一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法

摘要

本发明公开了一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法，本发明针对暗纹东方鲀雌雄个体性别差异基因上存在单核苷酸突变位点，设计了分别扩增性别差异基因序列的一对外侧PCR引物和含有针对突变位点的错配碱基的内侧PCR引物。利用所述引物，暗纹东方鲀不同性别DNA样品可以得到不同扩增结果，从而判断暗纹东方鲀性别差异。本发明成本低廉、操作简单、快速、准确并适合于推广应用，可在提取1龄以内暗纹东方鲀基因组DNA的基础上快速准确对暗纹东方鲀幼鱼的性别进行鉴定，对加快暗纹东方鲀单性选育进程及分子生物学领域快速的PCR检测方法研究有着重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及—种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法。

背景技术

暗纹东方鲀（Takifugu Obsecurus），俗称河豚，属硬骨鱼纲，鲀形目，鲀科，东方鲀属，主要分布在我国近海北部沿海（东海、黄海、渤海）和长江中下游，具有溯河洄游的习性，成鱼在海中育肥和成熟，春季亲鱼由海逆河而上到淡水中产卵，仔稚鱼在长江和湖泊中发育成长，翌年春天幼鱼入海。暗纹东方鲀本身不产生毒素，但是可以蓄积所捕食的饵料生物中的毒素，尤以卵巢、肝脏、血液和皮肤等部位含量较高，误食没有经过特殊处理和烹饪的野生暗纹东方鲀，可致人死亡。然而暗纹东方鲀肉质鲜美，营养丰富，特别是其精巢不仅不含毒素，而且洁白如乳，丰腴鲜美，入口即化，给人以难以用言辞表达的美妙绝伦的感觉，有“西施乳”之美誉。暗纹东方鲀在我国有2000多年的食用历史，与鲥鱼、刀鱼并称为“长江三鲜”，颇受江苏、上海一带消费者的尊崇，素有“拼死吃河豚”和“不吃河豚不知鱼味，吃河豚百味皆无”等说法，足见暗纹东方鲀在长江流域饮食文化中的重要地位。

由于暗纹东方鲀可进入江河或定居于淡水湖中，造成了养殖环境的不同，适合于淡水养殖的暗纹东方鲀和适合于海水养殖的红鳍东方鲀在水溶性及挥发性风味上存在着较大差异，从而影响着人们的食用喜好。国内食用较多的品种为淡水养殖的暗纹东方鲀，而出口较多的品种为海水养殖的红鳍东方鲀。2007年全国河豚鱼养殖就达到了淡水养殖和海水养殖分别为1404吨和10141吨的产量。

但是由于过度捕捞导致野生暗纹东方鲀捕捞量严重下滑，不能满足消费者的主球，我国从20世纪90年代初期开始人工养殖暗纹东方鲀，目前养殖范围遍及江苏、广东和上海等十多个省市，养殖年产量接近4万t，暗纹东方鲀的养殖也已成为上述省市的一项重要的水产养殖产业。由于暗纹东方鲀属于有毒鱼类，在我国的食用受到限制，妨碍了暗纹东方鲀养殖的可持续发展。因此，研究全雄苗种的制种技术，养殖全雄暗纹东方鲀，可以充分利用雄鱼精巢无毒、市场价格高以及可以作为高档化妆品鱼精蛋白的加工原料等优势，对于提高养殖利润和促进产业发展都有重要意义。

迄今为止，有关暗纹东方鲀全雄苗种培育工作的研究仅限于性别分化时期、性别分化相关基因的表达规律 (李延伸, 戴奇, 郭正龙, 朱永祥, 黄波, 周忠良, 2011. 暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)性别分化的组织学及芳香化酶基因表达研究. 复旦学报(自然科学版), 645-652.) 以及芳香化酶抑制剂对性别分化和相关芳香化酶基因表达的影响 (黄波, 杨小玉, 戴奇, 汪奇, 云丹, 周忠良, 2013. 芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响. 中国水产科学, 68-74；汪奇, 郭正龙, 李延伸, 云丹, 黄波, 周忠良, 2012. 来曲唑对暗纹东方鲀性腺分化及相关基因表达的影响. 动物学杂志, 16-23.) 等方面，缺乏全雄苗种制种的基础研究，包括未成熟稚幼鱼性别的无损鉴定方法，特别是雌雄性别差异单碱基突变的等位基因特异PCR方法以及引物国内外尚未见报道。

随着测序技术的不断发展，多种生物的全基因组测序工作宣告完成，决定生物多样性的遗传信息得以揭示，这为各类生物个体差异的鉴定和研究提供了广泛依据。核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指群体中基因组DNA序列上单个核苷酸的变异，生物中的SNP数量多、分布广、高度稳定，并且易于分型，是开发新型分子标记的重要遗传基础。目前，基于SNP的分子标记已经在人类、拟南芥、水稻基因组中大量开发。此外，根据群体中的SNP设计等位基因特异引物，针对性的建立等位基因特异PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)，是检测己知突变位点SNP的一种快速、简便、低成本的有效方法，该方法能够以基因组DNA为模板，仅仅通过简单的PCR和电泳结果就能够进行基因型的鉴定，从而克服其他方法操作较繁琐，耗时较长的缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供了一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法，本发明针对暗纹东方鲀雌雄个体雌雄性别差异基因上单核苷酸突变位点，设计了分别扩增雌雄性别差异基因序列的一对上、下游PCR引物和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物，其中一条含有错配碱基的下游PCR引物，该引物的3’端碱基序列位于突变位点上。利用所述引物，采用双重PCR方法对暗纹东方鲀不同性别DNA样品可以得到不同的扩增结果，从而判断暗纹东方鲀雌雄性别差异。利用本发明所述技术方案能够快速、准确地对暗纹东方鲀未成熟幼鱼的性别进行鉴定。 

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物，所述引物包括扩增雌雄性别差异基因序列的上游引物AWF、下游引物AWR和含有针对单碱基突变位点的错配碱基的下游引物Inner Reverse，

所述上游引物AWF：5’- GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’；

所述下游引物AWR：5’- TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’；

所述下游引物Inner Reverse：

5'- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3'。 

对上述技术方案的进一步改进：所述单碱基突变位点位于暗纹东方鲀BMPR2基因上。

本发明还提供了利用所述引物快速检测暗纹东方鲀幼鱼雌雄性别差异单碱基突变的方法，它包括以下步骤：采集待测暗纹东方鲀幼鱼样品，提取暗纹东方鲀幼鱼的全基因组DNA；采用所述上游引物AWF和下游引物AWR进行第一轮PCR扩增，进行电泳检测，呈现545bp条带的为雌雄性别差异基因序列，将第一轮PCR产物稀释后作为模板，采用所述上游引物AWF和下游引物Inner Reverse进行第二轮PCR扩增，进行电泳检测，扩增出 341bp条带的为暗纹东方鲀雄性个体，该位置无扩增条带的为暗纹东方鲀雌性个体。

对上述技术方案的进一步改进：第一轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括浓度10μM的引物AWF和引物AWR各为1μL，浓度2.5mM 的dNTP 1μL，浓度5U/μL 的Taq DNA聚合酶0.5μL，含Mg²⁺ 15 μM 的10× Buffe 2.5μL，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

对上述技术方案的进一步改进：所述第一轮PCR反应条件为：预变性95℃5min，变性94℃60s，退火58℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

对上述技术方案的进一步改进：第二轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括浓度10μM的引物AWF和引物AWR各为1μL，浓度2.5mM 的dNTP 1μL，浓度5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL，含Mg²⁺ 15 μM 的10× Buffe 2.5μL，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

对上述技术方案的进一步改进：所述第二轮PCR反应条件为：预变性95℃1min，变性94℃60s，退火64℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

对上述技术方案的进一步改进：第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮PCR的模板。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明以暗纹东方鲀幼鱼雌雄个体的基因组DNA为实验材料，针对暗纹东方鲀雌雄个体雌雄性别差异基因上存在的单核苷酸突变位点，设计了分别扩增雌雄性别差异基因序列的一对上游PCR引物AWF、下游PCR引物AWR和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物Inner Reverse。以暗纹东方鲀幼鱼DNA样品为模板进行双重PCR，采用雌雄性别差异基因序列的上游PCR引物AWF和扩增雌雄性别差异基因序列的下游PCR引物AWR进行第一轮PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，呈现545bp条带的为雌雄性别差异基因序列，该序列包含单核苷酸突变位点，将第一轮PCR产物稀释50倍后作为模板，采用扩增雌雄性别差异基因序列的上游PCR引物AWF和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物Inner Reverse进行第二轮PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出 341bp条带的为暗纹东方鲀雄性个体DNA样品，该位置无扩增条带的为暗纹东方鲀雌性个体DNA样品。采取本发明对30尾不同性别暗纹东方鲀幼鱼进行性别鉴定的结果与通过性腺组织切片方法鉴定的结果完全一致，因此通过对本发明的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳就可以对暗纹东方鲀被测样品的性别作出准确判断。

本发明能够以基因组DNA为模板，仅仅通过简单的PCR和电泳结果就能够进行基因型的鉴定，从而克服其他方法操作较繁琐，耗时较长的缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。

本发明成本低廉、操作简单、快速、准确并适合于推广应用，可在提取1龄以内暗纹东方鲀幼鱼基因组DNA的基础上快速准确对暗纹东方鲀幼鱼的性别进行鉴定，对加快暗纹东方鲀单性选育进程及分子生物学领域快速的PCR检测方法研究有着重要的应用价值。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是暗纹东方鲀幼鱼8个个体的性别差异基因的第一轮PCR反应和第二轮PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为分子量标记，从下至上的条带依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大；1、3、5、7泳道为暗纹东方鲀雌性幼鱼，2、4、6、8泳道为暗纹东方鲀雄性幼鱼；9、10、11、12泳道为暗纹东方鲀雄性幼鱼，13、14、15、16泳道为暗纹东方鲀雌性幼鱼。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异的方法包括以下步骤：

1、样品采集

本实施例采用不同性别的暗纹东方鲀幼鱼作为研究对象，所有30个个体均随机抽取自江苏中洋集团养殖的暗纹东方鲀幼鱼群体。每个个体分别取性腺组织放入Bouin’s液中固定24h，50%乙醇冲洗后置于70%乙醇中保存；剪取鳍条组织冷冻保存（-20℃）。

2、暗纹东方鲀幼鱼性腺组织切片和性别分化鉴定

将固定好的暗纹东方鲀幼鱼性腺组织样品采用常规方法进行组织切片，切片厚度4~7μm，H.E染色。用OLYMPUS DP72显微镜观察并拍照，在选取的30个暗纹东方鲀幼鱼个体中，经过切片鉴定后，雌雄个体的比例为21：9。

3、提取暗纹东方鲀幼鱼的全基因组DNA

剪取暗纹东方鲀幼鱼的鳍条部分组织冷冻保存（-20℃），采用天根公司的海洋动物基因组DNA提取试剂盒和方法，经优化后提取暗纹东方鲀幼鱼的基因组总DNA。具体步骤为：首先每个样品取冷冻保存的鳍条组织20mg，加入200μL GA溶液，漩涡震荡15秒，加入20μL Proteinase-K (20mg/mL)漩涡均匀后置于56℃下裂解1小时，然后加入200μL GB，充分混匀后，70℃下放置10分钟，然后加入200μL无水乙醇，充分混合后将溶液和絮状沉淀都加入到1个吸附柱CB3中，12000转/分离心30秒，然后倒掉废液，向吸附柱CB3中加入500μL 缓冲液GD，12000转/分离心30秒，倒掉废液，随后向吸附柱CB3中加入700μL 漂洗液PW，12000转/分离心30秒，倒掉废液，随后向吸附柱CB3中再加入500μL 漂洗液PW，12000转/分离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3 12000转/分离心2分钟，倒掉废液，空气中晾干后置于一个干净的离心管中，向吸附柱中心的吸附膜上加入50-100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟后，12000转/分离心2分钟，收集溶液到离心管中。

4、聚合酶链式反应

本发明DNA模板采用4尾暗纹东方鲀雄鱼和4尾暗纹东方鲀雌鱼的全基因组DNA，各反应成分的组成如下：

所述上游引物AWF：5’- GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’（SEQ ID No:1）；

所述下游引物AWR：5’- TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’ （SEQ ID No:2）；

所述下游引物Inner Reverse：

5'- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3'（SEQ ID No:3）。 

第一轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括：引物AWF（浓度10μM）和AWR（浓度10μM）各为1μL，dNTP（浓度2.5mM） 1μL，Taq DNA聚合酶（浓度5U/μL）0.5μL，10×Buffe（含Mg²⁺ 15 μM） 2.5μL，DNA模板1μL，去离子水 18μL。

第一轮PCR反应条件：预变性95℃5min，变性94℃60s，退火58℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

第二轮PCR扩增体系为25μL反应体系，包括：引物AWF（浓度10μM）和AWR（浓度10μM）各为1μL，dNTP（浓度2.5mM） 1μL，Taq DNA聚合酶（浓度5U/μL）0.5μL，10×Buffe（含Mg²⁺ 15 μM） 2.5μL，DNA模板1μL，去离子水 18μL。 

第二轮PCR反应条件：预变性95℃1min，变性94℃60s，退火64℃45s，延伸72℃45s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。  

5、结果与分析

第一轮和第二轮PCR反应结束后，PCR实验样品采用1%琼脂糖凝胶电泳（110V，20min）将扩增条带进行电泳分离，随后用凝胶成像系统进行检测分析。第一轮PCR结果显示：M为分子量标记（从下至上的条带依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大），1-4泳道为暗纹东方鲀雄性幼鱼，5-8泳道为暗纹东方鲀雌性幼鱼，检测结果如图l所示；泳道所有8个个体均扩增出545bp的性别差异基因条带。

第二轮PCR结果显示：M为分子量标记（从下至上的条带依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp，750bp条带亮度最大）；9、10、11、12泳道为暗纹东方鲀雄性幼鱼，13、14、15、16泳道为暗纹东方鲀雌性幼鱼，检测结果如图1所示，只有4个暗纹东方鲀雄性幼鱼个体能够扩增出341bp的清晰条带，而4个暗纹东方鲀雄性幼鱼个体在250bp-500bp范围内无扩增条带。暗纹东方鲀幼鱼8个个体在提取基因组DNA前已经通过性腺组织切片方法对性别进行了鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测结果与性腺切片鉴定结果完全一致。

本发明所述单碱基突变位点位于暗纹东方鲀BMPR2 (bone morphogenetic protein receptor type-2)基因上。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国水产科学研究院黄海水产研究所

 

<120>  一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ggctaccaga gaagctacaa c                                               21

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tcccagctca gagacagatg gc                                              22

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tgcttccgat accatctgtt gtgcagatc                                       29