黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv的Indel标记及其应用

摘要

本发明“黄瓜抗西瓜花叶病毒病基因wmv的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜西瓜花叶病毒病(WMV)抗性基因wmv紧密连锁的Indel标记，其中所述标记的引物的核苷酸序列为：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R:AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG；所述Indel标记扩增的与黄瓜WMV感病基因WMV连锁的特征条带为173bp，核苷酸序列见Seq ID No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜WMV抗病基因wmv连锁的特征条带为169bp，核苷酸序列见Seq ID No.2所示；采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其是否对WMV具有抗性，该标记具有高效、限制少的优点，对选育抗WMV的黄瓜育种材料提高了效率，缩短了育种周期。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种黄瓜中抗西瓜花叶病毒基因wmv的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。 

背景技术

病毒病是影响黄瓜生产的主要病害之一，病原种类繁多，难以防治。其中西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)就是引起该病的一种主要病原。WMV属于马铃薯Y病毒属病毒，该病毒属世界各地均有分布。在自然界，主要以非持久性方式经蚜虫传播，也可以经汁液的机械接种传染，可侵染葫芦科、豆科、藜科等多种植物种类。感病植株叶片表现花叶、畸形、新生叶片扭曲，植株生长受阻，果实畸形。 

目前，在黄瓜上已经挖掘了一些抗WMV的种质资源，而且前人也利用了其中一些抗病材料对黄瓜WMV抗性遗传规律及分子标记进行了初步研究，Cohen等(1971)研究发现黄瓜栽培种Kyoto 3 Feet中存在抗WMV的显性基因；Wai(1995a)和Grumet(1995b)在TMG-1中发现WMV的抗性分两种基因控制：一种是在子叶和全株均表现抗性的wmv-2，另一种是只在真叶表现抗性的2个相互作用的上位基因wmv-3和wmv-4。张海英等(2005)以感病亲本自交系欧洲八号和抗病亲本自交系秋棚构建的RILs群体为材料，对WMV进行了抗病性鉴定，研究表明抗病性状是受隐性单基因控制的，但同时也存在微效基因的修饰。目前报道的与WMV抗性相关的遗传连锁标记有AFLP、RAPD、SSR标记，但是这些标记与抗病基因连锁距离较远，并不能有效地应用于实际育种工作中。 

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜中抗WMV基因wmv紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选对WMV抗病或感病的黄瓜种质资源上的应用。 

本发明的技术方案如下： 

一种与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记，其特征在于：所述标记的引物的核苷酸序列如下： 

wmvIndel3-F/wmvIndel3-R： 

AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG 

所述引物扩增的与黄瓜感西瓜花叶病毒基因WMV连锁的特征条带为173bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示； 

所述引物扩增的与黄瓜抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的特征条带为169bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。 

所述Indel标记在筛选具有抗西瓜花叶病毒基因wmv的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述标记的引物的核苷酸序列如下：wmvIndel3-F/wmvIndel3-R： 

AGGGTATCTTTGGATGTCAGAA/TGTGTTGTGTAGTGTAGGAAGG； 

(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测； 

(3)从检测结果中筛选出现与抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述抗西瓜花叶病毒基因wmv连锁的Indel标记特征条带为169bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。 

所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。 

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。 

所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。 

本发明以感WMV高代自交系65G与抗WMV高代自交系02245为亲本构建F₁、F₂群体及F_2:3家系，通过苗期人工接种鉴定和ELISA检测，对黄瓜WMV抗性基因wmv进行了遗传规律分析。以F₂群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现wmv基因在染色体上的遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记wmv-Indel3，与wmv的遗传距离为1.3cM。所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜WMV感病基因WMV连锁的特征条带为173bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜WMV抗病基因wmv连锁的特征条带为169bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。 

本发明通过利用54份不同遗传背景的黄瓜资源进行验证，结果表明wmv-Indel3验证的正确率为83.3％. 

本试验不仅为黄瓜抗WMV基因wmv的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗WMV基因的黄瓜新品种提供了高效途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定WMV抗性的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用所述Indel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条169bp条带，这种为隐型纯合材料(抗WMV)；另一种是169bp条带和173bp条带都出现，这种是显性杂合材料(感WMV)；第三种是仅仅出现173bp条带，这种为显性纯合材料(感WMV)。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行WMV抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。 

附图说明

图1.采用本发明所述的wmvIndel3标记的特异性引物验证54份不同遗传背景的黄瓜材料的电泳检测结果； 

黑体加粗字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。 

生物材料的来源和记载出处

本研究所用的试验材料为黄瓜高代自交系65G和02245。以65G为母本，02245为父本杂交，获得F₁，自交获得F₂群体及F_2:3家系。 

黄瓜高代自交系65G(P₁)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的欧洲温室型黄瓜雌性系，生长势强，连续座果多，瓜长20多厘米，表面光滑无刺瘤，无苦味，抗黑星病，感西瓜花叶病毒病(WMV)。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2006年在《园艺学报》第3期第690页上发表的文章《黄瓜新品种‘中农19号’》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。 

黄瓜高代自交系02245(P₂)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的露地耐热抗病自交系，华北型黄瓜，耐热性突出，分枝性强，腰瓜长约35厘米，刺瘤密，抗西瓜花叶病毒病(WMV)，抗霜霉病，白粉病，枯萎病。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2008年在《中国蔬菜》第6期第31-33页发表的文章《耐热黄瓜新品种中农106号的选育》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。 

54份不同遗传背景的黄瓜材料的具体来源和出处详见Zhang等于2010年在《Journal of the American Society for Horticultural Science》第135期第53-58页发表的文章《Genetic Mapping of the Scab Resistance Gene in Cucumber》。其中29份为抗性材料，25份为感病材料。 

重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文《A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity》 

Indel标记引物是本实验室基于两亲本重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件设计得到。 

主要试剂

SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(ICUGI)；PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix； 

凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。 

实施例1.与黄瓜抗WMV基因wmv连锁的wmvIndel3标记的获得 

步骤1.黄瓜WMV苗期抗性鉴定 

本试验以黄瓜高代自交系65G(感病)和02245(抗病)为母本和父本，自交获得F₁、F₂群体及F_2:3家系。2013年秋，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所病理课题组人工气候室对F₁及137个F_2:3家系进行WMV苗期人工摩擦接种，其中每个家系种植15株，待第一片真叶展平时，进行接种鉴定。 

待第一次接种20天后，进行调查，将病情划分为6个等级，分别为：0级，无症状；1级，心叶明脉或轻花叶；3级，心叶及中部叶片花叶；5级，心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩；7级，重花叶，多数叶片畸形、皱缩；9级，重花叶，叶片明显畸形，植株矮化，甚至死亡。同时为了检测接种植株中病毒的含量，在调查后，采用了酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法对黄瓜植株的心叶中的病毒含量进行检测。根据调查及ELISA检测结果判断植株对WMV是否有抗性，然后使用Microsoft Excel 2007及SAS9.2软件进行数据统计分析，判断分离比。 

结果显示：后代F₁均表现感病；由F_2:3家系鉴定结果，可推断在F₂群体中，感病植株有110株，抗病植株有27株。经卡方检测，符合3:1比例，表明在该群体中WMV抗性是受一对隐性基因控制。 

步骤2.DNA提取和分子标记分析 

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及群体各单株的基因组DNA。 

PCR反应体系为：总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物(50ng·μL^-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。 

引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al.，2009；Cavagnaro et al.，2010)。 

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。 

扩增产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1.5h，电泳后银染显色，统计带型。 

步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建 

共显性标记的统计方法：与母本(65G)一致的带型记为a，与父本(02245)一致的带型记为b，杂合的带型记为h。显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。 

结果显示： 

用1288对SSR引物对P₁(65G)和P₂(02245)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有296对，多态率23.0％。结合BSA法建池，进一步筛选得到了8个SSR多态性标记。 

利用筛选出的多态性标记对65G×02245组合的F₂群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果8个标记和目标性状(抗WMV)基因wmv被定位在同一连锁群上(LOD＝10)。 

将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Zhang et al.，2012)比较，发现本连锁群的8对标记均分布在第6染色体，据此将wmv基因定位在第6染色体上。 

步骤4.Indel标记开发及wmv连锁群分子标记加密 

针对初定位的染色体区段，结合黄瓜基因组序列和两亲本重测序的数据，利用primer 3.0软件在目标区段(约2.01M)共设计了130对SSR标记引物和20对Indel标记引物，对连锁群进行分析标记加密。用双亲筛选出有多态性的有8对标记。上群体后得到一个总长度 为19.0cM包含12个标记(初定位的其中4对+新设计的8对)的连锁群，获得与黄瓜抗WMV基因wmv连锁距离为1.3cM的Indel标记wmvIndel3。 

步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序 

(1)目的片段的回收 

采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。 

(2)目的片段的纯化 

用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。 

(3)目的片段与载体的连接 

反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。 

在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。 

(4)连接产物的转化 

1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化； 

2)感受态(50μL)+5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水； 

3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀； 

4)42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管； 

5)快速将管转移到冰浴器中，使细胞冷却3～5min； 

6)加入500μL LB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h； 

7)将菌液涂布到含有100μg·mL^-1Amp、25μg·mL^-1IPTG和40μg·mL^-1X-GAL的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收； 

8)倒置平板，37℃培养12～16h。 

(5)重组质粒的蓝白斑筛选 

经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。 

(6)菌落PCR的检测 

吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。 

(7)克隆后载体的测序与分析 

取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。 

其中wmvIndel3标记引物wmvIndel3-F/wmvIndel3-R扩增出的与黄瓜感WMV基因WMV连锁的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；与黄瓜抗WMV基因wmv连锁的特征片段的核苷酸序Seq ID No.2所示。 

实施例2.与黄瓜wmv基因连锁的wmvIndel3标记的验证 

用对实施例1获得的与wmv基因连锁的Indel标记wmvIndel3对54份不同遗传背景的黄瓜材料进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤2中的PCR扩增和检测方法。 

结果发现，在这54份材料中共有45个株系的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算准确率为83.3％，见图1。