人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细胞株

摘要

本发明公开了一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株。该细胞株是保藏号为CCTCC NO：C2012151的人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细胞株，所述的耐药细胞株具有临床上的人口腔鳞癌的生物学性状，是研究人口腔鳞癌细胞的耐药机制的理想模型。

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日，2013年1月17日；申请号， 201310017722.3；发明创造名称，人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株的培养方 法及培养所得的细胞株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐 药细胞株。

背景技术

在我国，口腔颌面部的恶性肿瘤以癌为最常见，肉瘤较少。在癌瘤中又 以鳞状细胞癌为最多见，一般占80％以上；其次为腺性上皮癌(如黏液表皮 样癌、腺癌、腺样囊性癌、恶性多形性腺瘤、腺泡细胞癌等)及未分化癌。 鳞状细胞癌常向区域淋巴结转移，晚期可发生远处转移。针对鳞状细胞癌， 虽然目前已经开发出了很多的治疗药物并且已经被有效应用于临床上，然 而，在众多的化疗过程中经常遇到耐药和多药联用耐药的情况。耐药性一般 由众多因素导致，其中不容忽视的是个体化基因的差异，差异基因的筛查与 深入的耐药分子机制研究对未来的临床治疗有很深远的意义。传统诱导与筛 选的方法建立的口腔鳞癌细胞株由于大剂量给药对细胞状态影响较大，造成 差异基因的人为改变，不利于后期筛查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前常规方法筛选得到的人口 腔鳞癌耐药细胞株容易因人为因素造成基因改变的缺陷，而利用人口腔鳞癌 CAL-27细胞作为亲本细胞，选用临床常用肿瘤化疗药物作为筛选药物，在 体外模拟人体体内给药后药物的真实作用过程，从而建立起一套稳定有效的 耐药细胞株筛选体系和方法。

本发明提供的技术方案之一是：

一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株的培养方法，其包括如下步骤：

(1)在细胞培养皿中种植人口腔鳞癌CAL-27亲本细胞，细胞长至贴 壁后待融合率达到30～40％时加入筛选药物，初始浓度采用该药物的IC₂₀值，连续作用24～72小时后洗去死细胞并扩增存活的细胞；

(2)待细胞重新处于对数生长期时，将细胞重复步骤(1)中所述洗去 死细胞并扩增存活的细胞的操作，并将筛选药物的浓度提高一倍进行作用， 在筛选药物的浓度提高至第一定值时，降低药物浓度增加倍数，在筛选药物 的浓度加至第二定值时，将细胞经过冻存后复苏细胞，即制得人口腔鳞癌 CAL-27耐药细胞株；所述第一定值的判断标准是指到该第一定值的下一个 倍增值时，观察到细胞大量死亡，细胞状态变差，所述第二定值的判断标准 是细胞在该第二定值的反复作用下能够正常生长，到该第二定值下一个倍增 值时细胞增殖不受影响，细胞生长正常。

本发明中，步骤(1)较佳地在细胞长至贴壁后待融合率达到35～40％ 时加入筛选药物；步骤(1)较佳地在连续作用36～48小时后洗去死细胞并 扩增存活的细胞；所述的筛选药物为临床上常用的肿瘤化疗药物，较佳地选 自5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)和羟基喜树碱(HCPT)中的任一种； 所述的药物的IC₂₀值为临床上常规的概念，指诱导肿瘤细胞凋亡20％时该药 物的浓度。

本发明中，步骤(2)所述将细胞经过冻存后复苏细胞的操作较佳地为 在细胞生长良好，细胞对药物耐受增加，基本不出现凋亡时，将细胞冻存3 个月后复苏细胞。

本发明中，较佳地，在步骤(1)之前还包括如下步骤：

(a)取生长状态良好、处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞，用 胰酶消化计数；

(b)在细胞培养容器中种植8组细胞，每组3个重复样品，每个样品 加入细胞数为8000个，待细胞生长至贴壁；

(c)在含10％FBS的高糖DMEM完全培养基中添加步骤(1)所述筛 选药物形成浓度梯度，并加入对应组别的样品细胞中，使该筛选药物对细胞 发挥作用，待药物作用48小时后，加入MTT孵育4小时，然后加入三联溶 解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解，取样于OD595nm检测 读值，计算IC₅₀浓度，并根据IC₅₀浓度的值计算该筛选药物的IC₂₀浓度。

本发明中，步骤(a)所述用胰酶消化计数的操作中，所取的CAL-27 细胞的数量与所用的胰酶数量之间的比例为本领域常规，只要胰酶能将待消 化的细胞全部覆盖浸润即可；优选地，所取的CAL-27细胞的数量与所用的 胰酶数量之间的比例为：每3×10⁶个细胞用1ml 10mol/ml的胰酶消化。

本发明中，步骤(b)所述的细胞培养容器为本领域常规，优选96孔板。

本发明中，优选地，步骤(c)所述的筛选药物为5-氟尿嘧啶(5-Fu)、 顺铂(CDDP)和羟基喜树碱(HCPT)中的任一种。

本发明中，优选地，步骤(c)所述的浓度梯度包括如下浓度：0μg/ml、 0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28 μg/ml。

本发明中，优选地，步骤(c)所述的计算IC₅₀浓度的方法采用《定量 药理学》(孙瑞元著，人民卫生出版社出版，1987)中所述的改良寇氏法， 所述的改良寇氏法如表1所示：

表1

本发明提供的技术方案之二是：一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株， 其是保藏号为CCTCC NO：C2012149的人口腔鳞癌CAL-27-5-Fu耐药细胞 株。

本发明的耐药细胞株由前述培养方法培养所得。

本发明还提供如前所述的人口腔鳞癌CAL-27-5-Fu耐药细胞株的子代 细胞；以及如前所述的人口腔鳞癌CAL-27-5-Fu耐药细胞株在制备于哺乳动 物中产生鳞状细胞癌的试剂中的用途。

本发明提供的技术方案之三是：一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株， 其是保藏号为CCTCC NO：C2012150的人口腔鳞癌CAL-27-CDDP耐药细 胞株。

本发明的耐药细胞株由前述培养方法培养所得。

本发明还提供如前所述的人口腔鳞癌CAL-27-CDDP耐药细胞株的子代 细胞；以及如前所述的人口腔鳞癌CAL-27-CDDP耐药细胞株在制备于哺乳 动物中产生鳞状细胞癌的试剂中的用途。

本发明提供的技术方案之四是：一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株， 其是保藏号为CCTCC NO：C2012151的人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细 胞株。

本发明的耐药细胞株由前述培养方法培养所得。

本发明还提供如前所述的人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细胞株的子代 细胞；以及如前所述的人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细胞株在制备于哺乳 动物中产生鳞状细胞癌的试剂中的用途。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)人口腔鳞癌细胞系CAL-27是一个良好的体外模型。临床用于治 疗此类肿瘤的化疗药物在使用的过程中经常出现类似其他肿瘤的耐药性问 题，病人对药物的原发敏感差异影响了实际的化疗效果。本发明的人口腔鳞 癌CAL-27耐药细胞株性状稳定，可稳定多次传代，方便对导致细胞耐药的 分子机制进行深入研究。通常的研究策略是探寻某一个或一类基因发生突变 或表达谱差异，然后应用于临床化疗前的快速诊断，对指导临床用药意义深 远。

(2)本发明的人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株具有临床上的人口腔鳞 癌的生物学性状，是研究人口腔鳞癌细胞的耐药机制的理想模型，大大方便 了对其生物学特性及耐药表型的变化进行研究。

(3)抗肿瘤药物的最大缺点是易产生耐药性而使化疗失效，而且，通 常情况下，某种耐药细胞常常会对多种药物有交叉耐药现象，即一种药物的 使用导致机体对其他作用机制类似的药物的耐受。本发明建立的这套细胞模 型，可以准确提示机体对其他药物的耐药性，对指导临床用药具有重要意义。

生物材料的保藏

本发明的人口腔鳞癌CAL-27-5-Fu耐药细胞株，于2012年10月25日 保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC NO：C2012149，名称为人口腔鳞癌5-Fu耐药株CAL-27-5-Fu；

本发明的人口腔鳞癌CAL-27-CDDP耐药细胞株，于2012年10月25 日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC NO：C2012150，名称为人口腔鳞癌顺铂耐药株CAL-27-CDDP；

本发明的人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细胞株，于2012年10月25 日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC NO：C2012151，名称为人口腔鳞癌HCPT耐药株CAL-27-HCPT。

附图说明

图1为实施例1中CAL-27细胞和CAL-27-5-Fu耐药细胞株的生长曲线 图；

图2为实施例1中CAL-27细胞和CAL-27-5-Fu耐药细胞株的微观结构 图，其中，(a)为CAL-27细胞，(b)为CAL-27-5-Fu耐药细胞株；

图3为实施例1中CAL-27细胞和CAL-27-5-Fu耐药细胞株的细胞运动 性微观比较图，其中，(a)为CAL-27细胞，(b)为CAL-27-5-Fu耐药细胞 株；

图4为实施例1中CAL-27细胞和CAL-27-5-Fu耐药细胞株的细胞运动 性比较图。

图5为实施例2中CAL-27细胞和CAL-27-CDDP耐药细胞株的生长曲 线图；

图6为实施例2中CAL-27细胞和CAL-27-CDDP耐药细胞株的微观结 构图，其中，(a)为CAL-27细胞，(b)为CAL-27-CDDP耐药细胞株；

图7为实施例2中CAL-27细胞和CAL-27-CDDP耐药细胞株的细胞运 动性微观比较图，其中，(a)为CAL-27细胞，(b)为CAL-27-CDDP耐药 细胞株；

图8为实施例2中CAL-27细胞和CAL-27-CDDP耐药细胞株的细胞运 动性比较图。

图9为实施例3中CAL-27细胞和CAL-27-HCPT耐药细胞株的生长曲 线图；

图10为实施例3中CAL-27细胞和CAL-27-HCPT耐药细胞株的微观结 构图，其中，(a)为CAL-27细胞，(b)为CAL-27-HCPT耐药细胞株；

图11为实施例3中CAL-27细胞和CAL-27-HCPT耐药细胞株的细胞运 动性微观比较图，其中，(a)为CAL-27细胞，(b)为CAL-27-HCPT耐药 细胞株；

图12为实施例3中CAL-27细胞和CAL-27-HCPT耐药细胞株的细胞运 动性比较图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所用到的部分试剂和材料如下：

生物安全柜：BHC-II A2，苏州苏洁净化设备有限公司产品。

CO₂培养箱：3111，Thermo公司产品。

离心机：TDZ5-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品。

显微镜：XSP-8CA，上海光学仪器厂产品。

液氮罐：成都金凤液氮容器有限公司产品。

5-Fu、CDDP和HCPT：上海旭东海普药业有限公司产品。

细胞培养基(DMEM)：sh30243.01B，Hyclone公司产品。

血清：Hyclone公司产品。

抗生素：Thermo公司产品。

PBS：Thermo公司产品。

胰酶：Thermo公司产品。

MTT：sigma公司产品。

实施例1人口腔鳞癌CAL-27/5-Fu耐药细胞株的筛选

本实施例以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为筛选药物诱导筛选CAL-27细胞，建 立CAL-27/5-Fu耐药细胞株，并检测耐药细胞的特性。

一、亲代细胞培养：

人口腔鳞癌CAL-27(ATCC NO.为CRL-2095)细胞生长于含10％的FBS 的高糖DMEM培养基中，置入含5％CO₂、37℃培养箱中培养。

二、亲代细胞IC₅₀的测定与IC₂₀的计算

药物：5-氟尿嘧啶(5-Fu)

用药剂量：设计8个药物浓度梯度(0μg/ml、0.02μg/ml、0.04μg/ml、 0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml)，采用MTT法 测量CAL-27细胞的IC₅₀浓度。MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，其汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑 -2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐。

MTT法又称为MTT比色法，其是一种检测细胞存活和生长的方法。其 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶 性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。三联 溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)能溶解细胞中的甲瓒，用 酶联免疫检测仪在595nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

MTT法的具体步骤如下：

(1)将细胞种植于96孔中(2000个/孔)；

(2)加入MTT溶液(5mg/ml)20μl于96孔中，37℃孵育4小时；

(3)加入三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解甲 臜，595nm测定细胞OD值。

采用改良寇氏法计算出CAL-27细胞的IC₅₀浓度为1.65μg/ml，计算出 IC₂₀的浓度为0.53μg/ml，作为筛选的初始浓度。

三、人口腔鳞癌耐药细胞株的诱导

取生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞，胰酶消 化计数。在96孔板中种植8组细胞，每组3个重复，每孔加入细胞数为8000 个/100μl。次日待细胞贴壁后，配置8个药物浓度梯度(0μg/ml、0.02μg/ml、 0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml)的 培养基(培养基为含10％FBS的高糖DMEM完全培养基，添加药物至具体 的终浓度)，对应组别加入孔板中，药物作用48小时后，加入MTT孵育4 小时，三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解后OD_595nm 检测读值。通过MTT法及改良寇氏法计算得出CAL-27细胞的IC₅₀浓度为 1.65μg/ml，采用IC₂₀的浓度0.53μg/ml作为筛选的初始浓度。在6cm细胞培 养皿中种植细胞，融合率达到35％。贴壁后加入5-氟尿嘧啶作用，初始浓度 采用IC₂₀为0.53μg/ml，连续作用48小时。洗去死细胞，扩增存活的细胞。 (此处“洗去”指将含有死细胞的培养基用吸头洗弃，再洗取1ml PBS加入 培养皿中，轻轻晃动并拍打。等死细胞都飘离时，将PBS洗弃。“扩增”指 在存活的细胞量较少的情况下补充新鲜培养基，让细胞进行扩增生长，等到 细胞融合率达到80％时，进入下一个药物处理周期。)待细胞重新出于对数 生长期时，将细胞重复上述步骤，并将药物浓度提高一倍进行作用。在药物 浓度达到4.24μg/ml时，降低药物浓度增加倍数。待药物浓度加至5μg/ml 时，细胞生长良好，细胞对药物耐受增加。将细胞冻存3个月，复苏检测存 活率。其结果如表2所示：

表2

细胞类型 复苏存活率 CAL-27 90％ CAL-27/5-Fu 85％

四、细胞传代的方法和过程

细胞传代的方法和过程如下：

(1)吸弃旧的培养基；

(2)用PBS清洗细胞1-2次；

(3)加入0.25％的胰酶消化细胞；

(4)用10％FBS完全培养基终止胰酶反应；

(5)吸头吹打细胞以分散；

(6)离心机1500rpm离心3min；

(7)吸弃上清,用新鲜培养基重悬细胞；

(8)在培养皿中加入适量细胞悬液；

(9)放入37℃，CO2培养。

五、耐药细胞株的特性测试

1、多药耐药测定

取1ml生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞和 CAL-27/5-Fu耐药细胞株，胰酶消化计数。在96孔板中种植8组细胞，每组 3个重复，每孔加入细胞数为8000个/100μl。次日待细胞贴壁后，配置6种 化疗药物，包括5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、羟基喜树碱(HCPT)、 紫杉醇(TAX)、甲氨蝶呤(MTX)和奥沙利铂(L-OHP)，每种药物设置8 个药物浓度梯度(浓度梯度分别为5-Fu：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；CDDP：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、 2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；HCPT：0μg/ml、0.04μg/ml、 0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml、2.56μg/ml；TAX： 0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.4μg/ml、 12.8μg/ml；MTX：0μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、 64μg/ml、128μg/ml；L-OHP：0μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、 125μg/ml、625μg/ml、1250μg/ml)的培养基，加入对应组别的孔板中，药 物作用48小时后，加入MTT孵育(放入37℃，CO₂培养箱孵育)4小时， 三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解后OD₅₉₅nm检测 读值。

以MTT法测定耐药指数。结果如表3所示。CAL-27/5-Fu细胞耐药指 数为11.667，与亲本细胞相比差异显著(P<0.01)，而且除对5-氟尿嘧啶 (5-Fu)有耐药性外，对紫杉醇(TAX)和甲氨蝶呤(MTX)等也有一定的 交叉耐药。

表3

**p<0.01，*p<0.05

2、细胞生长曲线和群体倍增时间

取生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞和 CAL-27/5-Fu耐药细胞株，胰酶消化计数。在96孔板中每孔种植细胞2000 个细胞。每组重复5次，连续培养5天，加入MTT，OD_595nm测定5天的细 胞的增殖情况，绘制细胞生长曲线，如图1所示。从细胞生长曲线可以看出 CAL-27/5-Fu细胞较亲本细胞CAL-27增值促进。(p<0.01)

3、细胞形态观察

通过相差显微镜拍照系统观察细胞并取像，如图2所示。从图2可以看 出，CAL-27/5-Fu细胞较亲本细胞CAL-27胞体增大，核仁增大，细胞内颗 粒增粗，与细胞增加表面积、排出毒性物质有关。

4、细胞运动性

通过Transwell检测细胞的运动性。取生长状态良好，处于对数生长期 的人口腔鳞癌CAL-27细胞和CAL-27/5-Fu耐药细胞株，胰酶消化计数，用 无血清培养基(hyclone的DMEM基础培养基的货号为sh30243.01B)洗去 细胞表面血清。每个小室种植10万个细胞，上层小室为含0.1％BSA的高糖 DMEM培养基(hyclone的DMEM基础培养基的货号为sh30243.01B，然后 加入0.1％BSA，配成上室细胞培养液)，下室为含10％FBS的DMEM完全 培养基。5％CO₂、37℃培养24小时。4％多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色拍 照，结果如图3和图4所示。从图3和图4中可以看出，CAL-27/5-Fu细胞 较亲本细胞CAL-27的细胞运动性显著下降。

实施例2人口腔鳞癌CAL-27/CDDP耐药细胞株的筛选

以顺铂(CDDP)药物诱导筛选CAL-27细胞，建立CAL-27/CDDP耐药 细胞株，并检测耐药细胞的特性。

一、亲代细胞培养：操作同实施例1。

二、亲代细胞IC₅₀的测定与IC₂₀的计算

药物：顺铂(CDDP)

用药剂量：同实施例1。

采用改良寇氏法计算出CAL-27细胞的IC₅₀浓度为2.333μg/ml，计算出 IC₂₀的浓度为0.75μg/ml，作为筛选的初始浓度。

三、人口腔鳞癌耐药细胞株的诱导

取生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞，胰酶消 化计数。在96孔板中种植8组细胞，每组3个重复，每孔加入细胞数为8000 个/100μl。次日待细胞贴壁后，配置8个药物浓度梯度(0μg/ml、0.02μg/ml、 0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml)的 培养基(培养基为含10％FBS的高糖DMEM完全培养基，添加药物至具体 的终浓度)，对应组别加入孔板中，药物作用48小时后，加入MTT孵育4 小时，三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解后OD_595nm检测读值。通过MTT法及改良寇氏法计算得出CAL-27细胞的IC₅₀浓度为 2.333μg/ml，采用IC₂₀的浓度0.75μg/ml作为筛选的初始浓度。在6cm细胞 培养皿中种植细胞，融合率达到30％。贴壁后加入顺铂作用，初始浓度采用 IC₂₀为0.75μg/ml，连续作用24小时。洗去死细胞，扩增存活的细胞。(此 处“洗去”指将含有死细胞的培养基用吸头洗弃，再洗取1ml PBS加入培养 皿中，轻轻晃动并拍打。等死细胞都飘离时，将PBS洗弃。“扩增”指在存 活的细胞量较少的情况下补充新鲜培养基，让细胞进行扩增生长，等到细胞 融合率达到80％时，进入下一个药物处理周期。)待细胞重新出于对数生长 期时，将细胞重复上述步骤，并将药物浓度提高一倍进行作用。在药物浓度 达到3.0μg/ml时，降低药物浓度增加倍数。待药物浓度加至3.5μg/ml时， 细胞生长良好，细胞对药物耐受增加。将细胞冻存3个月，复苏检测存活率。 其结果如表4所示：

表4

细胞类型 复苏存活率 CAL-27 95％ CAL-27/CDDP 85％

四、细胞传代的方法和过程

细胞传代的方法和过程同实施例1。

五、耐药细胞株的特性测试

1、多药耐药测定

取1ml生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞和 CAL-27/CDDP耐药细胞株，胰酶消化计数。在96孔板中种植8组细胞，每 组3个重复，每孔加入细胞数为8000个/100μl。次日待细胞贴壁后，配置6 种化疗药物，包括5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、羟基喜树碱(HCPT)、 紫杉醇(TAX)、甲氨蝶呤(MTX)和奥沙利铂(L-OHP)，每种药物设置8 个药物浓度梯度(浓度梯度分别为5-Fu：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；CDDP：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、 2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；HCPT：0μg/ml、0.04μg/ml、 0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml、2.56μg/ml；TAX： 0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.4μg/ml、 12.8μg/ml；MTX：0μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、 64μg/ml、128μg/ml；L-OHP：0μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、 125μg/ml、625μg/ml、1250μg/ml)的培养基，加入对应组别的孔板中，药 物作用48小时后，加入MTT孵育(放入37℃，CO₂培养箱孵育)4小时， 三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解后OD_595nm检测读 值。

以MTT法测定耐药指数。结果如表5所示。CAL-27-CDDP细胞耐药指 数为3.578，与亲本细胞相比差异显著(P<0.05)，而且除对顺铂(CDDP) 有耐药性外，对5-氟尿嘧啶(5-Fu)和甲氨蝶呤(MTX)等也有一定的交叉 耐药。

表5

*p<0.05

2、细胞生长曲线和群体倍增时间

取生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞和 CAL-27-CDDP耐药细胞株，胰酶消化计数。在96孔板中每孔种植细胞2000 个细胞。每组重复5次，连续培养5天，加入MTT，OD_595nm测定5天的细 胞的增殖情况，绘制细胞生长曲线，如图5所示。从细胞生长曲线可以看出 CAL-27-CDDP细胞较亲本细胞CAL-27增值促进。(p<0.05)

3、细胞形态观察

通过相差显微镜拍照系统观察细胞并取像，如图6所示。从图6可以看 出，CAL-27-CDDP细胞较亲本细胞CAL-27胞体增大，核仁增大，细胞内 颗粒增粗，与细胞增加表面积、排出毒性物质有关。

4、细胞运动性

通过Transwell检测细胞的运动性。取生长状态良好，处于对数生长期 的人口腔鳞癌CAL-27细胞和CAL-27-CDDP耐药细胞株，胰酶消化计数， 用无血清培养基(hyclone的DMEM基础培养基的货号为sh30243.01B)洗 去细胞表面血清。每个小室种植10万个细胞，上层小室为含0.1％BSA的高 糖DMEM培养基(hyclone的DMEM基础培养基的货号为sh30243.01B，然 后加入0.1％BSA，配成上室细胞培养液)，下室为含10％FBS的DMEM完 全培养基。5％CO₂、37℃培养24小时。4％多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色 拍照，结果如图7和图8所示。从图7和图8中可以看出，CAL-27-CDDP 细胞较亲本细胞CAL-27的细胞运动性显著下降。

实施例3人口腔鳞癌CAL-27-HCPT耐药细胞株的筛选

以羟基喜树碱(HCPT)药物诱导筛选CAL-27细胞，建立CAL-27-CDDP 耐药细胞株，并检测耐药细胞的特性。

一、亲代细胞培养：操作同实施例1

二、亲代细胞IC₅₀的测定与IC₂₀的计算

药物：羟基喜树碱(HCPT)

用药剂量：同实施例1。

采用改良寇氏法计算出CAL-27细胞的IC₅₀浓度为0.101μg/ml，计算出 IC₂₀的浓度为0.01μg/ml，作为筛选的初始浓度。

三、人口腔鳞癌耐药细胞株的诱导

取生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞，胰酶消 化计数。在96孔板中种植8组细胞，每组3个重复，每孔加入细胞数为8000 个/100μl。次日待细胞贴壁后，配置8个药物浓度梯度(0μg/ml、0.02μg/ml、 0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml)的 培养基(培养基为含10％FBS的高糖DMEM完全培养基，添加药物至具体 的终浓度)，对应组别加入孔板中，药物作用48小时后，加入MTT孵育4 小时，三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解后OD_595nm检测读值。通过MTT法及改良寇氏法计算得出CAL-27细胞的IC₅₀浓度为 0.101μg/ml，采用IC₂₀的浓度0.01μg/ml作为筛选的初始浓度。在6cm细胞 培养皿中种植细胞，融合率达到40％。贴壁后加入羟基喜树碱作用，初始浓 度采用IC₂₀为0.75μg/ml，连续作用72小时。洗去死细胞，扩增存活的细胞。 (此处“洗去”指将含有死细胞的培养基用吸头洗弃，再洗取1ml PBS加入 培养皿中，轻轻晃动并拍打。等死细胞都飘离时，将PBS洗弃。“扩增”指 在存活的细胞量较少的情况下补充新鲜培养基，让细胞进行扩增生长，等到 细胞融合率达到80％时，进入下一个药物处理周期。)待细胞重新出于对数 生长期时，将细胞重复上述步骤，并将药物浓度提高一倍进行作用。在药物 浓度达到0.2μg/ml时，降低药物浓度增加倍数。待药物浓度加至0.4μg/ml 时，细胞生长良好，细胞对药物耐受增加。将细胞冻存3个月，复苏检测存 活率。其结果如表6所示：

表6

细胞类型 复苏存活率 CAL-27 90％ CAL-27-HCPT 80％

四、细胞传代的方法和过程

细胞传代的方法和过程同实施例1。

五、耐药细胞株的特性测试

1、多药耐药测定

取1ml生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞和 CAL-27-HCPT耐药细胞株，胰酶消化计数。在96孔板中种植8组细胞，每 组3个重复，每孔加入细胞数为8000个/100μl。次日待细胞贴壁后，配置6 种化疗药物，包括5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)、羟基喜树碱(HCPT)、 紫杉醇(TAX)、甲氨蝶呤(MTX)和奥沙利铂(L-OHP)，每种药物设置8 个药物浓度梯度(浓度梯度分别为5-Fu：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、 4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；CDDP：0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、 2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml；HCPT：0μg/ml、0.04μg/ml、 0.08μg/ml、0.16μg/ml、0.32μg/ml、0.64μg/ml、1.28μg/ml、2.56μg/ml；TAX： 0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml、1.6μg/ml、3.2μg/ml、6.4μg/ml、 12.8μg/ml；MTX：0μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml、4μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、 64μg/ml、128μg/ml；L-OHP：0μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、 125μg/ml、625μg/ml、1250μg/ml)的培养基，加入对应组别的孔板中，药 物作用48小时后，加入MTT孵育(放入37℃，CO₂培养箱孵育)4小时， 三联溶解液(10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl)溶解后OD_595nm检测读 值。

以MTT法测定耐药指数。结果如表7所示。CAL-27/HCPT细胞耐药指 数为33.208，与亲本细胞相比差异显著(P<0.01)，而且除对羟基喜树碱 (HCPT)有耐药性外，对5-氟尿嘧啶(5-Fu)和奥沙利铂(L-OHP)等也 有一定的交叉耐药。CAL-27-HCPT细胞株的增值较亲本细胞明显增加，但 是转移能力明显下降。

表7

**p<0.01，*p<0.05

2、细胞生长曲线和群体倍增时间

取生长状态良好，处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞和 CAL-27-HCPT耐药细胞株，胰酶消化计数。在96孔板中每孔种植细胞2000 个细胞。每组重复5次，连续培养5天，加入MTT，OD_595nm测定5天的细 胞的增殖情况，绘制细胞生长曲线，如图9所示。从细胞生长曲线可以看出 CAL-27-HCPT细胞较亲本细胞CAL-27增值促进。(p<0.01)

3、细胞形态观察

通过相差显微镜拍照系统观察细胞并取像，如图10所示。从图10可以 看出，CAL-27-HCPT细胞较亲本细胞CAL-27胞体增大，核仁增大，细胞 内颗粒增粗，与细胞增加表面积、排出毒性物质有关。

4、细胞运动性

通过Transwell检测细胞的运动性。取生长状态良好，处于对数生长期 的人口腔鳞癌CAL-27细胞CAL-27-HCPT耐药细胞株，胰酶消化计数，用 无血清培养基(hyclone的DMEM基础培养基的货号为sh30243.01B)洗去 细胞表面血清。每个小室种植10万个细胞，上层小室为含0.1％BSA的高糖 DMEM培养基(hyclone的DMEM基础培养基的货号为sh30243.01B，然后 加入0.1％BSA，配成上室细胞培养液)，下室为含10％FBS的DMEM完全 培养基。5％CO₂、37℃培养24小时。4％多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色拍 照，结果如图11和图12所示。从图11和图12中可以看出，CAL-27-HCPT 细胞较亲本细胞CAL-27的细胞运动性显著下降。