基于胆固醇修饰的单芘荧光探针及其合成方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于胆固醇修饰的单芘荧光探针及其合成方法和应用。该荧光探针的结构式为式中n的取值为2或3或4，其是将芘经由含寡聚乙氧基和仲胺基团的亲水性连接臂介导结合胆固醇基团制备而成。本发明荧光探针具有化学稳定性好、响应速度快、灵敏度高、响应范围宽等优点，能够连续、实时、在线的测定蛋白质中的胃蛋白酶和卵清蛋白，并且检出限分别可达到202nmol/L、131nmol/L。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质的检测技术领域，具体涉及一种在水中测定蛋白质的荧光探针及其合成方法和检测方法。 

背景技术

蛋白质是生命内最重要的生物大分子，是生命活动的物质基础，是生物体内一切组织的基础物质，并在生命现象和生命过程中起着决定性的作用，它与营养、酶、病毒、免疫、物质运输、遗传、生命等都有密切关系。对蛋白质进行定量分析和特异识别探讨生命机理是十分重要的，其浓度和结构的研究在医学及免疫等方面有着极其重要的意义，对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。 

目前，用于检测蛋白质的方法中，常见的方法包括：分光光度法、共振瑞利散射光谱法、化学发光法、免疫法、纳米粒子法、等离子体共振法、过渡金属羰基碎片法等。在众多的痕量蛋白的检测方法中，荧光分析法因其具有灵敏度高，选择性好，动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境的优点而在蛋白质分析中应用广泛。荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性，在分子量级上研究溶液中蛋白质高灵敏度的分析方法，因而近年来，随着技术的不断进步，荧光探针法作为一种新型的定量检测蛋白质的方法，以其干扰少、快速、灵敏度高、准确、实用性而备受关注。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境的可用于检测蛋白质的荧光探针，并为该荧光探针提供一种合成方法，以及该荧光探针在检测卵清蛋白或胃蛋白酶的应用。 

解决上述技术问题所采用的技术方案是该荧光探针的结构式如下所示： 

式中n为2或3或4。 

上述基于胆固醇修饰的单芘荧光探针的合成方法由下述步骤组成： 

1、合成芘磺酰基衍生物 

在惰性气体保护和冰浴搅拌条件下，将芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烃的三氯甲烷溶液中，二氨基含氧烷烃与芘磺酰氯的摩尔比为10﹕1，滴加完后室温搅拌1小时，分离纯化产物，得到式Ⅰ所示的芘磺酰基衍生物，其反应方程式如下： 

上述的二氨基含氧烷烃为1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺、3,6,9,12-四氧杂十六烷-1,16-二胺中的任意一种。 

2、合成基于胆固醇修饰的单芘荧光探针 

在惰性气体保护和冰浴搅拌条件下，将氯甲酸胆固醇酯的二氯甲烷溶液滴加到芘磺酰基衍生物和三乙胺的二氯甲烷溶液中，芘磺酰基衍生物、氯甲酸胆固醇酯、三乙胺的摩尔比为1∶1.3～1.5∶1.3～2.0，滴加完后继续搅拌4～5小时，柱层析分离产物，得到基于胆固醇修饰的单芘荧光探针，其反应方程式如下： 

上述的合成基于胆固醇修饰的单芘荧光探针步骤2中，所述的芘磺酰基衍生物、氯甲酸胆固醇酯、三乙胺的摩尔比最佳为1∶1.5∶1.5。 

本发明的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针在检测蛋白质中的用途，所述的蛋白质为卵清蛋白或胃蛋白酶，其检测方法如下： 

1、配制溶液 

将十二烷基三甲基溴化铵、卵清蛋白、胃蛋白酶分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液、0.25mmol/L卵清蛋白溶液及0.25mmol/L胃蛋白酶溶液。 

2、绘制标准曲线 

向6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中加入基于胆固醇修饰的单芘荧光探针，配制成0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液，取2.5mL此溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L卵清蛋白溶液，混合均匀后，使所得混合液中卵清蛋白的浓度为0～1.4μmol/L，用荧光仪在最大激发波长为353nm、发射波长为498nm处测量荧光强度，激发发射狭缝均为2nm，记录溶液达到平衡时的荧光强度，绘制荧光强度随卵清蛋白浓度变化的荧光光谱图以及相同波长下I_M/I_E值随卵清蛋白浓度变化的标准曲线。 

按上述方法测试并绘制荧光强度随胃蛋白酶浓度变化的荧光光谱图以及相同波长下I_M/I_E值随胃蛋白酶浓度变化的标准曲线。 

3、检测待测样品 

向2.5mL 0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液加入不同体积的待测蛋白质样品，用荧光仪测量待测蛋白质样品的荧光强度，根据待测蛋白质样品的I_M/I_E值和浓度，结合标准曲线的线性方程即可确定卵清蛋白或胃蛋白酶。 

本发明基于胆固醇修饰的单芘荧光探针的化学稳定性好、响应速度快、灵敏度高、选择性好，可直接用荧光仪器进行检测，如FLS920型号的单光子计数时 间分辨荧光光谱仪或其他类似的光学检测仪器，实现对卵清蛋白或胃蛋白酶的高灵敏度、低检出限检测。 

附图说明

图1是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针检测0～0.19μmol/L胃蛋白酶溶液的荧光强度变化曲线图。 

图2是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针检测0～0.19μmol/L胃蛋白酶溶液的浓度-I_M/I_E的线性曲线图。 

图3是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针检测0.2～1.4μmol/L胃蛋白酶溶液的荧光强度变化曲线图。 

图4是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针检测0.2～1.4μmol/L胃蛋白酶溶液的浓度-I_M/I_E的线性曲线图。 

图5是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针检测卵清蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。 

图6是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针检测卵清蛋白溶液的浓度-I_M/I_E的线性曲线图。 

图7是实施例1制备的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针对7种蛋白质中卵清蛋白和胃蛋白酶的区分图。 

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。 

实施例1 

合成结构式如下的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针： 

其合成方法如下： 

1、合成芘磺酰基衍生物 

将0.3g(0.997mmol)芘磺酰氯溶解于50mL三氯甲烷中，在流速为0.6～0.8mL/s的氮气条件及冰浴搅拌条件下，将其用恒压滴液漏斗以3～4秒/滴的速度滴入盛有50mL三氯甲烷和1.47mL(9.97mmol)1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的三颈烧瓶中，滴加完后再室温搅拌1小时，停止反应，用饱和食盐水将有机相连续洗涤至水相为中性，收集有机相，并用无水硫酸钠干燥，蒸除除溶剂，以甲醇与二氯甲烷的体积比为1﹕30的混合溶液为洗脱剂柱层析分离纯化产物，得到式Ⅱ所示的芘磺酰基衍生物，其收率为55％，反应方程式如下： 

2、合成基于胆固醇修饰的单芘荧光探针 

将0.3694g(0.82mmol)氯甲酸胆固醇酯溶解于5mL二氯甲烷溶解中，然后在流速为0.6～0.8mL/s的氩气条件和冰浴搅拌条件下，将其用恒压滴液漏斗以3～4秒/滴的速度滴入盛有5mL二氯甲烷、114μL(0.82mmol)三乙胺和0.2260g(0.55mmol)芘磺酰基衍生物的三颈烧瓶中，滴加完后继续搅拌4～5小时，停止反应，以乙酸乙酯与石油醚的体积比为1﹕1.5的混合溶液为洗脱剂柱层析分离纯化产物，得到基于胆固醇修饰的单芘荧光探针，其收率为33％，其反应方程式如下： 

本实施例合成的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针的核磁数据为：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：9.00(1H)，8.71(1H)，8.34-8.11(7H)，5.64 (1H)，5.29(1H)，5.12(1H)，4.46(1H)，3.43-3.17(12H)。 

实施例2 

合成结构式如下的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针： 

在实施例1的合成芘磺酰基衍生物步骤1中，所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩尔的3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺替换，该步骤的其它步骤与实施例1相同。其它步骤与实施例1相同，得到基于胆固醇修饰的单芘荧光探针。 

实施例3 

合成结构式如下的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针： 

在实施例1的合成芘磺酰基衍生物步骤1中，所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩尔的3,6,9,12-四氧杂十六烷-1,16-二胺替换，该步骤的其它步骤与实施例1相同。其它步骤与实施例1相同，得到基于胆固醇修饰的单芘荧光探针。 

实施例4 

实施例1合成的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针在检测胃蛋白酶中的用途，其检测方法如下： 

1、配制溶液 

将十二烷基三甲基溴化铵、胃蛋白酶分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液及0.25mmol/L胃蛋白酶溶液。 

2、绘制标准曲线 

向6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中加入基于胆固醇修饰的单芘荧光探针，配制成0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液，取2.5mL此溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L胃蛋白酶溶液，混合均匀后，使所得混合液中胃蛋白酶的浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.1、0.12、0.16、0.19μmol/L，用荧光仪在最大激发波长为353nm、发射波长为498nm处测量荧光强度，激发发射狭缝均为2nm，记录溶液达到平衡时的荧光强度，绘制荧光强度随胃蛋白酶浓度变化的荧光光谱图，见图1，并绘制相同波长下I_M/I_E值随胃蛋白酶浓度变化的标准曲线，结果见图2。 

由图1可见，浓度为0.5μmol/L的荧光探针在6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中的荧光强度随着体系中胃蛋白酶浓度的增大变化很明显，说明所制备的荧光探针对胃蛋白酶的检测灵敏度很高。由图2可见，在胃蛋白酶浓度为0.02～0.19μmol/L时，I_M/I_E值与胃蛋白酶浓度呈线性关系，线性方程为： 

y＝2.20+21.89x 

式中y为I_M/I_E值，x为胃蛋白酶浓度，相关系数r为0.990，由相关系数可见，I_M/I_E值与胃蛋白酶浓度的线性关系很好。经测试，该荧光探针对胃蛋白酶的检出限为202nmol/L。 

3、检测待测样品 

向2.5mL 0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液加入不同体积的待测蛋白质样品，用荧光仪测量待测蛋白质样品的荧光强度，根据待测蛋白质样品的I_M/I_E值和浓度，结合标准曲线的线性方程即可确定胃蛋白酶。 

实施例5 

实施例1合成的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针在检测胃蛋白酶中的用途，其检测方法如下： 

1、配制溶液 

将十二烷基三甲基溴化铵、胃蛋白酶分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液及0.25mmol/L胃蛋白酶溶液。 

2、绘制标准曲线 

向6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中加入基于胆固醇修饰的单芘荧光探针，配制成0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液，取2.5mL此溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L胃蛋白酶溶液，混合均匀后，使所得混合液中胃蛋白酶的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol/L，用荧光仪在最大激发波长为353nm、发射波长为498nm处测量荧光强度，激发发射狭缝均为2nm，记录溶液达到平衡时的荧光强度，绘制荧光强度随胃蛋白酶浓度变化的荧光光谱图，见图3，并绘制相同波长下I_M/I_E值随胃蛋白酶浓度变化的标准曲线，结果见图4。 

由图3可见，浓度为0.5μmol/L的荧光探针在6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中的荧光强度随着体系中胃蛋白酶浓度的增大变化很明显，说明所制备的荧光探针对胃蛋白酶的检测灵敏度很高。由图4可见，在胃蛋白酶浓度为0.2～1.4μmol/L时，I_M/I_E值与胃蛋白酶浓度呈线性关系，线性方程为： 

y＝6.65+18.15x 

式中y为I_M/I_E值，x为胃蛋白酶浓度，相关系数r为0.990，由相关系数可见，I_M/I_E值与胃蛋白酶浓度的线性关系很好。 

3、检测待测样品 

向2.5mL 0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液加入不同体积的待测蛋白质样品，用荧光仪测量待测蛋白质样品的荧光强度，根据待测蛋白质样品的I_M/I_E值和浓度，结合标准曲线的线性方程即可确定胃蛋白酶。 

实施例6 

实施例1合成的基于胆固醇修饰的单芘荧光探针在检测卵清蛋白中的用途，其检测方法如下： 

1、配制溶液 

将十二烷基三甲基溴化铵、卵清蛋白分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液及0.25mmol/L卵清蛋白溶液。 

2、绘制标准曲线 

向6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中加入基于胆固醇修饰的单芘荧光探针，配制成0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液，取2.5mL此溶液 于比色皿中，加入0.25mmol/L卵清蛋白溶液，混合均匀后，使所得混合液中卵清蛋白的浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol/L，用荧光仪在最大激发波长为353nm、发射波长为498nm处测量荧光强度，激发发射狭缝均为2nm，记录溶液达到平衡时的荧光强度，绘制荧光强度随卵清蛋白浓度变化的荧光光谱图，见图5，并绘制相同波长下I_M/I_E值随卵清蛋白浓度变化的标准曲线，结果见图6。 

由图5可见，浓度为0.5μmol/L的荧光探针在6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵溶液中的荧光强度随着体系中卵清蛋白浓度的增大变化很明显，说明所制备的荧光探针对卵清蛋白的检测灵敏度很高。由图6可见，在卵清蛋白浓度为0.1～1.4μmol/L时，I_M/I_E值与卵清蛋白浓度呈线性关系，线性方程为： 

y＝1.03+2.82x 

式中y为I_M/I_E值，x为卵清蛋白浓度，相关系数r为0.996，由相关系数可见，I_M/I_E值与卵清蛋白浓度的线性关系很好。经测试，该荧光探针对卵清蛋白的检出限为131nmol/L。 

3、检测待测样品 

向2.5mL 0.5μmol/L基于胆固醇修饰的单芘荧光探针溶液加入不同体积的待测蛋白质样品，用荧光仪测量待测蛋白质样品的荧光强度，根据待测蛋白质样品的I_M/I_E值和浓度，结合标准曲线的线性方程即可确定卵清蛋白。 

为了证明本发明的有益效果，发明人按照实施例4的方法，对浓度为5μmol/L的卵清蛋白、β-乳球蛋白、细胞色素C、胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、牛血清白蛋白分别进行了检测，测试结果见图7。由图7可见，在相同条件下，加入7种不同的蛋白质，只有卵清蛋白和胃蛋白酶能够发生明显的猝灭，而其他蛋白质荧光强度未发生明显变化，说明本发明的荧光探针在6mmol/L十二烷基三甲基溴化铵的HEPES缓冲溶液(缓冲溶液的浓度为10mmol/L)中，在探针浓度为0.5μmol/L下可以很好的选择区分卵清蛋白或胃蛋白酶，然后进一步根据不同浓度下对应的I_M/I_E值，结合卵清蛋白或胃蛋白酶标准曲线的线性方程即可确定卵清蛋白和胃蛋白酶。