如 口服，表面，胃肠外，或静脉内。在一些实施方案中，对动物饲料添加经标 记的底物。

在多个实施方案中，在添加含有经标记的底物的培养基前，将细胞与缺 乏任何底物形式，例如缺乏未标记或标记的形式的底物的细胞培养基一起温 育。可以将细胞在此培养基中温育几分钟至几小时，基本上使细胞对该底物 饥饿。这有助于降低后来分析中的背景。然后，将细胞与仅含有经标记的底 物的细胞培养基一起温育(例如5分钟至24小时)。可以使用任何浓度的底物。 在多个实施方案中，浓度范围为1ng/ml至>1mg/ml。熟练技术人员可以通过 测试多个浓度范围容易地测定使用的最佳浓度。在温育后，将细胞短暂清洗， 并立即收获以分离代谢物。为了收获代谢物，可以实施简单的氯仿提取以获 得有机层中存在的代谢物的水溶性样品或非水溶性样品。不需要额外的纯 化。

几种核磁共振(NMR)技术可以在本发明的方法，优选多维NMR中使用。 例如，可以使用异核单量子相关(heteronuclear single quantum correlation, HSQC)分光术，HSQC的变型，和其它多维NMR技术。用于实施多维NMR(例 如2D NMR和/或¹³C-¹H HSQC NMR)的方法是本领域技术人员公知的。

可以使用NMR脉冲程序(其可以定制用于底物)测定经标记底物的代谢 物的共振谱。一般地，NMR使用静态的，同质的外部磁场来极化NMR样品。 此—次场通常称作“B0”场，并且它定义用于NMR系统的参照轴。如下在B0 场的方向磁化NMR样品，即将样品在B0场中放置一段时间(例如几分钟)，并 且容许样品达到热平衡状态。—次B0场也通常定义样品中的自旋-1/2核种类 的共振频率。例如，更强的一次场一般提高核自旋的共振频率。核自旋以其 相应的共振频率在B0场周围“旋进”。在大多数NMR系统中，核自旋具有射 频(rf)范围中的共振频率。

在NMR实验中，通过以核自旋共振频率应用时间变化磁场操作NMR样 品中的核自旋。在一些例子中(例如用于低翻转角(flip angle)脉冲)，高强度射 频(RF)脉冲提供核自旋的快速的精确控制。高强度RF脉冲具有较短的脉冲时 间的益处，其降低脉冲期间发生的脱散量。在一些例子中(例如用于高翻转 角脉冲)，高强度RF脉冲提供较小的精度，例如这是由于感兴趣的频率范围 里不均匀功率输出，由于RF场中的空间不均匀性，或者由于其他考虑。

在一些实施方案中，绝热脉冲可以对核自旋提供更精确的控制。绝热脉 冲通常具有较低的强度，并且需要较长的脉冲时间。在一些情况中，绝热脉 冲用于较大的翻转角脉冲(例如180度翻转角)以在感兴趣的整个频率范围里 提供更一致的翻转角。绝热脉冲通常是实施的成形脉冲(意味着它们具有时 间变化功率谱)，其可以在特定的翻转角，特定的频率范围等方面参数化。

在多个实施方案中，新的NMR方法包括使用下列任何一项或多项方法和 技术来提高分析速度和/或分辨率，或两者：(i)稳定同位素标记，(ii)折叠 谱宽度和混淆(aliasing)峰，(iii)随机相取样(iv)非均匀取样，和(v)数据扩 展。在一些实施方案中，方法包括任何组合的这些中的至少两种或三种方法。 在一些实施方案中，方法包括所有5种方法。下文表1汇总了每个步骤对NMR 采集和数据分辨率的影响。下文更为详细描述了这些步骤。

表1

稳定同位素标记

传统2-D NMR代谢物序型分析依赖于¹³C-天然丰度，其以1.1％存在。因 此，为了根本上观察任何信号，获得大量的样品(平均+2亿个细胞)。这将检 测限于培养的细胞系，并且仅检测最丰富的代谢物。为了降低需要的材料量 并且观察具有更宽浓度范围的代谢物，对样品(例如细胞，组织或肿瘤)直接 补充经¹³C标记的前体(使用葡萄糖，谷氨酰胺，丙酮酸盐和氨基酸，但是其 他底物和其它同位素也是可能的)。在理论上，这应当将样品负荷降低约99％。 若例如1mM代谢物需要2亿个细胞以用¹³C天然丰度检测，则使用标记物来查 看相同强度仅会需要200万个细胞。在我们的方法中包括此步骤将样品需要 降低至在一些质谱术(M/S)方法方面类似的样品需要。非靶向性M/S需要至少 100万个细胞，并且接着进行几轮层析纯化和检测。我们的方法需要较少的 细胞数目并且无需纯化。

折叠谱宽度和混淆峰

在将原子置于强磁场(B0)时，该分子中的电子在应用磁场的方向上旋 进。此旋进在原子核产生小的磁场。因此，核处的磁场(B)一般小于外部磁 场(B0)达τ。

B＝B0(1-τ)。

分子内每个核周围的电子密度随核的类型和分子中的键而变化。每个核 处的反向场及因此有效的磁场会变化。在脉冲式NMR分光术中，可以通过应 用射频脉冲测量这些差异，所述射频脉冲引起核磁化以振动诱导线圈中可以 测量的电流。相对于时间，将此信号(称为“自由感应衰减”(FID)绘图为流。 通过应用离散傅里叶变换，可以将FID转变成频域，并且每个可观察的核的 共振频率可以通过以下等式转化成化学位移(δ)，

δ＝(n-n_REF)x10^{^6}/n_REF

其中n是核的共振频率，且n_REF是标准品的共振频率。

化学位移是核周围的化学环境的非常精确的度量。与M/S和层析不同， NMR是可以区别具有相同质量但不同化学连接性的分子的单独方法之一。然 而，为了利用此信息，需要超高分辨率分光术。

在NMR中，通过扫探宽度(sweep width,sw)和数据点总数(TD)测定数字 分辨率，使得

分辨率＝sw/TD，其以Hz/点测量。

SW是要检测NMR信号的频率范围。代谢物混合物含有不同分子，并且 覆盖所有潜在碳化学位移必需的谱宽度跨越超过-220ppm。较大的¹³C-化学 位置窗产生进退两难的局面，其中为了具有最大的分辨率和足够宽的sw以涵 盖所有可能的化学位移，会需要大得难以置信的数据点数目。实际上，这是 时间禁止的。

为了避开这点，我们的方法可以包括折叠sw。有目的地将sw设置于较小 的范围，并且如果一些峰在此范围外部出现，那么它们会在混淆化学位移 (aliased chemical shift)处出现“折叠”。可以通过合适的数据处理技术展开折叠 谱。例如，可以通过扩展频谱，并将混淆频率移位预定义的量以其实际位置 解混淆(dealiase)共振频率。在一些情况中，数据采集参数以以下方式限定谱 折叠窗，该方式降低或最小化折叠谱峰和非折叠谱峰之间的任何重叠。因此， 在一些情况中，可以将折叠谱峰解混淆而不影响频率谱中的其它数据。折叠 谱降低需要的点总数以实现可能的最大分辨率。我们定制的折叠策略和解混 淆程序容许具有约44Hz/点分离的超高分辨率谱。

随机相取样

如上文描述的，将FID信号转化成频率数据需要傅里叶转化。然而，对 于在Z轴周围的+x磁化矢量旋转的核，傅里叶转化会在+ν和–ν两者处给出峰， 因为傅里叶转化不能区别矢量的+ν和–ν旋转。区别频率符号的最常见方法需 要在两个不同接收机相位(例如0°和90°)取样信号。对于多维NMR，对于每个 维度，这将实验时间增加两倍。为了提高我们分析的速度，我们采用随机相 取样(RPS)，其中使用单一相位检测每个点，但是相位对于信号中的不同点 是随机交替的。这容许我们解析频率的相位，但是将采集时间缩短一半。

非均匀取样和数据扩展

二维NMR技术在时间域中产生两个数据维度：直接域和间接域。通过运 行实验，并收集NMR信号(例如，FID，回波，或频闪观测仪信号)产生直接 域数据。换言之，直接域是NMR实验的时间域。通过系统性改变NMR实验 的时间参数(例如增加延迟时间)，对每个参数数值运行NMR实验，并且组合 来自所有实验的NMR信号产生间接域数据。换言之，间接域是系统性改变的 参数的时间域。

在一些情况中，非均匀取样可以在用于本文中描述的方法的多维NMR 中使用。例如，可以在间接域中使用非均匀取样以减少获得特定谱范围和频 率分辨率需要的NMR实验数目。

非均匀取样(NUS)可以通过以系统性且以非均匀方式增加间接域时间参 数来实现。特别地，代替每个连续NMR实验将时间参数增加相同的量，可以 将时间参数增加随一个或多个因素变化的量。例如，可以将时间延迟参数增 加在实验与实验间变化(例如增加或减少)的量。依照泊松分布(Poissonian  distribution)或另一种非线性分布改变时间延迟导致稀疏取样的间接域数据。 可以使用重建方法计算“稀疏”数据集中缺少的点。正向最大熵重建技术可以 保存测量的时间域数据点，并且通过迭代过程猜测缺少的数据点。该迭代过 程可以包括稀疏时间域数据集的离散傅立叶转化，谱熵的计算，多维熵梯度 的测定，和用共轭梯度方法计算缺少的时间域数据点的新数值。由于此方案 不改变测量的数据点，其可以以较高的保真度再现信号强度，并且避免动态 范围问题。在一些情况中，我们的方法指示凭借合适的取样日程表，NUS具 有增强的检测弱峰的能力。这对于代谢物分析是极其重要的，其中丰富的代 谢物(毫摩尔浓度)和罕见的代谢物(纳摩尔浓度)之间存在有较大的动态范 围。

在重建过程中，有可能利用“数据扩展”进一步提高共振的分辨率。在此 方法中，在重建过程中，间接维度中的点总数是加倍的。在一个实施方案中， 依照标准正向最大熵方案解析时间域的第一个半份(由NUS取样点组成)，并 且使用迭代软件阈值法完全建立不含任何取样点的数据的第二个半份。在一 些情况中，这容许分辨率增加2倍而不影响采集时间。

任选的用于降低背景的增强

一般地，在使用本文中描述的方法时，不需要从样品中的其它分子纯化 或分离存在于样品中的底物代谢物(例如通过层析柱(例如Sidelmann等 Purification and 1H NMR Spectroscopic Characterization of Phase II metabolites  of Tolfenamic Acid Drug Metab Dispos June 1,199725:725-731)或通过本领域 技术人员公知的其它手段)。因此，在典型的实施方案中，NMR前的方法中 实施的唯一纯化是将代谢物分成水溶性样品或非水溶性样品。

在一些实施方案中，可以将细胞内未标记底物的浓度降低一段时间(例 如10分钟至4小时)，之后添加经标记的底物。此技术可以帮助降低背景信号。 可以通过与没有与经标记的底物一起加载的对照细胞相比测试一批条件并 监测背景测定合适的时间范围。

自动化NMR分析

NMR代谢物分析是沉闷且复杂的。为了避开这些问题，创建定制的 “NMR代谢物阵列”程序以使该过程自动化。如图4中显示的，首先将谱自动 定相，比对，并相对于掺入对照(spike-in control)标准化。例如，可以将已知 材料，诸如4,4-二甲基-4-硅戊烷(silapentane)-1-磺酸(DSS)，四甲基硅烷 (TMS)，三甲基甲硅烷基丙酸酯(trimethylsilyl propionate,TSP),4,4-二甲基-4- 硅戊烷-1-铵三氟乙酸(DSA)或其它NMR标准参照化合物添加至每份样品中， 并且其浓度用作参照以实现样品间的相对量化比较。接着，使用定制自动化 峰挑出程序，可以对每份样品产生峰列表，其中将每个共振峰转化成具有强 度数值的X,Y坐标。然后，可以运行“主要峰列表(MASTER PEAK LIST)”程 序，其对所调查的谱中的所有共振产生“主”查找表。此程序从各个峰列表文 件读出所有X，Y点，除去限定容限(tolerance)内的重复，并且将所得的峰组 写到标准输出，使得测定调查的所有可能的代谢物共振。根据分析，有可能 将来自人代谢物数据库的整个HSQC数据输入主要峰列表(master peak-list)。 然而，采用此方法需要较长的计算时间，并且在大多数情况中是不必要的。 因此，为特别调查的谱创建主查找表是优选的。

如图4中进一步显示的，在创建主查找表后，接着为每个样品生成“NMR 阵列”。NMR阵列由一批所有可能的代谢物和调查的每个共振的强度数值组 成。它们通过组合各个测试峰列表和主要峰列表以填写所有可能代谢物的共 振强度创建。若代谢物在测试样品中表达，则程序会选择所述强度数值。若 它不存在，则强度被设为0或任意数字。然后，可以通过传统的统计学分析 程序分析NMR阵列以鉴定谱间的差异表达共振。然后，可以将共振频率直接 上载到数据库，诸如人代谢物组数据库，以鉴定哪些代谢物是差异表达的。 然后，可以通过其他NMR或M/S实验确认候选代谢物。

差异表达分析

本文中还提供了用于鉴定由至少两个细胞群体(例如第一细胞群体和第 二细胞群体)差异表达的底物代谢物的新方法。一种细胞群体可以来自健康 受试者或细胞系并用作对照。所述方法可以使用本文中描述的各种方法步骤 和技术的各种特征并且包括：(a)与经标记的底物(例如经¹³C，¹⁵N，或³¹P-标 记的底物)一起加载第一和第二细胞群体；(b)将步骤a)的第一和第二细胞群 体培养足够的时间段以容许经标记的底物代谢分解成底物代谢物；(c)从步骤 (b)的第一和第二群体细胞收获底物代谢物以从第一和第二细胞群体中每种 获得底物代谢物的样品，(d)对来自第一和第二细胞群体中每种的样品实施 多维NMR以测定代谢底物的共振谱，其中共振谱代表底物代谢物；并且(e) 使用定制“NMR阵列”程序处理共振谱，(f)比较第一细胞群体的共振强度与第 二细胞群体的共振谱以测定哪些共振谱是差异表达的，其中差异表达的共振 谱代表差异表达的代谢物。

在一些实施方案中，用于鉴定在至少两个细胞群体间差异表达的底物代 谢物的方法可以进一步包括比较步骤(f)的共振谱与已知共振谱的数据库以 确定共振谱代表的分子结构，由此测定哪些特定的底物代谢物是第一和第二 不同细胞群体之间差异表达的。可以以此方式鉴定特定代谢物。

本文中描述的方法可用于监测任何细胞类型及任何组织(例如细胞群体 可以含有异质细胞群体)中的代谢，并且可用于与不展现表型的细胞相比监 测展现任何表型的细胞中的代谢。

诊断应用

鉴定的差异表达的代谢物指示不同表型，因此，其表达可以用于诊断此 表型，例如以诊断升高的转移潜力，或诊断胰岛素抗性，或诊断疾病，等等。

我们发现N-乙酰神经氨酸(NANA)在乳腺癌肿瘤启动细胞中更高度表 达。从诊断观点看，过量NANA的存在可以充当致瘤性潜力的生物标志物。 在观察到此类差别表达后，可以利用检测方法诸如抗体或质谱术监测NANA 表达(例如胞内或胞外)以帮助鉴定侵入性肿瘤。总之，对乳腺癌细胞使用本 文中描述的方法，追踪葡萄糖的特定分解，并且发现NANA在更为恶性的细 胞中是广泛上调的。在NANA生物合成中将酶鉴定为新的治疗性靶物，并且 发现分子的表达水平与升高的迁移潜力相关联。

也可以将新方法应用于患者生物流体(例如血液，尿液，血浆，和组织 样品)以发现可以充当特定疾病的新颖生物标志物的代谢差异。

测定候选治疗剂的方法

在多个实施方案中，用于鉴定在至少两个细胞群体间差异表达的底物代 谢物的方法可以进一步包括如下的步骤：鉴定底物代谢物生成中牵涉的生物 合成途径，并且鉴定途径中可以被靶向以调控代谢物的差异表达的蛋白质/ 酶。继而，这些蛋白质和酶可以充当用于调控细胞表型，例如疾病表型，转 移潜力，或抗性的候选靶物。因此，新方法提供了鉴定治疗剂的手段。在鉴 定代谢物并对给定样品创建NMR代谢物阵列后，可以筛选生物合成途径的数 据库以鉴定代谢物的合成途径。

例如，可以将NMR代谢物阵列与人代谢物组数据库和/或ChemPub电子 连接，以选择代谢物生物合成途径内可能的治疗性靶物，并提出基于底物的 抑制剂，其使用代谢物自身作为药物设计的前导支架进行。在本文中已经鉴 定并描述了可以充当生物标志物的一系列差异表达的代谢物。还已经鉴定出 生物合成途径内的新颖治疗性靶物及在实验室中显示效力的得到FDA批准 的药物，其可以快速转化成临床上的新应用。

本文中描述的各种方法中使用的细胞群体可以来自健康或患病受试者。 细胞可以来自同基因群体。在一些实施方案中，第一细胞群体和第二细胞群 体具有不同表型(例如转移潜力不同，对胰岛素的响应不同，或疾病基因的 表达不同)。任何表型中表达的差别的代谢物可以与不展现该表型的同基因 细胞相比评估。表型是本领域技术人员容易鉴定的，并且包括但不限于与特 定疾病或病症有关的表型。

在一些实施方案中，第一细胞群体是对照细胞群体，而第二细胞群体已 经与测试化合物或药剂接触(例如在用化合物或药剂处理后)。与特定表型有 关的差异表达的代谢物的消失充当指示物，即测试化合物或药剂能够抑制表 型，例如抑制转移，或抑制患病基因表达的效果。或者，差异表达的代谢物 (例如与患病细胞形成对比仅仅在正常细胞中表达的代谢物)的出现充当指示 物，即化合物或药剂可用于治疗疾病。因此，在多个实施方案中，可以使用 用于鉴定差异表达的代谢物的方法筛选调控表型的化合物或药剂，其可以用 于治疗疾病。

可以使用本文中描述的新方法鉴定过表达或抑制感兴趣基因的代谢后 果。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在一个细胞群体(例如第二细 胞群体)中抑制或过表达基因。类似地，也可以鉴定特定化合物或药剂的代 谢后果，例如以评估毒性。

测试化合物或药剂可以是例如小分子，核酸RNA(例如siRNA或 microRNA)，核酸DNA，蛋白质，肽，或抗体。抑制剂可以选自下组：小分 子，核酸RNA(例如siRNA)，核酸DNA，蛋白质，肽，和抗体。在一个实施 方案中，抑制剂是酶抑制剂(或神经氨酸苷酶抑制剂)。

用治疗剂治疗病症的方法

如下文实施例中描述的，通过本文中描述的方法，CMAS，NANS(又称 为唾液酸合酶)，和NANA细胞表面表达已经测定为降低癌细胞迁移并在体外 阻止肿瘤启动的治疗性靶物。如此，在另一个方面，本公开内容包括用于在 受试者中治疗病症诸如癌症(例如通过抑制转移和/或阻断肿瘤启动)的新方 法，其通过施用有效量的使用本文中描述的新方法发现的靶物抑制剂进行。 特别地，所述方法包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的CMAS或 NANS抑制剂，或治疗有效量的降低NANA表达的抑制剂或药剂。例如，我 们已经鉴定出候选CMAS抑制剂，包括我们设计并合成的称作F-NANA的分 子，并且已经得到FDA批准的流感药物，包括瑞乐砂和达菲。这些药物在体 内小鼠模型中的效力在测试中，并且由于已经在人受试者中对瑞乐砂和达菲 评估安全性，研究的新药的FDA批准加速是有可能的。

将新方法应用于个体化药物

如提及的，已经成功显示本文中描述的新方法在使用细胞系和原代肿瘤 两者的几种肿瘤学模型中表征代谢差异。所述方法具有深刻影响用于设计新 治疗性干预的策略的潜力，并且可以为“个体化药物”的基于代谢物的方法铺 设基础。

依照国家健康研究所，“个体化药物”是使用个体的遗传概况指导就所述 个体中的疾病的预防，诊断和治疗而言做出的定制决定的医学实践。至今， 大多数工作依赖于基因组信息以鉴定DNA突变，扩增，或缺失。然而，罕见 地，疾病是单一遗传损伤的结果，并且遗传变异如何表现自身经常是不明显 的。然而，非遗传变化，包括表遗传差异对基因表达和细胞特性也可以具有 深远的影响。此外，许多通常突变的基因(诸如在癌症中)没有小分子抑制剂， 并且经常称作“无可给药靶物”。用本文中描述的方法在患有疾病的个体中建 立关键细胞的代谢概况可以提供可用于诊断，治疗和监测个体的疾病状态的 有力信息。

如记录的，疾病是复杂得难以置信的且异质的，并且一种或多种误调节 (misregulated)的效果不总是明显的；这使得难以设计对于干预最佳的治疗策 略。另一方面，代谢是基因组的终产物。使用本文中描述的新平台，特定患 者中的代谢差异可以快速突出显示所述个体中的运行或非运行途径。此外， 已经广泛研究代谢途径，并且在代谢酶抑制剂的许多情况中，此类抗代谢物， 即携带与天然代谢物的接近结构相似性的物质已经存在，并且已经用于临 床。在下文实施例中还详细呈现了基于差异表达NMR分析的此类潜在治疗发 现的例子。例如代谢物的前述差异表达可以是用于按个体定制基础诊断，监 测，和治疗患者中的疾病的有力工具。本文中描述了使用此方案分析以推断 新代谢途径和野生型和疾病组织之间的差别代谢物表达的例子。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，实施例并不限制本发明的范围。

以下实施例讨论新方案和随后的新颖分析方法，其用于有效测定正常和 疾病状态组织中的代谢物差异表达。本文中描述了此类差异表达的结果，并 且显示了在潜在小分子治疗剂的设计和鉴定中利用。

实施例1：利用NMR的筛选平台的方法

生物学样品的制备：图1提供了平台的总体描述。对于每份样品使用约 2000万个细胞(然而，有可能使用少达200万个)。在收获前，将经¹³C标记的 前体(在这些实施例中为葡萄糖和谷氨酰胺)直接添加到培养基，并容许温育 使用者限定的时间量且在此情况中为4小时。在抽吸培养基并用磷酸盐缓冲 盐水(PBS)清洗两次后，将细胞再次计数并收集。还收获相等数目的没有标 记物的细胞以充当¹³C背景对照。通过添加冰冷甲醇裂解细胞，并通过添加 相等份的水和氯仿实施水性提取。在离心后，将水溶性和有机代谢物分开收 集，干燥，并贮存，直至准备好进行进一步分析。不实施额外的纯化。

用NMR采集数据：主要采用2D NMR分光术，其依赖于异核单量子相关 (HSQC)鉴定代谢物。HSQC实验提供异核(在以下实施例中为¹³C，尽管其他 同位素是可行的)和质子之间的单键关联。交叉峰(crosspeak)由于通过相对较 大的单键异核偶联转移而出现，使得有可能鉴定直接附着的核的移位。与质 子成对的每个碳原子的独特化学环境引起给定代谢物特异性的特征性化学 位移。使用纯化的代谢物(通常可获得)的参照HSQC谱进行比较。例如，目 前，人代谢物组数据库(HMDB)含有关于40,260中代谢物条目的信息，许多 具有HSQC数据。

为了克服2DNMR代谢物序型分析的传统缺点(较大的样品需要和较长 的采集时间)，使用几种另外的技术改善分辨率并缩短分析需要的时间。如 上文描述的，在第一步中，为了减少需要的材料的量，给细胞补充经¹³C标 记的前体(使用葡萄糖，谷氨酰胺，丙酮酸盐和氨基酸，但是其他底物和其 它同位素也是可能的)。在理论上，这应当将需要的细胞数目减少约100倍。 部分由于不同的离子强度，这不总是完全线性衡量，并且如果没有关于样品 大小的约束(即使用细胞系)，本文推荐使用约200-2000万个细胞进行每次分 析。

实施例2：快速超高分辨率NMR数据采集

折叠谱：虽然前述样品制备减轻对样品量的物理需要，但是记录高分辨 率2D NMR分光术需要的长采集时间仍然是一项忧虑。为了对抗这点，采用 多方面(multi-prong)方法：“折叠”谱宽度，使用随机相取样(RPS)，在分析中 实施非均匀取样(NUS)技术和数据扩展。

如上文描述的，谱宽度(sw)是要检测NMR信号的频率范围。代谢物混合 物含有不同分子，并且覆盖所有潜在碳化学位移必需的谱宽度跨越超过-220 ppm。在图2A中，显示了KRAS突变体胰腺癌细胞中所有水溶性代谢物的 HSQC谱。在此情况中，13C-sw跨越220ppm，并且收集总共1024个点。通 过解析等式分辨率＝SW/TD(其中TD是总数据点)，我们观察到分辨率限于约 107Hz/点。然而，如果你更近地检查图2A，大多数代谢物沿着对角线运行， 并且大部分谱是空的。沿着整个sw收集点大大降低分辨率，并且由于采集时 间是分辨率的倒数，实验时间也被浪费。因此，我们逐渐降低sw以提高分辨 率。图2B显示了具有140ppm sw且因此约68Hz/点分辨率的相同样品的 HSQC，图2C显示了具有110ppm sw且因此54Hz/点分辨率的相同样品的 HSQC，而图2D显示了具有90ppm sw的相同样品的HSQC，其产生约44Hz/ 点的超高分辨率。在每个折叠谱中，混淆峰是可容易鉴定的，并且真正的化 学位移可以是使用以下等式(δobs＝δ+sw)倒退测算。值得注意的是，由于 C-C标量耦合所致的最大分辨率是约35Hz。使用我们的折叠策略，我们能获 得超高分辨率谱。

值得注意的是，为了在较大的碳谱宽度间均匀提供最佳翻转角，对于沿 着碳通道的所有180度脉冲，利用宽带绝热成形脉冲。这对于实现标量耦合 旋转间有效的相干转移(coherence transfer)是特别重要的。

非均匀取样和数据扩展：NMR样品的测量“自由感应衰减”(FID)通过由 所有磁化键的旋进产生的振荡电流产生。此信号由于产生自旋-自旋脱散的 其它分子中的核而衰减。这发生的速率称为横向松弛速率(T2)。对于任何 NMR实验，广泛观察到为了获得最大分辨率，应当收集接近1.2*T2的间接维 度的点。然而，代谢物以平均10^-12至10^-11秒的分子运动相关时间快速运动。 由于此快速运动，对于许多代谢物，存在有较少的自旋-自旋脱散，并且T2 率几乎是无限长的。因此，收集超高分辨率代谢物数据在理论上是可能的， 但是实际上，它会需要极长的测量时间，并且在大多数实验中，仅收集数据 子集，这为速度牺牲分辨率。

通过图2E中概述的采用非均匀取样(NUS)技术，我们不仅能够大大提高 我们数据的分辨率，而且还提高我们记录高分辨率谱的速度。例如使用相同 样品，我们可以在5小时中以X分辨率实施具有128个间接点的均匀取样实验， 使用NUS，我们可以收集1024个点的10％且在等同时间中以生成具有8X分辨 率的谱，或者，我们可以取样512个点的10％，将分辨率提高4X并将采集时 间缩短约40％。

选择泊松-缺口分布(Poisson-gap distribution)用于取样日程表，接着是正 向最大(FM)熵重建。代谢物混合物含有各种浓度的分子，并且这已经显示为 检测弱峰中最有效的方法。另外，为了进一步增强我们的分辨率，我们创建 “数据扩展”附加，其中在重建前，将间接维度中的点的总数人工加倍。依照 FM重建使用稀疏取样的数据并填写缺少的点重建NUS数据集的第一个半 份。使用迭代软件阈值法完全建立数据的第二个半份。如图2F中显示的，这 将我们的分辨率提高2倍而不影响采集时间。

水和有机层中代谢物的分析：虽然没有必要遵循每个步骤，此方法容许 水溶性或有机代谢物两者的全代谢概况。图3显示了来自相同的约200万个 p53缺陷肺癌细胞的基于水的代谢物(图3A)和基于有机的代谢物(图3B)的 HSQC，并且每个实验仅需要1小时的采集时间。对相同样品量使用13C天然 丰度和标准NMR技术得到的等同谱会需要几天。这两个谱是极好解析的，使 得容易鉴定代谢物共振峰。重要的是，许多M/S方法努力精确检测脂质，使 用我们的方法，如图3B中显示的，来自有机分子的共振是可容易鉴定的。

实施例3：分析代谢物NMR数据

NMR分析：如图4中汇总的，创建定制的“NMR代谢物阵列”程序以自动 化NMR分析过程，其使用本文描述的方法进行。首先，将谱定相，比对，并 用内部对照换算。将1mM4,4-二甲基-4-硅戊烷(silapentane)-1-磺酸(DSS)添加 至每个样品中，并且其浓度用作参照以容许要生成的样品间的相对量化比 较。我们创建自动峰挑出程序以对每个样品产生峰列表，其中将每个共振峰 转化成具有强度数值的X,Y坐标。接着，我们创建“主要峰列表”程序，其对 研究的谱中的所有共振产生“主”查找表，虽然运行该程序。

简言之，此程序从各个峰列表文件读出所有X,Y点，除去限定容限 (tolerance)内的重复，并且将所得的峰组写到标准输出。根据分析，有可能 将来自人代谢物数据库的整个HSQC数据输入主要峰列表(master peak-list)。 采用此方法需要较长的计算时间，并且在大多数情况中是不必要的。为特别 调查的谱创建主查找表是优选的。

接着，对每份样品生成NMR阵列，其中通过组合各个峰列表和主要峰列 表以填写所有可能代谢物的共振强度。若代谢物在测试样品中表达，则程序 会选择所述强度数值。若它不存在，则强度被设为0或任意数字。现在可以 经由传统统计学分析程序分析NMR阵列以鉴定谱间的差异表达共振。然后， 可以将共振频率直接上载到人代谢物组数据库，以鉴定哪些代谢物是差异表 达的。然后，可以通过其他NMR或M/S实验确认候选代谢物。

实施例4：差异表达的代谢物的分析：新的方法

背景修正：为了监测给定前体的流量，记录在无标记前体情况下用相同 数目细胞得到的不同谱。来自未标记细胞的谱代表细胞内的¹³C背景，并且 可以将其从测试谱扣除以特异性追踪¹³C经标记的底物的代谢分解。

葡萄糖和谷氨酰胺是细胞内的两种主要能源，并且每种前体的代谢分解 是充分表征的。为了检查葡萄糖和谷氨酰胺对特定途径的流量，记录在无标 记前体和添加¹³C-谷氨酰胺或¹³C-葡萄糖作为底物的情况下相等数目的乳腺 肿瘤启动细胞的¹³C-¹H HSQC谱。如在此有限细胞数目情况下的图5A中显示 的，非常少的信号源自¹³C背景，并且谷氨酰胺(5B)和葡萄糖(5C)谱是非常不 同的。通过创建NMR阵列，我们能够将复杂的NMR数据转化成标准的文本 文件。从谷氨酰胺或葡萄糖阵列中的匹配信号扣除未标记样品中的共振的强 度数值。如图6中显示的，通过绘制来自NMR阵列的强度数值和共振代谢物 ID，有可能经由给定样品鉴定对葡萄糖或谷氨酰胺流特异性的变化。X轴对 从图6b和图6c的HSQC谱鉴定的每种代谢物列出所有共振代谢物id。Y轴突出 显示每个共振的强度在每个条件中如何变化。如预期的，清楚的是谷氨酰胺 和葡萄糖因为对不同代谢途径的流动。共振代谢物ID对应于特定的¹³C-¹H化 学位移，其可以上载到人代谢物组数据库以鉴定差异的代谢物。

实施例5：鉴定三重阴性乳腺癌肿瘤启动细胞中的差异表达代谢物

方案：起源于相同的正常乳腺组织，将BPLER和HMLER细胞用相同的 遗传因素转化，但是在不同培养基中增殖。BPLER是高度致瘤性的，并且相 对于HMLER细胞具有升高的转移潜力。注射到小鼠的乳房脂肪垫中的小于 50个BPLER细胞导致肿瘤形成，而需要超过10^{^6}个HMLER细胞在体内形成肿 瘤(下文表2)。BPLER细胞是三重阴性乳腺癌肿瘤启动细胞的模型细胞系，并 且BPLER肿瘤在组织学上类似于三重阴性乳腺癌患者的。依照方案，将约 2000万个BPLER和HMLER细胞在均匀标记的¹³C-葡萄糖的存在下培养，随后 收获并裂解。然后，将水层收集，干燥，并在超纯D2O中再溶解，并且准备 好进行NMR分析。将有机层贮存，用于未来检查。

表2

使用本文中描述的新平台方法，实施快速的，无偏爱的，超高分辨率的 NMR代谢物筛选。图7A和7B中分别显示了BPLER和HMLER细胞的所得 ¹³C-¹H HSQC的例子。

结果：使用我们的定制NMR分析程序，将每个谱中的共振转化成NMR 阵列。图7C汇总了信息。通过组合来自两种细胞系的所有重复，鉴定出约 ～2100个共振。在X轴上列出每个共振的代谢物ID。在y轴上绘制每个共振的 相对强度。通过此分析，我们观察到每个细胞系的代谢物共振间的高度相似 性(>75％的共振存在于这两种细胞系中)。然而，这两个细胞系共同的几个共 振峰具有不同表达，虽然一些峰对于HMLER细胞是独特的，而其他对BPLER 是特异性的。为了确认阵列精确反映HSQC数据，如图7D中显示的，将在NMR 阵列中预测为具有对BPLER细胞特异性的共振的HSQC谱的区域扩展，并且 实际上，仅在BPLER谱中找到共振。

使用NMR阵列，我们能够快速鉴定在BPLER肿瘤启动细胞中特异性富 集的共振。表3突出显示了BPLER肿瘤启动细胞中最富集的最高共振。显示 了来自阵列的代谢物ID及相应的¹³C-¹H数据。

表3

代谢物共振ID 13C 1H 589 62.993 3.842 1951 65.98 3.823 283 68.633 4.248 1381 69.973 4.002 402 42.028 2.193 1602 72.951 3.739 245 72.849 3.953 1333 42.015 1.814 119 106.501 6.151

将这些共振输入人代谢物组数据库，并且9个共振中以黄色突出显示的6 个预测为来自N-乙酰神经氨酸(NANA)，强烈提示NANA是与NMR阵列中鉴 定的差异表达的共振对应的代谢物。

采用几个额外的步骤以确认NANA的确是在BPLER肿瘤启动细胞中上 调的。首先，图8A中显示的纯NANA的¹³C-¹H HSQC在与发现在BPLER谱中 过度呈现的那些峰大致相同的位置含有交叉峰。其次，我们设计定制NMR 脉冲程序以特异性检查NANA。在NANA生物合成中，将葡萄糖的C2和谷氨 酰胺的氮原子连接以形成碳-氮键。因此，将BPLER细胞与¹³C-C2葡萄糖和 ¹⁵N-谷氨酰胺一起温育，并记录HCN实验以检测代谢物共振，其含有氢，与 其连接的碳，也与该碳连接的氮原子(HCN)。在此实验中，如图8B中显示的， BPLER细胞在与NANA标准品中会预期的位置相同的位置处含有差异表达 的共振。最后，图8C中显示的质谱术实验通过使用负模式的电喷雾实施多反 应监测LC/MS确认NANA在BPLER肿瘤启动细胞中高约7倍。报告数值是每 个细胞系中的NANA表达的曲线下面积。

使用差异表达的代谢物的结果开发诊断学：通过追踪BPLER细胞内的葡 萄糖流量(即扣除背景¹³C，并追踪葡萄糖的特异性分解)，观察到肿瘤启动细 胞将其葡萄糖代谢的一部分转向到NANA生成。NANA是9-碳糖，其经常掺 入糖蛋白的细胞表面上。先前的报告鉴定出麦芽凝集素(WGA)对经NANA修 饰的蛋白质具有强烈的亲和力。使用经罗丹明标记的WGA，我们实施图9中 显示的免疫-荧光显微术，并且观察到BPLER细胞在其细胞表面上具有升高 的NANA表达。因此，NANA自身代表特异性诊断乳腺肿瘤启动细胞的新诊 断，并且WGA及特异性识别NANA和NANA修饰的分子的相似分子可以提供 检测并分离肿瘤启动细胞或具有升高的恶性潜力的细胞的新工具。

实施例6：利用差异NMR数据鉴定靶物

NANA是一种经常掺入细胞表面蛋白中的糖。图10中显示NANA是通过 约15种不同酶，包括关键的酶NANS和CMAS从葡萄糖衍生。使用CelTiterGlo (一种公知的细胞存活力测定法)，观察到NANS或CMAS的敲低对细胞的细胞 存活力或增殖具有很少的影响至没有影响(图11)，而PLK1酶的敲低导致全部 细胞死亡。

然而，NANA被掺入牵涉细胞粘着的几种蛋白质的细胞表面上，并且怀 疑NANA损失影响细胞运动性。使用细胞迁移测定法，将细胞在双室中培养， 所述双室在上部室的底部含有小孔，恶性细胞(尤其是那些具有转移性潜力 的)能够迁移通过孔并形成集落。如预期的，图12中显示了BPLER与HMLER 细胞相比由于其升高的致瘤性特性而具有增加的迁移率。然而，NANS或 CMAS的敲低完全消除细胞迁移到下部室的能力，而用对照siRNA转染的细 胞维持正常的迁移。为了确认NANA表达直接影响迁移率，实施挽救实验， 其中给用针对NANS或CMAS的siRNA转染的细胞补充NANA。在存在NANA 的情况下，它们能够部分恢复迁移表型。图12B中量化了几个迁移研究的这 些结果。这些结果提示了NANA表达对于细胞迁移是至关重要的，并且对于 转移可以是重要的。监测NANA表达可以预测细胞的转移潜力。另外， NANS/CMAS都是操作迁移和转移的新颖关键靶物。

实施例7：CMAS提高细胞迁移

如提及的，NANS和CMAS(用于生成并对蛋白质附着NANA的关键酶) 的敲低对细胞增殖没有影响，但是大大降低BPLER细胞迁移的能力(图12中 显示)。虽然CMAS和NANS的mRNA水平在HMLER和BPLER细胞中是等同 的，我们观察到CMAS的蛋白质表达在BPLER肿瘤启动细胞中显著过表达(图 13)。为了测定CMAS表达是否促成肿瘤启动BPLER细胞的恶性表型，用质粒 转染非攻击性HMLER细胞以迫使CMAS表达。使用先前描述的细胞迁移测 定法，如图14A中使用的，具有增强的CMAS表达的HMLER细胞与对照相比 将其迁移潜力显著提高几倍。还实施互补实验，并且创建稳定的CMAS敲低 BPLER细胞(BPLER-shCMAS1)。如预期的，图14B中显示这些细胞不能在相 同迁移测定法中形成集落。这些结果提示了CMAS蛋白表达在细胞迁移和/ 或转移中是枢要的。至今，尚未提及NANS或CMAS在癌症中的作用。这可 以部分是由于大多数技术依赖于仅仅检查mRNA水平的测序和/或微阵列实 验。这突出显示了我们的方法的强度。通过探查代谢物，NANA鉴定为在乳 腺肿瘤启动BPLER细胞中显著较高表达。通过随后探查其生物合成途径中的 酶，发现了对于致瘤性可以是重要的新颖的，有力的靶物。

实施例8：CMAS影响肿瘤形成启动

为了测定CMAS/NANA表达的损失如何招致体内肿瘤启动，我们实施图 15A中概述的实验。如上文描述的，创建稳定的CMAS敲低BPLER细胞 (BPLER-shCMAS1)，其不表达CMAS蛋白。在我们的实验中，将500,000个 过表达空载体(对照)的BPLER细胞和500,000个BPLER-shCMAS1细胞(其不 表达CMAS)注射到NOD/SCID小鼠的乳房脂肪垫中。目的是分析每组间肿瘤 大小和转移数目的差异。每三天持续45天，对小鼠检查可触知肿瘤，并且若 检出的话，直接测量肿瘤高度，长度和宽度以计算肿瘤体积。如图15B中显 示的，在45天内，4/4的对照小鼠已经形成较大的原发性肿瘤。令人惊讶地， 无一(0/5)BPLER-shCMAS1小鼠具有任何可触知肿瘤。实际上，在90天后， 注射BPLER-shCMAS1细胞的小鼠仍然是无肿瘤的。总之，体外和体内数据 提示了CMAS是完全新的且真正的癌症治疗性靶物。

实施例9：使用NMR数据鉴定并设计用于乳腺癌疗法的治疗剂

酶诸如CMAS是用于小分子药物抑制的理想候选物。CMAS的酶机制是 图16A，其中CMAS以二价阳离子依赖性方式活化NANA的羟基基团，使得 它随后可以攻击引入的胞苷三磷酸(CTP)分子的alpha-磷酸以形成胞苷单磷 酸-NANA(CMP-NANA)中间体。使用NANA支架，将用氟替换羟基基团的 基于底物的类似物设计并合成(图16B)。此取代在理论上应当维持NANA结合 CMAS，然而阻止酶促反应的能力。在存在CMAS抑制剂的情况中，使用先 前描述的细胞迁移测定法，显示了BPLER细胞不再能够迁移(图16C)。使用 NANA支架，我们能够快速设计并合成在细胞系中具有作用的基于底物的抑 制剂。

合成的F-NANA衍生物与得到FDA批准的药物瑞乐砂和达菲具有略微的 化学相似性(图17)。瑞乐砂和达菲都被设计为抑制流感酶神经氨酸苷酶。神 经氨酸苷酶特异性切割细胞表面上的NANA分子以促进病毒进入细胞中。神 经氨酸苷酶和CMAS共享NANA作为底物，因此这些已知的流感治疗剂怀疑 是CMAS抑制剂。如图17b中显示的，BPLER细胞的瑞乐砂处理阻断细胞迁 移。瑞乐砂和达菲二者都是已经得到FDA批准的，销售的治疗剂，且在小鼠 模型中是悬而未决的阳性结果，快速进入癌症适应症的临床试验。

已知神经氨酸苷酶自身从细胞表面除去NANA。我们怀疑神经氨酸苷酶 可以用于从恶性细胞的表面除去NANA，并且就像针对CMAS的siRNA一样 对迁移和肿瘤启动施加相似的影响。BPLER细胞与酶活性神经氨酸苷酶的预 温育降低NANA表达，如通过经罗丹明标记的麦芽凝集素(WGA)显微术测定 的(图18A)。另外，用神经氨酸苷酶处理的BPLER细胞不再能够在迁移测定 法中迁移(图18B)。神经氨酸苷酶和flu样分子(包括空病毒粒)可以代表用于检 测肿瘤启动细胞(流感病毒粒对NANA具有高亲和力)并通过从肿瘤群体除去 NANA抑制肿瘤启动和转移的创新方式。

其它实施方案

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