棉花黄萎病菌致病相关蛋白及其编码基因VdPR3和应用

摘要

本发明涉及植物病理学和微生物基因工程领域，提供了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、黑色素积累、微菌核产生和纤维素酶活性中起重要作用的新基因VdPR3的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。具体而言，本发明公开了一种棉花黄萎病菌致病相关基因VdPR3。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，该基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR3可以用于降低棉花黄萎病菌的致病性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学和微生物基因工程领域，具体涉及棉花黄萎病菌致病相 关蛋白及其编码基因VdPR3和其应用。

背景技术

植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因素之一。随着病原菌对药物抗 性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大增加 了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。弄清植物病 原菌致病机制是开发新型药物和防病策略的关键。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的棉花黄萎病是一种世界性病害， 是世界各主要产棉国家和地区普遍发生和危害最严重的病害之一。自1935年由引进 美国斯字棉种而传入中国，并逐年传播扩散。20世纪90年代后，该病已经蔓延到包 括新疆在内的各个棉区，尤其是1993年该病在我国各棉区大面积流行，发病面积高 达267万hm²，造成损失皮棉1亿kg；之后又多次在我国包括新疆在内各主产棉区暴 发成灾，年发生面积300万hm²左右，年经济损失约12亿元人民币。

微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染菌源，在病害 循环中起重要作用，其形成的数量及存活情况直接影响黄萎病的发生为害程度。因 此，明确微菌核形成与萌发机制对于深入研究棉花黄萎病病害流行规律和制定防治 措施具重要意义。目前已经有VMK1、VDH1、VdGARP1、VdPKAC1和VGB等为数 不多的几个基因被鉴定对大丽轮枝菌的微菌核形成和发育产生重要影响。

细胞壁作为植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。大丽轮枝 菌在侵染寄主植物时产生各种细胞壁降解酶，如果胶酶、纤维素酶等，这些细胞壁 降解酶能降解寄主植物的细胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传 播和症状的扩展。研究表明，大丽轮枝菌菌株产生纤维素酶能力与侵染力呈显著正 相关，细胞壁降解酶在大丽轮枝菌致病中作为毒力因子而起作用。应用生物信息学 方法分析大丽轮枝菌VdLs.17基因组序列发现，含有大量的编码碳水化合物活性酶 类(Carbohydrate-activeen-zymes)如果胶酶、纤维素酶等，这可能是大丽轮枝菌能 够在广泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。

利用低致病力突变体中T-DNA插入位点侧翼序列和VdLs.17的基因组进行比 对，锚定插入位点并获取相关基因详细信息，免去了多次步移获取基因全长和上下 游序列的过程，可以快速构建敲除载体和互补载体，对致病相关基因进行功能分析。 深入研究棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机制，为控制黄萎病 的发生奠定了基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、黑 色素积累、微菌核产生和纤维素酶活性中起重要作用的新基因VdPR3，通过鉴定该 基因为防治棉花黄萎病害提供药物靶标。

为了解决上述技术问题，本发明提供了棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR3 (Pathogenicity Related Gene)，其来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)，该 基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，该基因的ORF序列具有SEQ ID NO:2所示的核 苷酸序列。

本发明同时提供了上述基因VdPR3编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQ  ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明的发明人通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突 变体库，获得了致病力减弱的突变菌株vdpr3。Southern杂交证实该突变菌株为 T-DNA单插入突变体。借助TAIL-PCR技术和VdLs.17的基因组数据库，获得了 T-DNA插入的侧翼序列，并从野生型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相关基因 VdPR3。

本发明通过构建VdPR3敲除载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入野生型菌 株Vd080，得到基因缺失突变体ΔVdPR3；在T-DNA插入突变体vdpr3中重新导入 VdPR3基因，获得互补突变体ΔVdPR3-C。

本发明对敲除突变体ΔVdPR3和互补突变体ΔVdPR3-C的菌落形态、生长速 率、胞外酶活性以及致病力进行测定，并和野生型的各项指标进行比较分析。结果 表明：敲除突变体ΔVdPR3微菌核和黑色素产量明显降低，在不同碳源(脱脂奶粉、 纤维素和淀粉)的培养基上生长速率也发生了变化，尤其在纤维素为唯一碳源的培 养基上降低了53％，致病力测定结果表明，敲除突变体ΔVdPR3的致病力也显著降 低，棉株的病情指数仅为野生型的50％。因此，确定VdPR3基因是棉花黄萎病菌致 病相关基因，关联微菌核的产生、黑色素的积累，对纤维素酶的活性起到促进作 用。而回补VdPR3基因的互补突变体的上述性状得到恢复，再次证实上述功能。

附图说明

图1：A：突变菌株vdpr3的southern杂交检测；B：VdPR3基因结构和T-DNA 插入位置示意图；

图2：互补突变体ΔVdPR3-C绿色荧光观察；

图3：VdPR3基因转录水平的测定，A：敲除突变体ΔVdPR3；B：互补突变体 ΔVdPR3-C；

图4：突变体菌株在PDA培养基上的菌落形态；

图5：突变体菌株在不同碳源(脱脂奶粉、纤维素、淀粉)培养基上生长示意图；

图6：敲除突变体ΔVdPR3致病力测定，A：受野生型Vd080与敲除突变株侵染 的棉花的表型；B：病情指数；C：野生型菌株侵染棉株的胚轴纵切观察；D：敲除 突变株侵染棉株的胚轴纵切观察(于接菌26d后拍摄)；

图7：互补突变体ΔVdPR3-C致病力测定，A：受野生型Vd080与互补突变株侵 染的棉花的表型；B：病情指数。

棉花黄萎病菌(Virticillium dahliae)菌株Vd080，于2012年3月15日保存于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.5904。

具体实施方式

实施例1：VdPR3基因的分离和克隆

通过对强致病力棉花黄萎病菌菌株Vd080(保藏号：CGMCC No.5904)的T-DNA 插入突变体库进行致病力测定，筛选获得了致病性显著降低的突变体vdpr3。 Southern杂交证实该突变体是T-DNA单拷贝插入，利用TAIL-PCR和VdLs.17基因 组数据库，获得致病相关基因VdPR3。

1.1Southern杂交确定突变体vdpr3T-DNA插入拷贝数

根据T-DNA上大小约为500bp的潮霉素片段序列设计Southern杂交探针引物 HygP-F/R。低致病力突变体vdpr3的基因组DNA 5ng，NEB buffer 10μL， BamHⅠ3μL，补水至100μL。37℃消化5h，之后，65℃水浴10min，终止酶切反 应。探针制备、DNA变性、转移、杂交及显色方法按照试剂盒说明书进行。

以T-DNA上的潮霉素区段做探针的Southern blot结果表明，探针在低致病力突 变体vdpr3基因组上只有一个杂交信号。说明T-DNA在突变体vdpr3中为单拷贝(图 1A)。

1.2TAIL-PCR技术获得VdPR3的基因信息

根据双元载体pCTHyg(建ATMT库所用)的T-DNA左臂(LB)和右臂(RB) 内侧DNA序列，利用NCBI中的Primer Blast在线工具分别设计3′和5′步移引物 R-SP1、R-SP2、R-SP3和L-SP1、L-SP2和L-SP3，Genome Walking试剂盒提供的简 并引物AP1、AP2、AP3和AP4，步移引物与随机引物成对作为模板扩增T-DNA左右 臂侧翼序列，引物序列见表1。所用反应程序及反应体系均按照Genome Walking试剂 盒的方法进行。反应结束后，取上述第一轮、第二轮、第三轮的反应产物于1％的 琼脂糖凝胶电泳上检测。分别回收3′端和5′端第三轮TAIL-PCR特异产物，克隆测 序。分别回收3′端和5′端第三轮TAIL-PCR特异产物，克隆测序。测序结果先与 T-DNA进行两两比对，随后和美国Broad研究所在线共享的大丽轮枝菌VdLs.17的基 因组数据库http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticil-lium_dahliae进行 比对分析，发现T-DNA插入到VdPR3基因起始密码子上游95bp的启动子中，并提取 致病相关基因VdPR3的基本信息。

1.3VdPR3基因的克隆

以野生型菌株Vd080的DNA为模板克隆基因全长并测序；利用BLAST软件在 NR数据库(non-redundant sequence database)上比对发现，除了与VDAG_09942 (VdLs.17)相似性99％，未发现其他氨基酸序列相似性在80％以上的基因。同时，在 野生型菌株Vd080的cDNA文库中克隆该基因的编码序列并测序(图1B)。DNA 序列见为SEQ ID NO:1，ORF序列见为SEQ ID NO:2。

实施例2：VdPR3基因敲除突变体的获得

2.1敲除载体的构建

根据VdPR3上游1.1kb序列设计引物P1和P3，从野生型菌株Vd080的基因 组中扩增获得目的片段，反应条件为:94℃2min；94℃60s，60℃60s，72℃1 min，循环30次；72℃10min。根据下游1.2kb序列，设计P4和P6引物，采用同 样的方法获得VdPR3下游。以质粒pUC-Hyg为模板，通过引物Hyg-F和Hyg-R扩 增获得 1.8kb的潮霉素抗性基因盒序列，延伸时间2min。P3和Hyg-F及P4和Hyg-R含 有反向互补的接头，进行PCR获得上游片段、潮霉素抗性基因盒和下游片段3片段 融合产物，反应条件为:94℃40s，60℃2min，72℃4min，循环20次。以3片段 产物为模板，采用含有Gateway BP反应接头的P2和P5巢式引物扩增已获得融合片 段，反应条件为:94℃30s，60℃40s，72℃4min，循环30次。融合片段通过 Gateway BP反应整合到pGKO2-Gateway载体并转化大肠杆菌Trans 1，筛选阳性克 隆并测序验证，获得敲除载体pKO-VdPR3，引物序列见表1。

2.2敲除突变体的获得

采用冻融法将敲除载体pKO-VdPR3转入农杆菌AGL-1，用于野生型菌株Vd080 的遗传转化，筛选敲除转化子时，在PDA筛选培养基(50μg/mL Cef，50μg/mL  Spe，50μg/mL Hyg和50μmol/L F2dU)上进行，25℃培养5d以上，直至转化子菌 落出现。用牙签挑取少量菌丝加入200ul无菌水中，制备孢子悬浮液，涂WA(Cef、 Spe、Hyg、F2dU)平板，25℃培养2d，用体式显微镜观察孢子萌发情况，挑选单个 萌发孢子于PDA平板(Cef、Spe、Hyg、F2dU)上，于25℃培养箱中培养5天，挑 取5mm菌饼于Czapek液体培养基中，25℃，150r/min振荡培养7d，收集菌丝并 提取基因组。以Vd080为阳性对照，根据VdPR3基因设计检测引物Test-F/R(扩增片 段大小约为550bp)，用Test-F/R引物进行PCR验证，敲除突变体没有出现550bp的 目的条带，用Hyg-F/R引物PCR扩增出1.8kb大小的潮霉素抗性基因，从而筛选出 敲除突变体ΔVdPR3，引物见序列表1。

实施例3：VdPR3基因互补突变体的获得

3.1互补载体的构建

根据野生型菌株Vd080中VdPR3基因序列(包括该基因的前端启动子区约 1.2kb、基因区762bp以及终止密码子后端约500bp的序列)，结合带有氯嘧磺隆抗 性的骨架双元载体载体pSULPH-gfp的多克隆位点，设计高特异引物HB-F/R，从野 生型菌株Vd080的基因组中扩增获得目的基因，连接于克隆载体pEASY-T1，通过 酶切位点EcoR I和AF1II分别正向插入pSULPH-gfp质粒中，转化大肠杆菌Trans 1，筛选阳性克隆并测序验证，获得互补载体pSUL-VdPR3，引物序列见表1。

3.2互补突变体的获得

互补载体pSUL-VdPR3的遗传转化基本步骤与敲除载体的转化相似，采用冻融 法将互补载体pSUL-VdPR3转入农杆菌AGL-1，用于T-DNA插入突变体vdpr3的遗 传转化，筛选互补转化子则在添加有50μg/mL Cef，50μg/mL Spe，50μg/mL Hyg 和50μg/mL Chl的PDA培养基上进行，25℃培养5d后转化子菌落出现。互补突变 体的筛选与敲除突变体的筛选类似，只是培养基中添入Cef、Spe、Hyg、Chl。根据 双元载体pSULPH-gfp中GFP基因设计引物GFP-F/R(扩增片段大小约为800bp)， 用HB-F/R、GFP-F/R引物对互补转化子的基因组DNA进行PCR验证，均得到了预 期大小的目的片段。因互补突变体可以表达绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下观察显 示3个互补突变体呈现明显的荧光(图2)，引物序列见表1。

实施例4：VdPR3基因表达量的测定

RNA提取：按照TIANDZ公司的柱式植物RNA提取试剂盒(柱式植物RNAout) 提取RNA，并用该公司的膜结合DNA清除剂试剂盒(Membrance-Bound DNA  Erasol)去除基因组DNA。cDNA的合成按Thermo公司反转录试剂盒(RevertAid First  Strand cDNA Synthesis Kit)说明书进行。根据靶标基因VdPR3的ORF序列设计引物 RT-F/R，以VdBt基因为内参，RT-PCR检测突变体中靶标基因的转录水平的变化。 结果表明：敲除突变体中VdPR3不表达(图3A)，而回补VdPR3的互补突变体中 VdPR3表达量接近野生型(图3B)。

表1 引物序列

注：下划线部分代表与Hyg-F/R或P3/P4反向互补的序列；波浪线部分代表Gateway BP反应的 接头序列attB1和attB2；虚线部分代表酶切位点

实施例5：突变体的生物学性状分析

5.1菌落形态观察

将突变体转接于PDA平板上，25℃恒温培养11天，观察发现与菌核型的野生 菌株Vd080和中间型的突变体vdpr3相比，敲除突变体为白色菌丝型，回补VdPR3 的互补突变体为菌核型(图4)，初步推测VdPR3基因与微菌核和黑色素的合成有 关。

5.2胞外酶活性的测定

取5μL浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液，置于不同碳源(脱脂奶粉、纤维 素、淀粉)培养基中，每个菌株3个重复，25℃恒温静置培养11天，记录菌落的生 长形态。并分别于3d、5d、7d、9d和11d采用十字交叉法测定菌落生长直径，计 算生长速率。以野生型Vd080菌株为对照，通过比较菌落周围透明圈的有无或大小 判断突变体菌株间胞外酶产生的差异。

在不同碳源(脱脂奶粉、纤维素、淀粉)培养基中，破坏掉VdPR3基因的敲除 突变体菌落中的微菌核和黑色素含量比野生型菌株Vd080明显减少，说明该基因在 微菌核形成过程中发挥重要作用。敲除突变体在以纤维素为唯一碳源的培养基上的 生长速率比野生型Vd080降低了53％，而回补VdPR3基因的互补突变体的生长速率 则明显回升，与野生型Vd080相比差异不显著(图5)。说明VdPR3基因参与控制 纤维素酶的活性。

实施例6：突变体的致病力测定

以陆地棉感病品种冀棉11为寄主，采用无底纸钵定量蘸根接种法，测定突变体 的致病力(朱荷琴，2011)。第一片真叶平展时接种，每钵接种10ml孢子浓度为 1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。将野生型棉花黄萎病菌菌株Vd080和T-DNA插入突变体 vdpr3作为对照，每个菌株设置3个重复，每个重复28-30株棉苗。接种后10d、 15d、22d和26d调查并计算棉株病情指数。

结果表明，野生型菌株Vd080接种仅7天后，棉花叶片开始出现萎蔫,黄化， 26天后出现了多数棉株死亡，病情指数高达55.62±4.0(P<0.01)，而3个缺失 VdPR3的敲除突变体对棉花的致病力明显减弱，在13天后才出现病叶，26天后的病 情指数为20.67±3.2～26.71±0.3(图6A和图6B)。野生型菌株侵染棉株的胚轴组 织多数出现了褐化的现象(图6C)，而ΔVdPR3敲除突变体侵染的棉株的维管束仅少 数出现褐化(图6D)，表明突变株ΔVdPR3系统侵染棉花的能力显著降低，回补 VdPR3的互补突变体的致病力得到明显恢复，侵染26天后，3个互补突变体的病情 指数为45.71±3.0～51.03±8.2，接近于野生型(图7A和图7B)，该结果进一步表 明，VdPR3是大丽轮枝菌的致病相关基因。