用于预防锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的疾病的重组KHV和疫苗

摘要

本发明涉及重组锦鲤疱疹病毒(KHV)、用于生产此类KHV的方法、包含此类KHV的细胞和此类KHV作为载体和在预防和/或治疗性处理鱼中由鲤鱼诸如普通鲤鱼或锦鲤中的锦鲤疱疹病毒引起的疾病中的用途。

说明书

本发明涉及重组锦鲤疱疹病毒(KHV)、用于生产此类KHV的方法、包含此类KHV的细胞和此类KHV作为载体和在预防和/或治疗性处理鱼中由鲤鱼诸如普通鲤鱼(Cyprinus　carpio　carpio)或锦鲤(Cyprinus　carpio　koi)中的锦鲤疱疹病毒引起的疾病中的用途。

普通鲤鱼是主要在亚洲、欧洲和中东最广泛养殖的供人食用的鱼。相比之下，在全世界，尤其在日本，培育锦鲤亚种作为用于个人爱好或竞赛性展览的宠物鱼。1996年在英国检测到一种在普通鲤鱼和锦鲤两者中引起致死疾病的病毒，其最初被称为锦鲤疱疹病毒病(KHVD)。然后该病毒被迅速确认为在以色列、美国和德国的锦鲤和普通鲤鱼中大量死亡的原因。普通鲤鱼的密集养殖、锦鲤展览和国际贸易已经促进了这种高度传染和毒力极高的疾病的全球迅速传播。由于其出现，KHVD已经在全球锦鲤和普通鲤鱼养殖业中引起了严重的金融和经济损失。

病毒的初步表征显示疱疹样结构，具有包膜和壳状结构围绕的100-110 nm的二十面体电子致密核心。病毒的基因组包含约~295 kb的线性双链DNA (dsDNA)，与鲤疱疹病毒1 (CyHV-1)相似，但大于大小通常为125-240kb的疱疹病毒成员的那些。KHV基因组序列最近已经公布(Aoki等人, J Virol, 81, pages 5058-5065 (2007))。KHV基因组含有显著量的与任何其它已知病毒序列无同源性的DNA序列。此外，其含有高度分歧(highly divergent)的编码多肽的DNA序列，其与几种dsDNA病毒(如疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒和其它大型DNA病毒)的那些类似。

该病毒的独特特征已经导致了三种不同的命名：首先，根据其形态表现命名为锦鲤疱疹病毒(KHV)；其次，根据其在鱼类中的致病作用命名为鲤间质性肾炎和鳃坏死病毒(CNGV)；最后，根据与CyHV-1和与CyHV-2的基因内容相似性命名为鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)。最后的命名已经得到最新的病毒基因组全长测序的进一步支持。然而，以下将使用名称KHV。

KHV具有约295 kb的基因组，其代表疱疹病毒成员中曾经鉴定的最大基因组。尽管首次分离KHV始于1996年，但关于个别基因在KHV发病机理和感染天然宿主的生物学中的作用只获得很少的信息。

国际专利申请WO 2004/061093 A1中已经描述了减毒KHV及其作为疫苗候选物的潜在用途。然而，该疫苗候选物隐藏了潜在的危险。减毒是病毒体外复制过程中发生的随机突变的结果。因此，减毒的特征是未知的，且不能排除其回复到完全致病表型。

KHV的应用研究和基础研究需要产生重组病毒。最近，通过使用细菌人工染色体(BAC)载体使操作大疱疹病毒基因组变得可行(Messerle等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 14759-14763 (1997)；Wagner等人, Trends Microbiol, 10, 318-324 (2002)，参见下文)。这些载体允许在大肠杆菌(E.coli)中维持和有效诱变病毒基因组，随后通过用BAC质粒转染进入真核允许细胞中来重构子代病毒颗粒。迄今为止，几种疱疹病毒的基因组已经作为感染性BAC克隆成功繁殖，包括人巨细胞病毒(HCMV)，其代表迄今为止作为BAC克隆的第二大疱疹病毒基因组(230 Kb) (Borst等人, J Virol, 73, 8320-8329 (1999))。

最近，已经使用BAC技术首次构建了几种重组KHV；这些重组体都描述于PCT专利申请WO2009/027412。该专利申请公开了制备在选自以下的一种或多种基因中具有缺陷的重组KHV的方法：ORF55：胸苷激酶基因；ORF12：推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因；ORF16：推定的G-蛋白偶联受体(GPCR)基因；ORF134：推定的白介素10同源基因；ORF140：推定的胸苷酸激酶基因，或它们的组合。此类突变体被用作活减毒疫苗病毒。

显示这些突变体中的一些当在一定大小和鱼龄的特定SPF鱼中使用时是安全的。然而，在现场，渔民对早期疫苗接种感兴趣，即当鱼相对年幼/小时和鱼的大小存在比较大的分布的情况下。结果是，在此类条件下，基于如国际专利申请WO2009/027412中公开的缺失突变病毒的疫苗在一些情况下可能不是足够安全的：此类重组KHV对于在年幼/小鱼中使用毒性太强。

这意味着，目前，仍然缺乏用于控制现场情况诸如鱼养殖中的安全且有效减毒的重组疫苗。

本发明的一个目的是提供可用于开发在现场控制KHV感染的安全且有效的减毒疫苗的新型重组KHV病毒。

现在令人惊讶地发现，开放阅读框57 (ORF57)缺陷的重组KHV显示强烈降低的死亡率或完全没有死亡，甚至在这种疱疹病毒重组体感染的非常年幼/小鲤鱼中也是如此，并提供针对野生型锦鲤疱疹病毒的免疫。此类重组KHV因此提供了可以合适地在年幼和/或小鲤鱼中使用的安全且有效的减毒疫苗病毒。

鉴于ORF57是到目前为止被认为是必需基因(没有活病毒在没有它的情况下是可行的)的事实，该发现甚至更令人惊讶。

因此，本发明的第一实施方案涉及ORF57缺陷的重组锦鲤疱疹病毒，导致产生减毒的KHV并当用所述疱疹病毒感染时，诱导鲤鱼优选普通鲤鱼或锦鲤中40％或更少的死亡率。

如本文所用，“缺陷的”ORF57是不再有功能，即不再能够编码功能蛋白的ORF57。如本文所用，缺陷ORF57导致产生以下KHV：其被减毒至其在鲤鱼中诱导40％或更低的死亡率的水平。此类缺陷可以例如通过突变诸如编码ORF57的基因中或其启动子区域中插入或缺失一个或多个核苷酸而获得。此类突变可以例如是基因的5'位点的移框突变，或启动子区域(的一部分)或基因本身(的一部分)的缺失。

ORF57的DNA序列的实例是如Genbank登录号NC_009127给出的ORF57的DNA序列，其中ORF57起始和终止密码子位于位置99382和100803。不言而喻，ORF57的位置可能由于自然变异在其它KHV毒株中不同。另外，由于自然变异，当与另一种KHV毒株比较时，一种KHV毒株中的ORF57序列中可能存在小差异。因此，如本文所述的ORF57是与如Genbank登录号NC_009127给出的ORF57的DNA序列具有大于80％的序列同一性的开放阅读框。

横跨核苷酸96630-101558的包含ORF56、57和58的核苷酸区域表示在SEQ ID NO:12中。还参见图1。

清楚的是，制备基因缺陷，即整个ORF57缺失，的最广泛的方法将导致完全没有ORF57蛋白产生。

从实用的角度和安全的观点来看，此类完全缺失将是采取的合乎逻辑的步骤。然而，如下从图1来看，推定的启动子区域位于可能参与相邻ORF58的表达的位置100212-100261。出于这个原因，ORF57中的突变应当优选不延伸进这个区域。因此，优选在位置100212的左手侧或位置100261的右手侧的区域中引入ORF57中的突变。

从图1还可以看到，两个推定的启动子区域分别位于可能参与相邻ORF56的表达的位置99451-99500和位置99794-99843。因此，ORF57中区域中的缺失干扰ORF56的表达在理论上是可能的。在那种情况下，可能根据本发明的ORF57缺陷的重组KHV仅仅由于ORF56的较低表达而表现为减毒。然而，实施例部分中显示：1) ORF56不是必需基因，以及2) 缺陷的ORF56对于根据本发明的重组KHV的减毒特征没有贡献。在这些实施例中显示，可以在ORF56中进行大的缺失，而不影响重组KHV的生存力且不显著改变重组KHV的减毒特征。这尤其暗示位于ORF57中的推定的ORF56启动子位点可以毫无问题地去除。

也从图1中得出结论，ORF57的两个推定的启动子位点位于ORF56中的位置97075-97124和98712-98761。因此，不能排除，ORF57的小部分的缺失，诸如ORF57 Del 1，提供了截短但仍有功能的ORF57编码的蛋白。为了排除这种可能性，如实施例部分中所述，可以进行横跨位置97001-99750的区域的大ORF56-ORF57双缺失。这种缺失的行为基本上等于单ORF57突变体，如与图7相比的图5中可以看到。因此，可以得出结论，ORF57编码的蛋白对于病毒是非必需的。

ORF57的只有小部分的缺失是一种可能性，其出于上面给出的理由甚至可以是一种优选的可能性，但是必须当心所得截短蛋白是无功能的。如果技术人员会出于任何原因决定缺失小于全ORF57，他就能够容易地检查ORF57是否变得缺陷：非缺陷ORF57会导致病毒具有太高水平的毒力，即太低水平的减毒。

优选地，所述重组KHV额外地在一种或多种病毒基因中是缺陷的，所述病毒基因对毒力有贡献，但对于病毒复制不是必需的。

因此，该实施方案的优选形式涉及根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒，其在至少一种额外的基因中是缺陷的，所述基因对毒力有贡献，但对于病毒复制不是必需的。

该实施方案的更优选形式涉及根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒，其在至少一种额外的基因中是缺陷的，所述基因对毒力有贡献，其中所述基因选自胸苷激酶基因；ORF12：推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因；ORF16：推定的G-蛋白偶联受体(GPCR)基因；ORF134：推定的白介素10同源基因；ORF140：推定的胸苷酸激酶基因，或它们的组合。

在该实施方案的一个甚至更优选的形式中，重组KHV在至少胸苷激酶基因或推定的胸苷酸激酶基因中是额外缺陷的。

在该实施方案的另一个甚至更优选的形式中，根据本发明的重组KHV在胸苷激酶基因和至少一种选自以下的对毒力有贡献的其它基因中是额外缺陷的：ORF12：推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因；ORF16：推定的G-蛋白偶联受体(GPCR)基因；ORF134：推定的白介素10同源基因或ORF140：推定的胸苷酸激酶基因。

在该实施方案的一个仍甚至更优选的形式中，重组KHV在至少胸苷激酶基因和推定的胸苷酸激酶基因中是额外缺陷的。

在本实施方案的另一个优选形式中，根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒为活形式。优选地，当引入到真核允许细胞或鱼个体(优选鲤类，更优选鲤鱼(Cyprinus　carpio)，甚至进一步优选普通鲤鱼和/或锦鲤)时，重组锦鲤疱疹病毒优选具有重构感染性颗粒(即复制)的能力。

在一个可替代实施方案中，根据本发明的重组KHV在一种或多种对于复制是必需的病毒基因中是额外缺陷的(并且任选地在一种或多种对于毒力有贡献但对于病毒复制不是必需的病毒基因中是缺陷的)，因此提供了非复制形式的根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒。

因此，一个可替代实施方案涉及根据本发明的重组KHV，其中所述疱疹病毒是非复制形式。

“非复制形式”意味着重组锦鲤疱疹病毒仍然具有感染细胞或鱼个体(例如鲤鱼、普通鲤鱼或锦鲤)的能力，但不能够复制到形成感染子代病毒的程度。

非复制重组毒株通过失活(借助已知的技术，诸如插入、缺失或突变，例如使用BAC克隆)对于复制必需的KHV基因而产生。

在稳定表达缺失基因(反式互补)的允许细胞系上培养此类缺失的病毒。

这种方法是本领域众所周知的方法。所述方法尤其已成功用于不同的疱疹病毒，诸如缺失了gH的Suid疱疹病毒1 (伪狂犬病病毒) (Babic等人, 1996)和牛疱疹病毒1 (Schr?der 和Keil, 1999)。

可以使任何对复制有贡献的基因缺陷，以获得非复制的重组锦鲤疱疹病毒。换言之，可以缺失其失活导致非复制重组锦鲤疱疹病毒的任何基因。优选地，为了提供病毒的非复制型形式而缺失的根据本发明的重组KHV的基因选自：

。

根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒优选包含细菌人工染色体(BAC)载体序列。

从约十五年以来，此类细菌人工染色体的使用已经大大促进了大疱疹病毒基因组的操作。这些载体允许在大肠杆菌中维持和诱变病毒基因组，随后通过转染BAC质粒到真核允许细胞中，将子代病毒粒子重构。在第一步，通过在感染细胞中的常规同源重组将BAC载体序列引入疱疹病毒基因组中。疱疹病毒的线性双链DNA基因组在复制过程中环化。其足以分离BAC突变体的环状复制中间体，并通过DNA转化到大肠杆菌中而进行穿梭。只需要这种穿梭一次以建立系统。疱疹病毒BAC然后在大肠杆菌中繁殖和突变。将同源克隆疱疹病毒BAC DNA穿梭回仅用于病毒重构的真核允许细胞。由于不需要病毒功能，所以在大肠杆菌中时该病毒基因组保持休眠，保留了克隆时存在的病毒功能。在体外培养程序改变分离株的真正特性时，这对于病毒是重要的。

如本文所用，术语“同源重组”是指当两个不同的同源核酸分子相互遭遇时，发生交叉并生成核酸的新组合。如本文所用，术语“介导同源重组的序列”是指引起同源重组的序列，所述同源重组依赖于催化、进行或辅助同源重组的特异性重组蛋白。此类重组蛋白优选特异性作用于“介导同源重组的序列”，但不作用于其它序列。

BAC载体序列是本领域中众所周知的，并且本领域中已经经常描述了它们在重组病毒诸如疱疹病毒的构建中的用途

。

BAC载体序列不一定要插入ORF57。或者，其可以插入对毒力有贡献的任何其它病毒基因和/或对病毒复制必需或不是必需的任何其它病毒基因和/或任何基因间区域中。

然而，在一个更优选的形式中，重组锦鲤疱疹病毒包含插入到ORF57中的BAC载体序列。此类插入的优点在于，通过将BAC载体插入ORF57，ORF57同时变得缺陷，因此直接提供根据本发明的重组KHV。

根据本发明的重组KHV的一个实例通过将修饰的loxP-侧接的BAC盒插入ORF55而克隆KHV基因组而实现(参见下文)。该插入导致BAC重组病毒，其基因组在细菌中稳定保持，且当转染允许细胞时能够再生病毒颗粒。(对于BAC-载体详情，参见：Costes, B., Fournier, G., Michel, B., Delforge, C., Raj, V.S., Dewals, B., Gillet, L., Drion, P., Body, A., Schynts, F., Lieffrig, F., Vanderplasschen, A., 2008, J Virol 82, 4955-4964，对于技术详情，参见下文)。该载体用来在ORF57中引入缺失。

术语“BAC载体”是指使用大肠杆菌的F质粒产生的质粒和在细菌诸如大肠杆菌等中可以稳定保持且产生约300 kb或以上的大尺寸DNA片段的载体。所述BAC载体至少含有对于BAC载体的复制必需的BAC载体序列。此类对于复制必需的区域的实例包括但不仅限于F质粒的复制起点及其变体。

如本文所用，术语“BAC载体序列”是指包含对于BAC载体的功能必需的序列的序列。任选地，BAC载体序列可以进一步包含“依赖于重组蛋白的重组序列”和/或“可选择标记”。

亦即“重组蛋白依赖性重组序列”和/或“选择标记”的详情在例如上文引用的文献中和WO 22009/027412中给出。

无论BAC载体插入基因组中的位置，优选的是，BAC载体序列侧接介导同源重组的序列，优选loxP。

此外，优选地，BAC载体序列包含可选择标记(参见下文)。在更优选的形式中，可选择标记为药物可选择标记(参见下文)。

在另一个优选的实施方案中，所述重组疱疹病毒的基因组以质粒的形式存在。这可通过分离上述包含BAC载体序列的重组锦鲤疱疹病毒的环状形式，并将其引入细菌细胞而实现。如上所述，在一种或多种对毒力有贡献或对复制必需的病毒基因中插入BAC (细菌人工染色体)载体序列对本发明不是必需的，只要通过基因工程改造技术使一种或多种所述对毒力有贡献或对复制必需的基因缺陷。

因此，可以将BAC载体序列插入病毒基因组的任何区域，条件是ORF57和优选一种或多种对毒力有贡献的其他病毒基因也是缺陷的。

当然，可以重复使用利用如上所述的BAC载体介导的克隆技术：例如第一次使ORF57缺陷且第二次使额外基因缺陷。

在进一步应用中，BAC载体序列在原则上可以毫无问题地仍然存在于根据本发明的重组KHV中。然而，对于根据本发明的锦鲤疱疹病毒在例如疫苗中的应用，优选除去大部分BAC序列。例如，对于包含编码选择性标记的基因的BAC序列就是这样，且甚至对于抗性基因更是如此。此类基因在疫苗中的存在，不仅被认为不必要，而且甚至是不期望的。

因此，优选地，从所述疱疹病毒基因组中切除BAC载体序列的至少一部分(例如，包含抗性基因或可选择标记的部分)或更优选大部分，从而在所述疱疹病毒基因组中的切除位点或先前插入位点优选留下异源序列。异源序列的大小优选少于200个核苷酸。所述切除通过将所述重组KHV引入表达切除侧接BAC载体序列的loxP的Cre重组酶的真核允许细胞而实现。

因此，该实施方案的一个优选形式涉及根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒，其特征在于从所述疱疹病毒基因组中切除BAC载体序列的部分，从而分别在所述疱疹病毒基因组中的切除位点或先前插入位点留下异源序列。

并且，在该实施方案的一个更优选形式中，从所述疱疹病毒基因组中切除的BAC载体序列的部分包含至少一种编码选择标记的基因和/或抗性基因。

也可以使用涵盖BAC盒的插入位点的野生型病毒基因组的DNA片段(例如，编码TK的ORF55)通过在真核细胞中的同源重组完全去除BAC盒。选择不再表达EGFP (由BAC盒编码)的病毒斑块允许选择已经将BAC插入位点回复到野生型序列的重组体。

任一形式的根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒、KHV BAC克隆和上述其中至少部分BAC载体序列从疱疹病毒基因组中切除的KHV构建体可用于涉及例如遗传工程改造技术的进一步操作以使基因组在其它特定基因中缺陷。如上面已经描述，此类其它基因的缺陷同样可以使用BAC技术来获得。

尽管根据本发明的重组KHV可以如此用于疫苗目的(参见下文)，但仅仅为了防止鱼，更具体鲤鱼，甚至更具体普通鲤鱼或锦鲤，免于KHV疾病，其也可以有效地用作用于异源(即非KHV) DNA片段的载体病毒。在那种情况下，根据本发明的重组KHV的有利特征将被充分利用，并且此外，病毒将例如获得额外特性，诸如标记特性、额外免疫特性或佐剂特性。

在这方面，“标记特性”是指异源DNA片段允许直接或间接区分实地病毒感染或疫苗病毒感染。

区分实地病毒感染和疫苗病毒感染的一种直接方式可以，例如，包含PCR反应，所述PCR反应使用与根据本发明的重组KHV中的异源(即非KHV) DNA片段特异性反应，但不与KHV实地病毒的DNA特异性反应的引物。

区分实地病毒感染和疫苗病毒感染的一种间接方式可以，例如，包含免疫反应，所述免疫反应使用与根据本发明的重组KHV中的异源(即非KHV) DNA片段编码的免疫原性蛋白特异性反应，但不与KHV实地病毒的任何蛋白特异性反应的抗体。

因此，本发明的另一个实施方案涉及包含异源DNA片段，例如，异源基因的根据本发明的重组KHV。

优选地，此类异源DNA片段是编码另一种病毒或微生物的免疫原性蛋白的异源基因，所述另一种病毒或微生物对鱼、更具体鲤鱼、甚至更具体普通鲤鱼或锦鲤是致病的。

更优选地，所述异源基因是引起鲤鱼春季病毒血症的棒状病毒(rhabdovirus)的G糖蛋白。此类构建体，当在疫苗中使用时，将不仅保护鲤鱼免于KHV，而且保护鲤鱼免于鲤鱼春季病毒血症。

用于在真核细胞中表达异源基因的合适启动子是本领域中众所周知的。用于表达异源基因(例如引起鲤鱼春季病毒血症的棒状病毒的G糖蛋白)的合适启动子的一个实例是HCMV IE启动子。

本发明进一步提供了用于产生重组锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染性颗粒的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a) 将根据本发明的重组KHV或包含根据本发明的重组KHV的基因组的重组KHV DNA引入真核允许细胞中；和

(b) 培养宿主细胞以产生重组锦鲤疱疹病毒(KHV)。

由于它们的减毒特征，上述根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒和它们的DNA非常适合用于通过注射或浴疗法或经口的鱼免疫，优选普通鲤鱼或锦鲤个体。

因此，本发明的又另一个实施方案提供了根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒和/或包含根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒的基因组的KHV DNA，其用于预防和/或治疗性处理鱼中的由锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的疾病。

预防性用途是目的在于预防感染，或疾病的至少临床表现的用途。

治疗性用途是所述KHV或KHV DNA在已经患有KHV引起的疾病的鱼中的用途。

本发明的再另一个实施方案提供了根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒和/或包含根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒的基因组的KHV DNA，其用于预防和/或治疗性处理鱼中的由锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的疾病的疫苗中。

本发明的又另一个实施方案提供了用于预防和/或治疗性处理鱼中的由锦鲤疱疹病毒(KHV)引起的疾病的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒和/或包含根据本发明的重组锦鲤疱疹病毒的基因组的KHV DNA，和药学可接受的载体。

本发明的再另一个实施方案提供了用于预防和/或治疗性处理鱼中的由引起鲤鱼春季病毒血症的棒状病毒引起的疾病的疫苗，所述疫苗包含携带编码所述引起鲤鱼春季病毒血症的棒状病毒的G糖蛋白的基因的重组KHV或包含所述重组KHV的基因组的DNA序列，和药学可接受的载体。

本文所用的术语“疫苗”指能够预防和/或治疗宿主针对特定疾病的组合物。所述疫苗可产生预防性的或治疗性的免疫力。

药学可接受的载体可以和水或缓冲液一样简单。药学可接受的载体还可以包含稳定剂。它还可以包含佐剂，或者它本身可以是佐剂。

通常，将疫苗制成液体溶液、乳液或悬浮液，用于注射或通过将鱼浸没在水中而递送。例如，可以制备液体乳液或可乳化浓缩物，以便将其添加到养鱼的水箱或水缸。还可以制备适于在施用之前溶解或悬浮于液体媒介物，或用于与固体食物混和的固体(例如粉末)形式。该疫苗也可以是用于用灭菌稀释剂重构的即用形式的冻干培养物。例如，冻干细胞可以在0.9％盐水(任选地作为包装疫苗产品的部分提供)重构。可注射疫苗的优选制剂是乳液。可以在添加到鱼圈(pen)、鱼箱或鱼缸前，将疫苗的液体或重构形式在少量水(例如1-100体积)中稀释。

在本实施方案的一个优选形式中，包含所述重组KHV毒株的疫苗制剂可以为干形式，例如粉末形式、冻干形式、压缩小球或片剂形式等。

在本实施方案的另一个形式中，所述病毒可以是组织培养液的形式。所述液体可在周围环境中保存，优选在-70℃保存，最优选作为含有甘油的溶液保存。在一个具体实施例中，所述组织培养液含有20％甘油。

本发明中公开的重组KHV毒株可以通过多种方法转化为干形式。干燥的特别优选的形式是通过冻干。在干燥前，例如冻干程序前，可以将各种成分(诸如防腐剂、抗氧化剂或还原剂、各种赋形剂等)添加到介质中。也可以将此类赋形剂还在干燥步骤后添加到干的(例如冻干的)活减毒病毒中。

当根据本发明的重组KHV用作用于口服施用(例如，通过浸没或浴疗法)的疫苗组分时，通常将不需要施用佐剂。

然而，如果将所述疫苗制剂直接注射到鱼中，佐剂的使用是任选的。如果根据本发明的重组KHV是非复制形式，免疫刺激剂的添加可以是优选的。

通常，为了增强免疫应答，所述制剂可以包括各种佐剂、细胞因子或其它免疫刺激剂，特别在制剂用于注射的情况下。

佐剂为以非特异性方式增强宿主免疫应答的免疫刺激物质。所述佐剂可为亲水性佐剂(例如氢氧化铝或磷酸铝)或疏水性佐剂(例如基于矿物油的佐剂)。可将佐剂与根据本发明的重组KHV混合，所述佐剂诸如：胞壁酰二肽、亲和素(avidine)、氢氧化铝、磷酸铝、油、油乳液、皂苷、硫酸葡聚糖、葡聚糖、细胞因子、嵌段共聚物、免疫刺激寡核苷酸和其它本领域已知的佐剂。在鱼类养殖中常用佐剂的实例为胞壁酰二肽、脂多糖、多种葡聚糖和聚糖和Carbopol? (一种均聚物)。合适佐剂为例如油包水(w/o)乳液、o/w乳液和w/o/w双-乳液。适用于w/o乳液中的油佐剂为例如矿物油或可代谢油。矿物油为例如：Bayol?、Marcol?和Drakeol?；可代谢油为例如植物油(诸如花生油和豆油)或动物油(诸如鱼油)、角鲨烷和角鲨烯。或者，可以有利地使用在EP 382,271中描述的维生素E (生育酚)增溶物。非常合适的o/w乳液例如从5-50％w/w水相和95-50％w/w油佐剂开始获得，更优选使用20％-50％w/w水相和80-50％w/w油佐剂。佐剂的添加量取决于佐剂本身的性质和制造商提供的关于此类量的信息。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的疫苗还包含稳定剂。可以将稳定剂添加到根据本发明的疫苗，例如，以防止其降解，延长保质期或提高冻干效率。有用的稳定剂可尤其为SPGA (Bovarnik等人, 1950, J. Bacteriology, vol. 59, p. 509)、脱脂乳、明胶、牛血清白蛋白、碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖、乳糖、蛋白质诸如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，和缓冲液诸如碱金属磷酸盐。

可以添加抗生素诸如新霉素和链霉素以防止病菌的潜在生长。

此外，疫苗可以包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂，例如Span?或Tween?。疫苗也可包含所谓“媒介物(vehicle)”。媒介物为根据本发明的KHV病毒(或为病毒颗粒形式或为DNA形式)粘附而不与其共价结合的化合物。此类媒介物为生物微胶囊、微藻酸盐、脂质体和大分子溶胶(macrosol)，其均为本领域已知。此类媒介物的特殊形式为Iscom。不言而喻，将其它稳定剂、载体、稀释剂、乳液等与根据本发明的疫苗混和也在本发明的范围内。此类添加剂例如描述于众所周知的手册诸如"Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)和"Veterinary vaccinology" (P. Pastoret等人编, 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681)。

当在疫苗中以干形式使用时，重组KHV毒株可以进一步包括重构液，优选无菌水、盐水或生理溶液。其也含有来自制造过程的少量残留物质，诸如细胞蛋白质、DNA、RNA等。尽管这些物质本身不是添加剂，但其可以存在于疫苗制剂中。

疫苗可以通过口服，例如通过它们的饲料或通过强制经口施用或通过注射(例如，经由肌肉或腹膜内途径)，个体施用于鱼。

或者，疫苗可以通过喷洒、溶解和/或浸没疫苗来同时施用于水体中含有的整个鱼群体。这些方法可用于接种所有种类的鱼(例如食用鱼和观赏鱼)和用于各种环境诸如池塘、水族馆、自然栖息地和淡水水库中。

本发明的进一步方面涉及包含根据本发明的重组KHV的DNA疫苗。

在包含根据本发明的重组KHV的基因组的意义上，根据本发明的DNA疫苗与包含根据本发明的重组KHV的疫苗没有基本上的不同。

它们可以通过皮内应用，例如使用无针注射器诸如GeneGun?，容易地施用。这种施用方式将DNA直接递送到待接种的动物细胞内。在根据本发明的药物组合物(如下文述)中的根据本发明的重组KHV DNA的优选量在10 pg-1000 μg的范围内。优选地，使用0.1-100 μg的范围内的量。或者，可以将鱼浸没在包含例如10 pg-1000 μg/ml之间的待施用DNA的溶液中。所有这些技术和施用途径都是本领域众所周知的。

优选地，将根据本发明的疫苗配制为适于注射或浸没接种的形式，诸如悬浮液、溶液、分散液、乳液等。

用于将根据本发明的疫苗应用于目标生物的剂量方案可以是单剂量或多剂量的应用，其可以与剂量和制剂相容的方式，且以免疫有效量同时或依次给予。确定治疗是否是“免疫有效”完全在本领域技术人员的能力之内，例如通过将实验攻击感染施用于经接种的动物，并随后确定目标动物的疾病临床体征、血清学参数，或通过测量病原体的再次分离。

对于基于根据本发明的重组KHV或重组KHV DNA的根据本发明的疫苗，由多少构成“药学有效量”取决于期望的效果和目标生物。确定有效量完全在普通技术人员的技术之内。包含在根据本发明的药物组合物中的根据本发明的重组KHV DNA的优选量已经在上文描述。

包含根据本发明的重组KHV毒株的活疫苗的优选量例如表示为噬斑形成单位(pfu)。例如，对于活病毒载体，可以有利地使用1-10¹⁰噬斑形成单位(pfu)/动物剂量、优选10² -10⁶pfu/剂的剂量范围。

可以应用本领域均已知的许多施用方式。优选经由注射(肌肉内或腹膜内途径)、浸没、浸渍或口服将根据本发明的疫苗施用于鱼。施用方案可以根据标准接种实践进行优化。

如果疫苗包含根据本发明的重组KHV的非复制形式，则剂量将表示为待施用的非复制病毒颗粒的数目。然后，当与活病毒颗粒的施用比较时，剂量通常会略高，因为活病毒颗粒在它们被免疫系统除去之前在目标动物中复制到一定程度。对于基于非复制病毒颗粒的疫苗，约10⁴至10⁹个颗粒范围内的病毒颗粒量通常是合适的。

优选经由浸没施用所述疫苗，特别当使用本发明的活重组KHV时。这在商业水产养殖的背景下使用此类疫苗的情况下特别有效。

图注

图1：涵盖ORF57的CyHV-3基因组区域的示意图。注明了每个ORF的ATG和终止密码子的坐标(根据GenBank登录号NC_009127)。提供了通过在计算机芯片上分析鉴定的在ORF56和ORF57之内或附近的推定启动子(P)的坐标。字母P之后的数字标识在鉴定的启动子序列控制下的ORF。待缺失以使ORF56和/或ORF57无效的选择的序列表示在顶部。注明了缺失的坐标。

图2、3：阶段流程图，进行所述阶段以产生缺失ORF57 (图2)或ORF56 (图3)的FL BAC galK重组质粒并表明从产生的质粒重构感染性病毒。使用在大肠杆菌中的同源重组用galK表达盒替换如图1中鉴定的ORF57或ORF56的区域。为了重构具有野生型胸苷激酶(TK)基因座的感染性病毒(FL BAC回复毒株)，将重组质粒与pGEMT-TK质粒共转染CCB允许细胞。为了重构具有TK的截短形式的感染性病毒(FL BAC切除毒株)，将重组质粒转染到表达Cre重组酶的CCB细胞中。

图4：阶段流程图，进行所述阶段以产生缺失ORF57和ORF56 (ORF56-57)的FL BAC重组质粒并表明从产生的质粒重构感染性病毒。使用在大肠杆菌中的同源重组，用galK表达盒替换如图1中鉴定的ORF56-57的区域。然后通过使用对应于侧接galK表达盒的KHV基因组区域的合成DNA序列(ORF56-57 Del盒)的同源重组，去除galK表达盒。为了重构具有野生型胸苷激酶(TK)基因座的感染性病毒(FL BAC回复毒株)，将重组质粒与pGEMT-TK质粒共转染CCB允许细胞。为了重构具有TK的截短形式的感染性病毒(FL BAC切除毒株)，将重组质粒转染到表达Cre重组酶的CCB细胞中。

图5：ORF57单缺失重组体的安全性(A-D)和接种疫苗/攻击(E-G)测试。如实施例(安全性测试)中所述在普通鲤鱼(7个月龄，平均重量3.74 g，n = 20)上测试FL BAC切除的ORF57 Del 1 galK (A)和FL BAC切除的ORF57 Del 2 galK (B)毒株的安全性。FL BAC切除毒株(C)和模拟感染(D)分别用作阳性和阴性对照。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第0天作为参考。用ORF57单缺失重组体感染后六周(E和F)，如实施例(接种疫苗/攻击)中所述攻击鱼。模拟感染的鱼用作对照(G)。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第42天作为参考。

图6：ORF56单缺失重组体的安全性。

如实施例(安全性测试)中所述在普通鲤鱼(7个月龄，平均重量3.74 g，n = 20)上测试FL BAC切除的ORF56 Del 1 galK (A)和FL BAC切除的ORF56 Del 2 galK (B)毒株的安全性。FL BAC切除毒株(C)和模拟感染(D)分别用作阳性和阴性对照。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第0天作为参考。

图7：FL BAC切除的ORF56-57 Del毒株的安全性(A-C)和接种疫苗/攻击(D-G)测试。如实施例(安全性测试)中所述在普通鲤鱼(7个月龄，平均重量4.41 g，n = 30)上测试FL BAC切除的ORF56-57 Del毒株(B)的安全性。FL BAC切除毒株(A)和模拟感染(C)分别用作阳性和阴性对照。在重复组上进行模拟感染。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第0天作为参考。接种疫苗/攻击(D-G)测试。如实施例(接种疫苗/攻击)中所述在接种后3周(D)或6周(F)用KHV FL毒株攻击用FL BAC切除的ORF56-57 Del毒株接种的鱼(n = 15)。重复组的模拟感染的鱼用作对照(E和G)。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取攻击当天作为参考。

图8：FL BAC回复的ORF56-57 Del毒株的安全性(A-C)和接种疫苗/攻击(D-G)测试。如实施例(安全性测试)中所述在普通鲤鱼(7个月龄，平均重量3.74 g，n = 30)上测试FL BAC回复ORF56-57 Del毒株(B)的安全性。FL BAC回复毒株(A)和模拟感染(C)分别用作阳性和阴性对照。在重复组上进行模拟感染。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第0天作为参考。接种疫苗/攻击(D-G)测试。如实施例(接种疫苗/攻击)中所述在接种后3周(D)或6周(F)用KHV FL毒株攻击用FL BAC回复的ORF56-57 Del毒株接种的鱼(n = 15)。重复组的模拟感染的鱼用作对照(E和G)。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取攻击当天作为参考。

实施例

　a) 细胞和病毒。将鲤鱼脑细胞(CCB) (Neukirch等人, 1999)在含有4.5 g/l葡萄糖(D-葡萄糖一水合物，Merck)和10％胎牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM，Invitrogen)中培养。将细胞在25℃、含有5％CO₂的潮湿气氛中培养。从由于KHV (CER Marloie，Belgium)死亡的鱼的肾中分离所述CyHV-3 FL毒株。

　b) CyHV-3 BAC质粒。CyHV-3 FL BAC质粒用作产生CyHV-3重组体的亲本质粒。该质粒已经广泛描述于Costes等人(2008)和国际专利申请WO 2009/027412。CyHV-3 FL BAC质粒是CyHV-3 FL毒株基因组的感染性细菌人工染色体(BAC)克隆。在该质粒中，将loxP-侧接的BAC盒插入CyHV-3 TK基因座(ORF55)。

　c) 使用细菌中的galK阳性筛选生产ORF 57 CyHV-3 FL BAC重组质粒。如前所述(Warming等人, 2005)，在细菌中使用galK阳性选择产生具有ORF57基因座缺失(参见图1中的ORF57 Del 1和ORF57 Del 2)的两个CyHV-3 FL BAC重组质粒(图2)。重组片段由侧接于与侧接待缺失序列的CyHV-3基因组中的区域同源的50 bp序列的半乳糖激酶(galK)基因(1231 bp)组成(图1)。

使用pgalK载体作为模板通过PCR产生这些片段。以下引物用于扩增(对于引物序列，参见表1)：用于产生ORF57 Del 1缺失：引物ORF57 Del1 fw和ORF57 Del1 rev，导致ORF57 Del 1-galK扩增子；用于产生ORF57 Del 2缺失：引物ORF57 Del2 fw和ORF57 Del2 rev，导致ORF57 Del 2-galK扩增子。纯化扩增产物(QIAquick凝胶提取试剂盒)。接下来，用50 ng上述PCR产物电穿孔含有CyHV-3 FL BAC质粒的电感受态的SW102细胞。将电穿孔的细胞平铺在补充20％半乳糖和氯霉素(17 μg/ml)的固体M63最小培养基，以筛选其中发生同源重组的细菌。最后，如其它处所述，将获得的集落划线在MacConkey指示板上，以确保galK阳性克隆的产生。扩增并纯化重组BAC分子(QIAGEN Large-Construct Kit)，并且使用组合的限制性内切酶- Southern印迹方法、PCR和测序控制它们的分子结构。　　

^*引物代表与CyHV-3基因组(带下划线的序列)和galK表达盒同源的序列。

　d) 从ORF 57 CyHV-3 FL BAC重组质粒重构感染性病毒。将CyHV-3 BAC质粒转染(Lipofectamine Plus, Invitrogen)进入允许的CCB中。为了产生具有野生型TK基因座的BAC质粒衍生毒株，将CyHV-3 BAC质粒与pGEMT-TK载体(分子比1:75)一起共转染至CCB细胞中。转染后七天，挑取EGFP表达(BAC盒编码EGFP表达盒)阴性的病毒噬斑并通过连续三轮噬斑纯化进行富集。类似地，为了重构从病毒基因组切除BAC盒的病毒颗粒，将BAC质粒与编码融合至核定位信号(Costes等人; 2008 JVI)的Cre重组酶的pEFIN3-NLS-Cre载体(分子比：1:70)一起共转染至CCB细胞中。

　e) 在细菌中使用galK阳性选择产生ORF 56 CyHV-3 FL BAC重组质粒。如前所述(Warming等人, 2005)在细菌中使用galK阳性选择产生具有ORF56基因座缺失(参见图1中的ORF56 Del 1和ORF56 Del2)的两个CyHV-3 FL BAC重组质粒(图3)。重组片段由侧接于与侧接待缺失序列的CyHV-3基因组中的区域同源的50 bp序列的半乳糖激酶(galK)基因(1231 bp)组成(图1)。这些片段通过PCR使用pgalK载体作为模板来产生。以下引物用于扩增(对于引物序列，参见表2)：用于产生ORF56 Del 1缺失：引物ORF56 Del1 fw和ORF56 Del1 rev，导致ORF56 Del 1-galK扩增子；用于产生ORF56 Del 2缺失：引物ORF56 Del2 fw和ORF56 Del2 rev，导致ORF56 Del 2-galK扩增子。纯化扩增产物(QIAquick凝胶提取试剂盒)。接下来，用50 ng上述PCR产物电穿孔含有CyHV-3 FL BAC质粒的电感受态SW102细胞。将电穿孔的细胞铺板在补充20％半乳糖和氯霉素(17 μg/ml)的固体M63基本培养基上，以选择其中发生同源重组的细菌。最后，将获得的菌落划线到如本文其它地方所述的MacConkey指示板上，以确认galK阳性克隆的产生。扩增并纯化重组BAC分子(QIAGEN Large-Construct Kit)，并且使用组合的限制性内切酶-Southern印迹方法、PCR和测序控制它们的分子结构。　　

^*引物代表与CyHV-3基因组(带下划线的序列)和galK表达盒同源的序列。

　f) 从ORF 56 CyHV-3 FL BAC重组质粒重构感染性病毒。将CyHV-3 BAC质粒转染(Lipofectamine Plus, Invitrogen)进入允许的CCB中。为了产生具有野生型TK基因座的BAC质粒衍生毒株，将CyHV-3 BAC质粒与pGEMT-TK载体(分子比1:75)一起共转染至CCB细胞中。转染后七天，挑取EGFP表达(BAC盒编码EGFP表达盒)阴性的病毒噬斑并通过连续三轮噬斑纯化进行富集。类似地，为了重构从病毒基因组切除BAC盒的病毒颗粒，将BAC质粒与编码融合至核定位信号(Costes等人; 2008 JVI)的Cre重组酶的pEFIN3-NLS-Cre载体(分子比：1:70)一起共转染至CCB细胞中。

　g) 在细菌中使用galK阳性和阴性选择产生ORF56-57 CyHV-3 FL BAC重组质粒。如前所述(Warming等人, 2005)在细菌中使用galK阳性和阴性选择产生具有ORF56和ORF57基因座缺失(图1)的CyHV-3 FL BAC重组质粒(图4)。第一个重组过程(galK阳性选择)是由半乳糖激酶(galK)基因(1231 bp)替代ORF56和ORF57的鉴定序列。重组片段由侧接于与侧接待缺失序列的CyHV-3基因组中的区域同源的50 bp序列的galK基因组成(图1) (ORF56-57 Del galK，图4)。该片段通过PCR使用引物ORF56-ORF57 Del fw和ORF56-ORF57 Del rev (表3)和作为模板的pgalK载体产生。纯化扩增产物(QIAquick凝胶提取试剂盒)。接下来，用50 ng上述PCR产物电穿孔含有CyHV-3 FL BAC质粒的电感受态SW102细胞。将电穿孔的细胞铺板在补充20％半乳糖和氯霉素(17 μg/ml)的固体M63基本培养基上，以选择其中发生同源重组的细菌。最后，将获得的菌落划线到如本文其它地方所述的MacConkey指示板上，以确认galK阳性克隆的产生。扩增并纯化重组BAC分子(QIAGEN Large-Construct Kit)，并且使用组合的限制性内切酶- Southern印迹方法、PCR和测序控制它们的分子结构。第二个重组过程(galK阴性选择)是从FL BAC ORF56-57 Del galK质粒去除galK盒。使用合成的499 bp DNA片段(ORF56-57 Del盒，见下文)来实现该目标。其由与侧接待缺失序列的CyHV-3基因组中的区域同源的序列组成：galK基因上游的250 bp (从坐标96751至9700, Genbank登录号NC_009127)和galK基因下游的249 bp (从坐标99751至100000，并缺失碱基99760, Genbank登录号NC_009127)。用50 ng上述PCR产物电穿孔含有FL BAC ORF56-57 Del galK质粒的电感受态SW102细胞。将电穿孔的细胞铺板在补充2-脱氧-半乳糖的固体基本培养基上，以选择其中发生同源重组的细菌(galK消化2-脱氧-半乳糖产生有毒产物)。扩增并纯化重组BAC分子(QIAGEN Large-Construct Kit)，并且使用组合的限制性内切酶- Southern印迹方中、PCR和测序控制它们的分子结构。　　

^*引物代表与CyHV-3基因组(带下划线的序列)和galK表达盒同源的序列。

　h) 从ORF56-57 CyHV-3 FL BAC重组质粒重构感染性病毒。将CyHV-3 BAC质粒转染(Lipofectamine Plus, Invitrogen)进入允许的CCB中。为了产生具有野生型TK基因座的BAC质粒衍生毒株，将CyHV-3 BAC质粒与pGEMT-TK载体(分子比1:75)一起共转染至CCB细胞中。转染后七天，挑取EGFP表达(BAC盒编码EGFP表达盒)阴性的病毒噬斑并通过连续三轮噬斑纯化进行富集。类似地，为了重构从病毒基因组切除BAC盒的病毒颗粒，将BAC质粒与编码融合至核定位信号(Costes 等人; 2008 JVI)的Cre重组酶的pEFIN3-NLS-Cre载体(分子比：1:70)一起共转染至CCB细胞中。

　i) 安全性测试

将普通鲤鱼在24℃在60升箱中适应10天。将鲤鱼(鱼50g生物量/l)在含有4、40或400 PFU/ml待测试的KHV毒株的水中浸没2 h。将对照组(模拟感染)浸没在已经添加等体积培养基的水中。在培养期结束时，将鱼返回较大箱中。在接种前对病毒接种物进行滴定并在接种后对其进行反滴定，以确保各组间剂量相等。每天检查鱼的KHV病的临床症状并将死鱼除去。

　j) 疫苗接种/攻击

将普通鲤鱼在24℃在60升箱中适应10天。为了接种，将鲤鱼(鱼50g生物量/l)在含有4、40或400 PFU/ml待测试的KHV毒株的水中浸没2 h。在培养期结束时，将鱼返回较大箱中。接种后3周或6周，通过与临释放到接种鱼的箱中之前感染的未免疫鱼共同居住而用毒性KHV攻击鱼。通过浸没在含有300 PFU/ml的毒性亲本FL毒株的水中2 h而接种这些鱼。向每个含有接种鱼的箱中添加将两条受感染的鱼。

　k) 安全性和攻击结果

如实施例(安全性测试)中所述在普通鲤鱼(7个月龄，平均重量3.74 g，n = 20)上测试FL BAC切除的ORF57 Del 1 galK (图5A)和FL BAC切除的ORF57 Del 2 galK (图5B)毒株的安全性。FL BAC切除的毒株(图5C)和模拟感染(图5D)分别用作阳性和阴性对照。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第0天作为参考。用ORF57单缺失重组体感染后六周(图5E和F)，如实施例(疫苗接种/攻击)中所述攻击鱼。使用模拟感染的鱼作为对照(图5G)。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第42天作为参考。

从图5A和B清楚可见，根据本发明的ORF57缺失突变体是安全的，甚至当应用到小鱼时。

从图5E和F也清楚可见，根据本发明的KHV ORF57缺失突变体非常适合作为有效疫苗，特别是当以40 pfu/ml或更高的剂量施用时。

如实施例(安全性测试)中所述在普通鲤鱼(7个月龄，平均重量3.74 g，n = 20)上测试FL BAC切除的ORF56 Del 1 galK (图6A)和FL BAC切除的ORF56 Del 2 galK (图6B)毒株的安全性。FL BAC切除的毒株(图6C)和模拟感染(图6D)分别用作阳性和阴性对照。根据感染后天数表示存活鲤鱼的百分数，取第0天作为参考。

如从图6A和B清楚可见，ORF56缺失突变体表现出与对照野生型病毒的毒力大致相当的毒力(比较小图A和B与小图C)。

如在图7和图8中可以看出，携带在ORF57和ORF56两者中的缺失的KHV显示出与携带单ORF57缺失的KHV的安全性和效力概况相当的安全性和效力概况。

参考文献

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