重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株(JS40/PR8)及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株及其制备方法和应用。本发明的一种重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株，其是以A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)为聚合酶PB2亚基，聚合酶PB1亚基，聚合酶PA亚基，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)6个内部基因的供体，通过自然重组得到，保藏号为CCTCC NO：V201419。本发明还公开了用于构建所述重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株的方法和该重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株对预防动物或人的类禽型H1N1流感的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及重组基因工程疫苗，具体地，本发明涉及一种用于预防动物和人类禽型H1N1流感的重组基因工程疫苗，更具体地，本发明所涉及的疫苗是一种用于预防动物和人类禽型H1N1流感的重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗。 

背景技术

流感病毒是一种能广泛感染禽类和哺乳动物的分节段的负链RNA构成的囊膜病毒。在全世界，流感常以零星暴发兼杂随机的大流行的形式出现，在过去的几十年里，各国家主要选择利用的仍然是全病毒灭活苗，它主要刺激机体产生体液免疫抵抗相同亚型的血凝素表面糖蛋白。 

类禽型H1N1在我国猪群中流行广泛，并且疫情仍在继续扩大(Yan Chen,Infect Genet Evol.2013)。在2011年，我国江苏省泗洪县出现了人感染类禽型H1N1猪流感病毒事件，这也是我国第一次报道类禽型H1N1亚型猪流感感染人事件(Huanliang Yang,Emerg infect 2012)。A型流感病毒跨种传播取决于病毒因适应性变异导致的宿主范围变化、宿主自身的限制性因素和环境因素的变化。为了对应疫情的发展，本发明进行了自然重组疫苗株的研制。 

理想的疫苗株应具备与流行株良好的抗原匹配性，对鸡胚无致病力及鸡胚高滴度生长性等条件。然而，很难从自然界分离具备上述条件的毒株作为疫苗株。在国内，由于现地分离的野毒株鸡胚适应性较差，致使现行国内的类禽型H1N1流感疫苗存在成本高、疫苗免疫期短等缺点。 

流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(简称PR8)是实验室鸡胚适应株，即该病毒可在鸡胚内生长至很高滴度，这种鸡胚适应性由病毒的6个内部基因决定。另外，当两个流感病毒共同感染一个细胞或鸡胚时，可发生基因互换，从而产生新的基因重组病毒。因此，通过遗传重组方法，可将流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因和流行株的HA、NA基因的进行重组而获得一个新的重组病毒，该重组病毒具有与HA和NA基因供体毒株一致的抗原性，同时还具有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚高滴度生长特性。 

人工自然重组技术是一种简单有效的构建2:6重组病毒疫苗株方法，流感病毒的基因组由8个分段的负链RNA片段组成，当2个病毒共同感染鸡胚或细胞时，其基因组片段会发生互换，从而产生一些新的重组病毒(reassortant)，通过含有相应抗体阳性血清的处理，则能够有效的筛选2:6重组病毒疫苗株。(Hualan Chen,Vaccine2003)。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题提供一种重组类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株及其制备方法。 

为了达到以上目的，本发明所采用的技术手段为： 

本发明发明人在江苏类禽型H1N1感染人事件当地分离得到一株猪流感病毒分离毒株，序列比对分析发现该毒株与感染人的毒株高度同源，将该分离得到的病毒株命名为A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)，简称SW/JS40(H1N1)。 

本发明利用人工重组方法，以H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体，以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)为聚合酶PB2亚基，聚合酶PB1亚基，聚合酶PA亚基，核蛋白(NP)，基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)6个内部基因的供体，通过自然重组得到了1株重组的类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株，命名为A型流感病毒A/swine/Jiangsu/40/PR8(H1N1)(简称为JS40/PR8)，保藏在位于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCCNO：V201419，保藏时间为2014年6月19日。 

本发明选用流感病毒的可在鸡胚内生长至很高滴度的实验室鸡胚适应株A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因作为骨架基因，并选用2011年分离得到的类禽型毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的HA和NA基因作为表面基因，利用自然重组方法，制备了重组病毒JS40/PR8，该重组毒株将可以作为类禽型H1N1流感的疫苗株。 

实验证实，JS40/PR8与我国类禽型H1N1流感病毒流行株SW/JS40(H1N1)抗原性一致，将对类禽型H1N1流感病毒流行株SW/JS40(H1N1)产生良好的特异保护性。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的6个内部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高8倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。 

因此，进一步的，本发明还提出了所述的重组的类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗 株在制备预防类禽型H1N1流感病毒所导致疾病的药物中的应用。 

其中，优选的，所述药物用于预防动物或人的类禽型H1N1流感病毒感染。 

更进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组的类禽型H1N1流感病毒灭活疫苗株的方法，该方法包括： 

(1)用类禽型H1N1流感病毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和鸡胚适应疫苗株A/PR/8/34(H1N1)共同接种鸡胚尿囊腔或细胞进行自然重组； 

(2)用抗所述鸡胚适应疫苗株A/PR/8/34(H1N1)的抗体筛选，除去表面基因来源于所述鸡胚适应疫苗株A/PR/8/34(H1N1)的毒株； 

(3)将筛选得到的毒株在鸡胚上进行3代有限克隆纯化，利用Trizol强裂变剂法，提取病毒RNA，进行反转录，然后用设计的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)病毒的各8对特异性鉴别引物进行RT-PCR扩增，然后，对扩增产物进行核酸凝胶电泳，鉴定得到的重组病毒为HA和NA来自于类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)、6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的重组病毒，即得。 

在本发明所述的方法中，优选的，所述的引物包括： 

只能扩增出类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)基因的8个特异性片段而不能扩增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的任何片段的类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8对特异性鉴别引物，引物序列如下： 

以及只能扩增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8个特异性片段而不能扩增出类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的任何片段的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8对特异性鉴别引物，引物序列如下所示： 

综上，实验证明，本发明制备得到了一株优良的可用于预防类禽型H1N1流感病毒所导致疾病的病毒株，本发明的为类禽型H1N1流感疫苗的进一步开发研究，奠定了坚实的基础。 

附图说明

图1A为以JS40和PR8毒株cDNA为模板，利用JS40毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物进行的扩增； 

其中第一至第八泳道为使用JS40毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对JS40毒株cDNA的扩增；M为DNA Marker 2000；第九至第十六泳道为使用JS40毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对PR8毒株cDNA为模板的扩增； 

图1B为以JS40和PR8毒株cDNA为模板，利用PR8毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物进行的扩增； 

其中1～8泳道为使用PR8毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对JS40毒株cDNA为模板的扩增；M为DNA Marker 2000；9～16泳道为使用PR8毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特异性引物对PR8毒株cDNA为模板的扩增； 

图2为JS40/PR8重组病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR扩增； 

1～8泳道：重组病毒JS40/PR8利用JS40的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物；M：DNA分子质量标准；9～16泳道：重组病毒JS40/PR8利用PR8的8对特异性鉴别引物扩增的PCR产物； 

图3为重组JS40/PR8病毒和野生型类禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(简称JS40)在最佳培养温度35℃测定的生长曲线； 

图4为攻毒后各组小鼠的体重变化情况。 

序列说明： 

SEQ ID No.1：JS40/PR8 HA基因； 

SEQ ID No.2：JS40/PR8 NA基因； 

SEQ ID No.3：JS40/PR8 PB2基因； 

SEQ ID No.4：JS40/PR8 PB1基因； 

SEQ ID No.5：JS40/PR8 PA基因； 

SEQ ID No.6：JS40/PR8 NP基因； 

SEQ ID No.7：JS40/PR8 M基因； 

SEQ ID No.8：JS40/PR8 NS基因。 

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实验材料 

1.病毒株 

A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(简称JS40)(记载在文献：一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立，杨焕良等，《中国预防兽医学报》，2013年02期)由本实验室保存，A/PR/8/34(H1N1)(简称PR8)购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感中心。 

2.SPF鸡胚及细胞 

9-11日龄的SPF鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF鸡胚孵化室，MDCK细胞(狗肾细胞)购自中国科学院武汉病毒研究所。 

3.主要试剂 

DATP、dGTP、dCTP、dTTP和rTaq DNA聚合酶购于大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂TRIzol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒、DTT、RNaseOUT和DNA聚合 酶购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒与小量质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；测序反应试剂盒(CEQTM DTCS Quick Start Kit)购自BECKMAN公司；抗A/PR/8/34(H1N1)抗血清购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感中心。 

4.引物 

分析比较，设计合成能扩增出类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)基因的8个特异性片段而不能扩增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的任何片段的类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的16条鉴别引物，合成引物序列见表1。 

表1  类禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8个特异性片段的鉴别引物序列 

另外，设计合成只能扩增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8个特异性片段而不能扩增出类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的任何片段的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)16条鉴别引物，合成引物序列见表2。 

表2  流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8个特异性片段的鉴别引物序列 

实施例1：筛选、鉴定重组病毒方法的建立 

利用Trizol强裂变剂法，提取流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的RNA，进行反转录，然后用上述设计的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的片段特异性鉴别引物做PCR反应。根据流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的基因设计的片段特异性鉴别引物只能扩增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的8个特异性片段而不能扩增出类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株的任何片段，根据类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的基因设计的片段特异性鉴别引物只能扩增出类禽型H1N1流感分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株的8个特异性片段而不能扩增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的任何片段。这将证明筛选、鉴定重组病毒方法的建立。 

如图1A所示，以类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的cDNA为模板，利用合成的流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8对片段特异性引物扩增，只有A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的cDNA扩增出了8条特异性片段，而A/PR/8/34(H1N1)毒株cDNA没有扩增出的任何片段。 

如图1B所示，以类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的cDNA为模板，利用合成的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)8对片段特异性引物扩增，只有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株cDNA扩增出了8条特异性片段，而流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株cDNA没有扩增出任何片段。 

由此证明已经建立了筛选方法，这种系统可以鉴定所制备的重组病毒的8条基因分别是来源于流感病毒A/PR/8/34(H1N1)还是类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)。 

实施例2：重组类禽型H1N1流感病毒JS40/PR8的制备与鉴定 

1.共感染-使两个病毒基因组发生重组： 

100μl的类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和50μl的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(简称PR8)混合加入850μl PBS中，共同接种10日龄的SPF鸡胚尿囊腔进行自然重组。35℃培养24小时，收集尿囊液。 

2.抗体筛选-除去表面基因来源于流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的毒株： 

取50μl在上述特定的人工条件下收获的尿囊液和600μl倍比(4倍)稀释的抗A/PR/8/34(H1N1)抗血清混合，室温作用30分钟，再每个稀释度接种三枚鸡胚。接着，接种的鸡胚在35℃培养箱中培养48小时，测定每个稀释度接种的鸡胚尿囊液的血凝价(参见实验动物血凝抑制试验国家标准(GB)(GB/T 14926.54-2001))，收集并保留低稀释度的A/PR/8/34(H1N1)抗血清处理后接种的鸡胚有血凝价的尿囊液。然后，相同方法做第二次的抗血清处理，同样收集并保留低稀释度的A/PR/8/34(H1N1)抗血清处理后接种的鸡胚有血凝价的尿囊液。 

3.稀释纯化-除去内部基因来源于H1N1流感病毒株的毒株： 

按照上述方法处理得到的病毒在鸡胚上进行3代有限克隆纯化，利用Trizol强裂变剂法，提取病毒RNA，进行反转录，然后用设计的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)病毒的各8对特异性鉴别引物(表1和2)进行RT-PCR扩增。然后，对扩增产物进行核酸凝胶电泳，鉴定得到的重组病毒为HA和NA来自于类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)、6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的重组病毒(见图2)，将获得的重组病毒命名为A/swine/Jiangsu/40/PR8(H1N1)，简称JS40/PR8，保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：V201419。 

4.重组病毒的序列鉴定 

提取重组病毒JS40/PR8的RNA，RT-PCR分别扩增出重组病毒JS40/PR8的全基因组的8个片段，对PCR产物进行核酸凝胶电泳，胶回收后测定每一片段的特定序列。利用DNAStar软件(DNAStar Lasergene V7.1)，对测定的序列与野生毒株类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的序列进行序列比较，发现重组病毒JS40/PR8的基因组均没有任何核苷酸的变化，表明重组病毒的HA和NA来自于类禽型H1N1流感病毒国内分离A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)；6个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS来自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。 

5.重组病毒JS40/PR8生长曲线的测定 

将亲本病毒类禽型H1N1流感病毒流行株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(简称JS40) 和重组病毒JS40/PR8接种5组SPF鸡胚，在35℃条件下分别培养24、48、72和96小时，取上述培养不同时间的鸡胚进行血凝测定，检测亲本毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和重组病毒JS40/PR8的生长曲线。 

从试验结果可以看出重组病毒在35℃培养条件下，72小时时重组病毒的血凝效价远高于野生毒株类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(如图3所示)。 

制备流感疫苗株，不但要求其具有良好的免疫原性，而且要求在生产中具有良好的生长特性，从重组JS40/PR8病毒在35℃培养条件下测定的生长曲线可以看出，重组病毒生长滴度较亲本类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)有明显提高，血凝效价高出8倍(如图3所示)。这说明本发明制备出了一株高生长滴度的重组病毒，将为以后的批量生产带来巨大的经济利益。 

6.重组病毒JS40/PR8的抗原性分析 

根据亲本毒株类禽型H1N1流感病毒国内分离株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)与重组病毒的抗原和血清进行交叉HI试验(参见实验动物血凝抑制试验国家标准(GB)(GB/T14926.54-2001))的抗原性分析数据，从试验结果可以看出抗原差异小于2倍，说明重组后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性(参见表3)。 

表3：亲本毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)与重组病毒JS40/PR8的抗原性分析 

7.重组病毒JS40/PR8的致病力试验 

BALB/c小鼠经常作为流感病毒致病性和宿主适应性的哺乳动物模型。为了解重组毒株的感染能力和致病性，本发明采用小鼠为动物模型，将重组毒株SW/JS/40/PR8和亲本毒株SW/JS/40/2011分别以10⁶TCID₅₀剂量经鼻腔接种小鼠，观察小鼠存活、体内病毒复制及体重损失的情况。 

六周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠(购自北京维通利华公司)，随机分为三组，每组8只，称量体重。所有小鼠分别经CO₂轻度麻醉后，第一组通过鼻腔接种50ul含有10⁶TCID₅₀的重组毒株SW/JS/40/PR8(JS40/PR8)的病毒液，第二组通过鼻腔接种50ul含有10⁶TCID₅₀的亲本毒株SW/JS/40/2011(JS40/11)的病毒液，第三组接种50ul PBS作为对照组。感染病毒后每天称量各组小鼠的单只体重，计算平均体重并观察发病与 存活情况，体重下降30％即实施安乐死。所有的小鼠均在拥有独立通风系统的鼠笼里饲养。 

每组于攻毒后第3d，随机抽取3只存活小鼠，经CO₂麻醉后剖杀，采集脑、鼻甲、脾脏、肾脏、肺脏，分别进行病毒含量的滴定；组织的病毒分离和鉴定收集的病料装在灭菌EP管中，-70℃保存，取出用灭菌研磨器研磨，制成10％的DMEM组织悬液，离心后取上清液体在MDCK细胞上进行滴定，按照测定TCID₅₀方法进行测定组织中病毒含量。小鼠每天称量体重，至14d。 

结果表明所有组别小鼠均无死亡情况发生。在脑、脾、肾和鼻甲中均检测不到病毒。在肺脏中重组毒株SW/JS/40/PR8病毒含量低于SW/JS/40/2011组(表4)，因病毒感染造成最大体重损失SW/JS/40/PR8为5％，低于SW/JS/40/2011组的10％(图4)，表明重组毒株致病力低于亲本毒株SW/JS/40/2011。 

表4  两组感染小鼠脏器病毒分离及致死情况结果 

8.重组病毒JS40/PR8的免疫原性实验 

将含量为10⁸EID₅₀/mL的重组病毒JS40/PR8以0.1％甲醛灭活后，以赛比克公司提供的MONTANIDE^TM ISA206佐剂制备疫苗，以10只6周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠为模型动物，0.1ml肌肉注射免疫，免疫后14d检测血清中HI抗体滴度，血清中HI抗体滴度在80-320之间，表明重组病毒JS40/PR8具有良好的免疫原性。 

参考文献： 

1.Yang H,Qiao C,Tang X,Chen Y,Xin X,Chen H.Human infection from avian-like influenza A(H1N1)viruses in pigs,China.Emerg Infect Dis.2012 Jul；18(7):1144-6. 

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3.Hualan Chen，Kanta Subbarao，David Swayne，Qi Chen，Xiuhua Lu，Jacqueline Katz，Nancy Cox，Yumiko Matsuoka.Generation and evaluation of an high-growth reassortant H9N2 influenza A virus as apandemic vaccine candidate.Vaccine 。