与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用

摘要

本发明公开了一种与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用。采用标记引物 Xcnl10 对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，扩增产物在6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得的扩增产物的分子量为700bp，即为小麦株高和穗下节间长主效QTL的分子标记。本发明所提供的小麦株高和穗下节间长主效QTL的分子标记可用于检测小麦品种或品系中是否含有降低株高和穗下节间长的QTL，以便快速筛选出具有降低株高和穗下节间长的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦优异株型品种的选育进程。

说明书

技术领域

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用。

背景技术

       小麦株高与抗倒伏性密切相关，是影响小麦高产、稳产的重要性状，降低株高和提高倒伏性一直是小麦高产育种的重要目标。小麦的株高由多基因或少数主基因加上一系列微效基因或修饰基因控制，表现为典型的数量性状遗传特征。已有许多国内外学者对小麦株高的遗传机制进行了研究，所定位的许多株高QTL几乎遍及小麦的21条染色体。自20世纪60年代国际玉米、小麦改良中心（CIMMYT）的Borlaug NE博士发起的世界第一次“绿色革命”（Khush, Nature Reviews Genetics. 2: 815–822, 2001），“农林10号”矮秆基因被用于小麦育种以来，矮秆基因的研究被越来越多的育种专家重视。虽然目前定名的矮秆基因有25个之多，但是小麦生产中高达90%以上的矮秆与半矮秆品种携带有来自农林10号和赤小麦的矮秆基因，矮源的单一化导致了小麦育成品种的遗传基础狭窄。因此，不断创造和发现新的矮源，丰富矮秆基因的多样性，并通过分子标记技术，研究和开发小麦株高和穗下节间长的基因，降低小麦株高及穗下节间长，在育种工作中具有极其重要的意义。

       迄今，定位于4B染色体的已经命名的矮杆基因为Rht-B1b, 位于4B染色体短臂上（McVittie et al., Heredity. 40:67–70, 1978）；通过数量性状基因位点（Quantitative trait locus，QTL）分析，利用多个作图群体在4BS检测到株高QTL位点(McCartney et al., Genome, 48: 870–883, 2005; Marza et al., Theoretical and Applied Genetics. 112: 688–698, 2006; Zhang et al., Journal of Genetics and Genomics. 35: 119–127, 2008; Mao et al., Euphytica. 174: 343–356, 2010; Cui et al., Theoretical and Applied Genetics. 122: 1517–1536, 2011)。目前，尚未有已经命名的位于4BL矮杆基因及穗下节间长紧密连锁的分子标记的相关报道。

发明内容

本发明的目的就是提供一种与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记及其获取方法和应用，通过获得的与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否具有降低株高和穗下节间长的QTL，以加快小麦优异株型品种的选育进程。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记，该分子标记为Xcnl10，其所述分子标记Xcnl10的上游引物序列：CTTACCTAGTACAATGTACTCTCTCT（如SEQ ID NO:1所述）、下游引物序列：ATGATGGTCTGGATCTGG（如SEQ ID NO:2所述）。

所述分子标记Xcnl10的获取方法，包括以下步骤：采用Xcnl10标记引物，

上游引物序列：CTTACCTAGTACAATGTACTCTCTCT（如SEQ ID NO:1所述）、

下游引物序列：ATGATGGTCTGGATCTGG（如SEQ ID NO:2所述），

对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20μl，包括：1 μl的DNA模板，1 μl的上游引物，1 μl的下游引物，10 μl的2×Taq PCR StarMix，7 μl的ddH₂O；采用梯度降落PCR扩增程序扩增，步骤如下：

（1）94℃变性4 min，

（2）15个循环的复性温度降落程序，每个循环为94℃变性45 s，65℃复性50 s，每个循环在65℃的基础上降低1℃，72℃ 延伸55 s；

（3） 30个循环的普通PCR程序：94oC 变性40 s，50℃复性 40 s，72℃延伸40 s；

（4）72℃ 延伸5 min；结束扩增，15℃保存；

扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离，银染法，获得对应的扩增产物的分子量为700bp，即为与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记。

本发明所述小麦品种科农9204的DNA是指小麦科农9204植株叶片分离提取后获得的DNA。

利用上述分子标记Xcnl10检测小麦品种或品系的方法，包括以下步骤：

 a. 用Xcnl10标记引物对待测小麦品种或品系的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包含：1 μl 的DNA模板，1 μl的上游引物，1 μl的下游引物，10 μl的2×Taq PCR StarMix，和7 μl的ddH2O；采用梯度降落PCR扩增程序扩增：94℃变性4 min；15个循环的复性温度降落程序，每个循环为94℃变性45 s，65℃复性50 s，每个循环在65℃的基础上降低1℃，72℃ 延伸55 s；30个循环的普通PCR程序：94oC 变性40 s，50℃复性 40 s，72℃延伸40 s；72℃ 延伸5 min；结束扩增，15℃保存；

b.将上述扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离后，如能够获得扩增产物的分子量为700bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为在该基因位点上具有降低株高及穗下节间长基因的小麦品种或品系；否则，该小麦品种或品系属于在该位点为不具有降低株高及穗下节间长基因的小麦品种或品系。

所述待检测的小麦品种或品系可以为小麦科农9204为亲本，通过采用常规杂交并繁衍选育至F2代以上的科农9204小麦衍生品种或品系，也可以为其他任意小麦品种或品系。

本发明检测方法中所述小麦品种或品系的DNA是指将小麦植株叶片分离提取后获得的DNA。

本发明中所述6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺。

本发明中2×Taq PCR StarMix为预混的含有优化浓度的高纯度Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、反应缓冲液和稳定剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，本产品品牌为GenStar，由北京康润诚业生物科技有限公司市售商品。

本发明所述小麦品种京411为审定品种，于1991年通过北京市品种审定；1992年通过天津市、山西省和全国品种审定；京411可以从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984；科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。

本发明公开的小麦株高和穗下节间长紧密连锁的分子标记Xcnl10充分体现了小麦品种或品系的株高和穗下节间长主效QTL，通过分子标记对小麦品种或品系PCR扩增，可以快捷地对小麦品种或品系是否具有株高和穗下节间长的QTL进行判断，从而可以筛选出具有降低株高和穗下节间长QTL的小麦品种或品系，加快小麦品种的选育进程。

将本发明提供的与小麦株高和穗下节间长紧密连锁的分子标记方法用于小麦育种，只需检测这些标记的扩增条带特性，可以判断株高主效基因位点的增效变异存在与否，来预测小麦的株高表型，用于指导小麦株高改良的育种工作，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦株型育种开拓更多新的矮杆遗传资源。

附图说明

图1为小麦品种科农9204的株高和穗下节间长主效QTL在染色体4BL上的作图区间；图中：空心长方形代表染色体，其上端阴影部分代表着丝粒位置，右侧是分子标记的名称，左侧数字是标记在染色体上的位置，单位是cM；图中共有六种分子标记，Leaftype是形态标记，Xme为SRAPs标记，wPt是DArTs标记，Xwmc和Xbarc均为g-SSR标记，Xcnl和Xcfe均为e-SSR标记，Xmag为STS标记，标有黑色下划线的标记为Xcnl10；染色体右下方黑色和灰色的长方形分别表示株高和穗下节间长在各个环境下的QTL作图区间，其中Ph代表株高，Pl代表穗下节间长。

图2为科农9204中与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的标记引物Xcnl10及与小麦株高和穗下节间长主效QTL不紧密连锁的标记引物Xmag2055、Xmag4087在574个科农9204半矮秆衍生品种（系）的遗传传递结果统计图。

图3为小麦品种科农9204为亲本的F₆代RIL群体的41个衍生品系用Xcnl10标记引物进行PCR扩增的电泳条带图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记，

采用标记引物Xcnl10，

上游引物序列：CTTACCTAGTACAATGTACTCTCTCT（如SEQ ID NO:1所述）、

下游引物序列：ATGATGGTCTGGATCTGG（如SEQ ID NO:2所述）；

对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20μl，包括：1 μl的DNA模板，1 μl的上游引物，1 μl的下游引物，10 μl的2×Taq PCR StarMix，7 μl的ddH₂O；采用梯度降落PCR扩增程序，步骤如下：首先94℃变性4 min， 其次进行15个循环的复性温度降落程序，每个循环为94℃变性45 s，65℃复性50 s，每个循环在65℃的基础上降低1℃，72℃ 延伸55 s；再次进行 30个循环的普通PCR程序，即：94oC 变性40 s，50℃复性 40 s，72℃延伸40 s； 最后72℃ 延伸5 min；结束扩增，15℃冰箱保存；将扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离，银染法，获得对应的扩增产物的分子量为700bp。

PCR程序采用的型号为：TaKaRa PCR Thermal Cycler ，本发明中所有的PCR扩增均采用该型号PCR仪，该PCR仪不限制发明内容。

本发明提供的与小麦株高与穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记的筛选方法，具体包括以下步骤：

（i）以半矮杆、穗下节间长较短的小麦品种科农9204为母本、以高杆、穗下节间长较长的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交产生的F2，采用单粒传法获得含有188个家系的F6代RIL群体；

（ii）用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化铵法（Vander Beek et al.,1992）提取上述RIL群体各株系的DNA，采用多样性微阵列技术（DArTs标记）、简单序列重复标记（SSR标记）、基于表达序列标签的简单重复序列标记（EST-SSR标记）、基于表达序列标签PCR扩增标记（STS标记）、简单重复序列间扩增标记（ISSR标记）以及相关序列扩增多态性标记（SRAP标记）对所述家系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型值材料；DArTs标记分析是通过与芯片杂交的技术来辨别不同基因组之间多态性的方法，将各株系基因组DNA经过两种不同切割频率的限制性内切酶酶切，再利用切割频率较低的限制性内切酶识别序列的接头与酶切片段相连接，继而通过与该酶切接头相对应的引物来实现对该特异片段的PCR扩增。将扩增子用于构建克隆文库，进而将其经过荧光标记，经变性后点于芯片上作为探针。所要检测的目标DNA也需要经过同样的内切酶切割和PCR扩增，让后将其与经过荧光标记的靶序列探针杂交，获得所述RIL群体的基因型值数据；

改良的CTAB法提取叶片DNA的步骤包括：取0.2g左右的新鲜叶片放入2.0ml离心管中，快速加入液氮中10 s左右，快速磨成细粉；加CTAB提取液0.6ml，摇匀，65℃水浴30min；12000rpm离心10min，取上清，移至另一管；加等体积的氯仿/异戊醇，混匀10min；12000rpm离心10min，取上清（勿吸蛋白层），移至另一管；加等体积的氯仿/异戊醇，混匀10min；1200rpm离心10min，取上清（勿吸蛋白层），移至另一管1200rpm离心10min,取上清（勿吸蛋白层），移至另一管； 加1/10V 3M NaAc(Ph=5.2)，混匀，加2倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀，白色絮状沉淀产生，放-20℃冰箱约20 min，增加DNA产量；8000 rpm离心6min，倒出上清液；将沉淀用70%酒精洗涤，倒出70%酒精，风干； 至无酒精味，加100ul TE溶解，放-20℃冰箱长期保存；

（iii）利用MAPMAKER 3.0作图软件，将获得的RIL群体基因型资料构建具有591个标记位点的小麦分子标记遗传连锁图谱，以LOD≥2.5为标准；591个标记中包含287个DArTs标记、178个g-SSR标记、50个e-SSR标记、17个STS标记、45个SRAPs标记、5个ISSRs标记、7个功能性PCR标记和2个形态标记；

（iv）将RIL群体进行了两年共8个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的株高及穗下节间长，其中8个环境即：2011–2012、2012–2013连续2年在中国科学院栾城农业生态系统试验站（T1及T2：37°53’N，114°41’E）、2012–2013年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场（T3：40°06’N，116°24’E）及河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地（T4：35°27’N，113°48’E）种植，每试验环境分高氮（High nitrogen，HN）和低氮（Low nitrogen，LN）两个处理。

其中LN处理，全年不施肥；而HN处理，每年播种前施300 kg·hm-2磷酸二胺和225 kg·hm-2尿素作为底肥，拔节期施150 kg·hm-2尿素追肥；

其中小麦种植方法：每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5 cm，行距25 cm，正常生长及收获；株高测定方法：收获后每个株系随机选择5棵，测量地上低端部到穗部顶端的长度（不包括芒长），取其平均值计算各家系株高；穗下节间长（Peduncle length，PL，cm）：收获后每个株系随机选择5棵，测量穗下部第一节间长的长度，取其平均值计算各家系穗下节间长；

（v）利用MAPMAKER/EXP 3.0 软件（Lander et al.，1987）构建连锁图谱。将8个单一环境中直接调查得到的株高及穗下节间长表型值，按照IciMapping v3.3的BIP模块格式要求整理后，进行加性QTL定位。以1cM为步进区间，进行1000次置换检验，确定LOD阈值；

（vi）由QTL分析可得，在染色体4BL上分别检测到8个环境下稳定表达的株高QTL和5个环境下稳定表达的穗下节间长QTL，其置信区间为Xmag4087–wPt-1046，如图1和表1所示；

表1 株高和穗下节间长的QTL分析结果

由表1所示，这13个QTL峰值均在Xcnl10附近，其中河北（2011–2012高、低氮、2012–2013高、低氮）、北京（2012–2013低氮）、河南2012–2013高、低氮）共计7个环境下的株高QTL峰值距Xcnl10的距离仅为0.20 cM；北京（2012–2013高氮）环境下的株高QTL峰值及河北（2012–2013高氮）环境下的穗下节间长QTL峰值距Xcnl10的距离均为0.80 cM；河北（2011–2012高氮）、河北（2012–2013低氮）、河南（2012–2013高氮）及河南（2012–2013低氮）环境下的穗下节间长QTL峰值距Xcnl10的距离分别为9.20 cM、6.20 cM、6.20 cM和8.20 cM。这13个QTL的贡献率最高达30.91%，最低的为9.33%，且所有的QTL加性效应值均为负值。在Xmag4087–wPt-1046区间内，8个环境中检测到了株高QTL，并且QTL的平均贡献率为23.10%；在5个环境下检测到了穗下节间长QTL，平均贡献率为14.80%。说明在Xmag4087–wPt-1046区间内检测到的是与小麦株高和穗下节间长连锁稳定、主效的QTL，其标记引物Xcnl10在小麦品种科农9204的DNA中获得的扩增产物分子量为700bp，即为与小麦株高和穗下节间长QTL连锁的分子标记。

实施例2

本发明提供的与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记在小麦品系科农9204为亲本的574个半矮秆衍生品种（系）中的应用。

利用574个科农9204半矮秆衍生品种（系）进行小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记应用验证研究。其具体步骤如下：

（1）将574个科农9204半矮秆衍生品种（系）进行田间种植，取各株系的植株的叶片采用所述改良的CTAB方法进行分离提取获得的DNA；

所述的574个科农9204半矮秆衍生品种（系）及其系谱见表2，由以科农9204为亲本，通过采用常规杂交繁衍至F₂代以上，然后结合株高及产量性状综合表现通过系选而获得的小麦新品种或品系；

表2  574个科农9204半矮秆衍生品种（系）及其系谱表

（2）采用与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的标记引物Xcnl10及与小麦株高和穗下节间长主效QTL不紧密连锁的标记引物Xmag2055、Xmag4087将获得的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为：1 μl 的DNA模板，1 μl的正向引物，1 μl的反向引物，10 μl的2×Taq PCR StarMix，7 μl的ddH₂O；扩增条件为梯度降落PCR：94℃变性4 min, 接着15个循环的复性温度降落程序，每个循环 94℃变性45 s，65℃复性50 s (–1℃/循环) 和72℃ 延伸55 s；最后30 个循环的普通PCR程序即：94℃变性40 s，50℃复性 40 s，72℃延伸40 s；最后72℃ 延伸5 min；扩增结束后15℃保存；扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离，银染法检测其扩增片段大小；

（3）与小麦株高和穗下节间长主效QTL不紧密连锁的标记引物Xmag2055、Xmag4087的序列见表3，其在科农9204中分别扩增出195bp和530bp的DNA片段；

表3 与小麦株高和穗下节间长主效QTL不紧密连锁的标记引物Xmag2055、Xmag4087的DNA序列及扩展片段分子量

（4）对检测结果进行分析，Xcnl10的扩增产物分子量为700bp的分子标记出现，即扩增产物与科农9204的扩增产物一致的品种或品系为具有半矮秆、较短穗下节间长的衍生品系；Xmag2055、Xmag4087的扩增产物分子量分别为195bp和530bp的分子标记出现，表明科农9204衍生后代遗传了科农9204的遗传物质。

具体结果如下：采用与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的标记引物Xcnl10及与小麦株高和穗下节间长主效QTL不紧密连锁的标记引物Xmag2055、Xmag4087对574个科农9204半矮秆衍生品种（系）的DNA进行PCR扩增，科农9204对应的扩增片段在其衍生后代中的传递结果如图2所示。

从图2可以看出，与小麦株高和穗下节间长主效QTL紧密连锁的分子标记Xcnl10在574个科农9204半矮秆衍生品种（系）的扩增带型均与科农9204相同，与其对应的株高半矮秆性状完全对应；与小麦株高和穗下节间长主效QTL不紧密连锁的标记引物Xmag2055、Xmag4087在表明Xcnl10在574个科农9204半矮秆衍生品种（系）的扩增带型分别有52.8%及55.9%与科农9204相同，与其对应的株高半矮秆性状不完全对应；上述结果证明分子标记Xcnl10为与小麦株高和穗下节间长紧密连锁的分子标记，该分子标记可以很有效地用于小麦株型分子标记辅助选择育种程序之中。

实施例3

本发明提供的与小麦株高和穗下节间长的主效基因位点紧密连锁的分子标记Xcnl10在小麦品种科农9204为亲本的F₆代RIL群体的41个衍生品系及科农9204和京411中的应用。

以科农9204为母本、京411作父本配制组合，通过单粒传法（SSD法）构建了F7重组自交系群体（RIL群体）。用标记引物Xcnl10对京411、科农9204及41个衍生品系进行了分析。其具体步骤如下：

（1）将小麦品种科农9204、京411及41个衍生品系进行田间种植，取各株系的植株叶片采用所述SDS法进行分离提取DNA；其中科农9204的衍生品系是指：以科农9204作母本，京411作父本，通过单粒传法获得的株系；

（2）采用Xcnl10的上游引物（如SEQ ID NO:1所述）和下游引物（如SEQ ID NO:1所述）将获得的DNA进行PCR扩增，对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20μl，包括：1 μl的DNA模板，1 μl的上游引物，1 μl的下游引物，10 μl的2×Taq PCR StarMix，7 μl的ddH₂O；采用梯度降落PCR扩增程序扩增：首先94℃变性4 min，其次进行15个循环的复性温度降落程序，每个循环为94℃变性45 s，65℃复性50 s，每个循环在65℃的基础上降低1℃，72℃ 延伸55 s；再次进行30个循环的普通PCR程序，即：94oC 变性40 s，50℃复性 40 s，72℃延伸40 s；最后72℃ 延伸5 min；结束扩增，15℃冰箱保存；将扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离，银染法检测；

（3）对检测结果进行分析，如Xcnl10标记引物得到的扩增产物中出现分子量大小为700 bp的条带，即扩增产物均与科农9204的扩增产物一致的品系为具有降低株高和穗下节间长基因位点的品系。

结果如图3所示，图3中泳道1-44分别为京411（J）、科农9204（KN）、DNA Marker（M）及科农9204的41个衍生品系1-41。其中，带型与科农9204带型相同的为携带所述降低株高和穗下节间长基因位点的衍生品系，即衍生品系1、6、10、11、12、13、14、18、22、27、30、32、34、37、38及41，这些衍生品系是可用于下一步矮杆优异株型高产育种的品系；而京411及衍生品系2、3、4、5、7、8、9、15、16、17、19、20、21、23、24、25、26、28、29、31、33、35、36、39及40扩增产物的电泳分离带型与科农9204带型不同，即这些品系不具有所述降低株高及穗下节间的基因位点。

由此证明：利用Xcnl10进行分子标记辅助选择，可有效筛选具有降低株高、穗下节间长的主效基因位点的品种或品系，该标记用于小麦辅助育种可大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。